ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU_NUOI CAY TE BAO DONG VAT

Hiện nay, nhiều căn bệnh nguy hiểm xuất hiện ở người, đòi hỏi việc nghiên cứu tìm ra cách chữa bệnh là rất cần thiết nhưng các kết quả nghiên cứu trên động vật không phải lúc nào cũng được ứng dụng mở rộng cho con người. Vì vậy, nuôi cấy tế bào động vật để làm mô hình thử nghiệm là xu hướng được khuyến khích hiện nay. Việc lựa chọn những điều kiện thích hợp cho nuôi cấy mô tế bào động vật để thu kết quả tốt nhất đang được quan tâm và phát triển. Bên cạnh đó, nuôi cấy tế bào gốc cũng đang là công việc được cộng đồng xã hội và các nhà khoa học quan tâm đặc biệt. Vì những đặc tính hiếm có mà tế bào này sở hữu cũng như khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào khác nhau. Tế bào gốc trung mô (MSC) là một ví dụ điển hình. Các MSC này có khả năng biệt hóa thành tế bào sụn, xương, mỡ,…phục vụ cho nhiều nghiên cứu nhằm phục hồi các khiếm khuyết bẩm sinh hay mắc phải trên cơ thể con người. Các tế bào gốc trung mô được xác định đã xuất hiện ở nhiều loài, kể cả người. Những hiểu biết về MSC ngày càng tăng. Do vậy có thể khảng định rằng, MSC đã và sẽ có những ứng dụng to lớn trong liệu pháp gen cũng như nhiều công nghệ khác.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG ************************ NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI : NI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT GVHD: TRẦN HỒNG NGÂU SVTH: NHÓM Nguyễn Thị Trường An 2008120163 Bùi Thị Thu Ha 2008120155 Lê Thị Diểm Khanh 2008120182 Nguyễn Thị Phúc 2008120132 Nguyễn Thi Trúc Phương 2008120162 Đặng Thị Phương Thảo 2008120225 Tp HCM, 11/2014 MỤC LỤC Mục lục Lời mở đầu I TỔNG QUAN I.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy tế bao động vật I.2 Đặc điểm tế bao động vật I.3 Môi trường nuôi cấy I.4 Điều kiện hóa- lý ni cấy I.5 Các kiểu ni cấy tế bao động vật I.6 Các dụng cụ va thiết bị 10 II NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 13 II.1 Khái niệm 13 II.2 Lịch sử nghiên cứu 13 II.3 Nguồn thu nhận 14 II.4 Nuôi cấy tế bao gốc trung mô 14 II.5 Các đường biệt hóa 15 III.ỨNG DỤNG VÀ HẠN CHẾ CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 20 III.1 Ứng dụng 20 III.2 Hạn chế nuôi tế bao động vật 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 LỜI NÓI ĐẦU Hiện nay, nhiều bệnh nguy hiểm xuất hiện ở người, đòi hỏi việc nghiên cứu tìm cách chữa bệnh là rất cần thiết các kết quả nghiên cứu động vật không phải lúc nào cũng được ứng dụng mở rộng cho người Vì vậy, nuôi cấy tế bào động vật để làm mô hình thử nghiệm là xu hướng được khuyến khích hiện Việc lựa chọn những điều kiện thích hợp cho nuôi cấy mô tế bào động vật để thu kết quả tốt nhất được quan tâm và phát triển Bên cạnh đó, nuôi cấy tế bào gốc cũng là công việc được cộng đồng xã hội và các nhà khoa học quan tâm đặc biệt Vì những đặc tính hiếm có mà tế bào này sở hữu cũng khả biệt hóa thành các dòng tế bào khác Tế bào gốc trung mô (MSC) là một ví dụ điển hình Các MSC này có khả biệt hóa thành tế bào sụn, xương, mỡ,…phục vụ cho nhiều nghiên cứu nhằm phục hồi các khiếm khuyết bẩm sinh hay mắc phải thể người Các tế bào gốc trung mô được xác định đã xuất hiện ở nhiều loài, kể cả người Những hiểu biết về MSC ngày càng tăng Do vậy có thể khảng định rằng, MSC đã và sẽ có những ứng dụng to lớn liệu pháp gen cũng nhiều công nghệ khác Bài tiểu luận gồm có hai nội dung chính: Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào động vật Nuôi cấy tế bào gốc trung mô (MSC) Dù đã rất cố gắng bài thuyết trình của nhóm không tránh khỏi những thiếu sót mong nhận được sự đóng góp từ cô để bài thuyết trình của nhóm được hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn cô! NHÓM I TỔNG QUAN I.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Việc ni cấy mơ và tế bào động vật đã được tiến hành cách 100 năm nay, thông qua những nghiên cứu đầu tiên nhằm tìm hiểu một số vấn đề lĩnh vực Sinh học phát triển Năm 1912, Alexis Carrel thử nghiệm nuôi phôi bằng cách bổ sung chất dinh dưỡng vào môi trường và ông giữ được tim phôi gà đến tháng thứ ba Năm 1955 Harry Eagle’s khẳng định dịch chiết mô, dịch huyết và những chất dùng nuôi cấy có thể được thay thế bởi “một hỗn hợp các amino acid, vitamin, các cofactor, carbohydrate và muối, bổ sung với một lượng nhỏ protein huyết thanh”, điều này mở một thời kì mới nuôi cấy in vitro tế bào động vật Các dòng tế bào đầu tiên đã được thiết lập thành công, chúng trì ít nhất một phần đặc điểm, chức ban đầu như: các tế bào thượng thận và tế bào tuyến yên (Bounassisi và Cs, 1962), tế bào thần kinh (Augusti-Toco và Sato, 1969), tế bào (Yaff, 1968)… Sự phát triễn của kỹ thuật mô ngày càng tinh vi,hiện đại nhu cầu bức thiết của hai hướng nghiên cứu: tạo vaccine kháng vi rút và nghiên cứu về ung thư I.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Tính học yếu Tế bào động vật khơng có vách, kích thước khá lớn (khoảng 10µm), nên tính bền học yếu Do đó, tế bào động vật in vitro rất dễ vỡ bởi các lực tác động khuấy trộn để tách tế bào, thao tác…Trong trường hợp nuối cấy tế bào cần khuấy hay quay, thì tốc độ không vượt quá 100rpm Thời gian tiến hành các thao tác với tế bào động vật cũng nên cố gắng cho ngắn nhất, thời gian càng kéo dài, tế bào càng lỏng lẻo dễ vỡ Trong bảo quản và di chuyển các mẫu tế bào cũng cần thật nhẹ nhàng Tăng trưởng và phân chia chậm Thời gian tăng gấp đôi của tế bào điều kiện sinh lý là 20 – 40 giờ Hiệu suất sản sinh các chất có hoạt tính sinh học của tế bào động vật rất thấp và chậm Do đó cần có thời gian dài và khối lượng tế bào lớn, muốn sản xuất các chất có hoạt tính từ tế bào động vật Cơ chế kìm hãm ngược (negative feed-back) Cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ngoài môi trường của một chất nào đó, sẽ được thực hiện bởi chính sự gia tăng của chất đó môi trường Do đó, việc thay mới môi trường sau một thời gian nuôi cáy là rất cần thiết nhằm tránh hoạt động kìm hãm ngược của thể Trong phòng thí nghiệm, chế ức chế ngược còn có thể gây tổn thương tế bào, thậm chí làm chết tế bào hang loạt Tính chất cần giá đỡ Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ đễ sống và phân chia Thông thường tế bào tăng trưởng tốt gắn vào bề mặt rắn Tế bào sẽ ngừng phân chia đã hình thành lớp đơn liên tục bề mặt của dụng cụ nuôi cấy Tuy vậy, một số dòng tế bào tế bào ung thư, hoặc tế bào liên tục từ mô bình thường, sau được thuần hóa, có thể thuần hóa, có thể sinh trưởng và phân chia trạng thái lơ lửng, không cần bám vào nền Thay đổi kiểu gen và kiểu hình Các tế bào động vật có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình thông qua quá trình dung hợp hai tế bào có nhân khác nhau, tạo thành tế bào lai Có thể bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu Các dòng tế bào động vật có thể được bảo quản lạnh sâutrong nitơ lỏng (-197oC) suốt nhiều năm Khi được giải đông và hoạt hóa, tế bào được phục hồi khả tăng trưởng phân chia ban đầu Các đặc tính khác Ngoài các đặc tính trên, tế bào động vật còn có đặc điểm khác thích nghi với môi trường, nhạy cảm với ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone…để tăng trưởng và phân chia I.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp rất nhiều so với thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật hay thực vật, chúng là hỗn hợp các yếu tố dinh dưỡng và các chất khác Các công trình đầu tiên về nuôi cấy tế bào động vật thường dùng hỗn hợp dung dịch muối sinh lý, huyết và các chế phẩm phô gà làm môi trường Do thành phần của chúng phức tạp, khó ổn định, nên người ta quan tâm dần đến việc nghiên cứu, tạo các môi trường tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh và ổn định thành phần những lần ni cấy khác I.3.1 VAI TRỊ CỦA MÔI TRƯỜNG Chất dinh dưỡng giữ vai trò cần thiết nuôi cấy tế bào, chúng là nhân tố quyết định sự thất bại hay thành công của tế bào in vitro Hầu hết các thành phần khác của môi trường nuôi cấy có thể thay thế bằng các phương pháp đơn giản Trong đó các chất dinh dưỡng được thay thế bằng các hợp chất sinh học, thậm chí có phức tạp Các amino acid, acid béo , các ion, cofactor và các phân tử cần thiết để trì môi trường hóa học của tế bào giúp tế bào phân chia Sodium bicarbonate được sử dụng để trì pH và tạo áp suất thẩm thấu Một vài môi trường phổ biến nuôi cấy mô và tế bào động vật - Môi trường BM (Basal Medium): là môi trường bản H Eagle thiết lập, dùng phải bổ sung – 10% huyết và amino acid, vitamin Môi trường này thường sử dụng nuôi cấy tế bào Hela, tế bào L - Môi trường E’MEM (Eagle Minimum Essential Medium) còn gọi là môi trường tối thiểu, Eagle thiết lập Đây là môi trường BM có chứa amino acid, vitamin với nồng độ cao Cần bổ sung – 10% huyế nuôi cấy tế bào - Môi trường DMEM (Dulbecco-Modified Eagle Medium) là môi trường E’MEM Dulbecco cải tiến, với thành phần amino acid cao gấp hai lần và một số vitamin cao gấp bốn lần so với môi trường khác để nuôi được nhiều loại tế bào - Môi trường Iscove: N.N Iscove thiết lập nhờ cải biến môi trường DMEM - Môi trường 199: R.C Parker thiết lập dùng để nuôi cấy tế bào mô phôi gà sản xuất vaccine phòng bệnh bại liệt I.3.2 THÀNH PHẦN CỦA MƠI TRƯỜNG Muối vơ Ḿi vơ môi trường giúp cân bằng áp suất thẫm thấu tế bào, giúp cân bằng điện thế màng tế bào nhờ các ion Na+, K+, Ca2+ Đa phần các muối vô đều cần chất nền tế bào, với vai trò bám gắn và hoạt động các cofactor, đồng thời trì chế vận chuyển chất qua màng tế bào Hệ đệm Hầu hết các môi trường sử dụng hệ đệm bicarbonate với CO là thành phần chính Ngoài còn hệ đệm phosphate, hệ đệm hữu hay huyết Khi sử dụng bicarbonate làm hệ đệm chính môi trường thì sự tương tác của CO2 thu nhận từ các tế bào hay từ không khí với nước sẽ dẩn đến sự điều chỉnh pH môi trường theo cân bằng của phương trình: H2O + CO2 = H2CO3 = H+ + HCO3Sử dụng hệ đệm bicarbonate/CO2 cần trì không khí với – 10% CO tủ, hệ đệm này rẻ tiền, không độc với tế bào nên được sử dụng tương đối phổ biến Hệ đệm hữu được sử dụng nhiều nhất là HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2ethane sulfonic acid) Các đệm hữu không nhạy cảm với CO 2, có thể ổn định pH HEPES có khả trì pH từ 7,2 – 7,4 tương đối đắt và độc với một số tế bào ở nồng độ cao Hầu hết các môi trường thương mại chứa phenol red một chất thị pH Môi trường chuyển màu vàng cho biết pH giảm và màu đỏ cho biết pH tăng Carbohydrate Đường được sử dụng chính là glucose và galatose, một số môi trường còn sử dụng maltose hay fructose Nồng độ đường khác giữa các môi trường bản từ 1g/l -4,5g/l môi trường chứa nồng độ đường cao sẽ giúp phát triển nhiều kiểu tế bào Vitamin Vitamin là chất cho nhiều cofactor, chúng có nhiều thành phần của huyết Nhiều loại môi trường cần bổ sung vitamin thích hợp vì chúng cần thiết nuôi cấy tế bào động vật Đặc biệt vitamin B cần thiết cho sự phát triển tế bào, một số môi trường có nhiều vitamin A và E Thông thường vitamin được sử dụng môi trường là riboflavin, thiamine, biotin Protein va peptide Đây là thành phần quan trọng nuôi cấy tế bào, đặc biệt là với môi trường nuôi cấy không huyêt Một số protein, peptide rất cần thiết albumin, transferring, fibronectin và fetuin chúng có sẵn huyết thanh, vì vậy thuận lợi đối với loại môi trường được bổ sung huyết Acid béo va lipid Đây là các chất cần thiết cho môi trường nuôi cấy không huyết và cho một số tế bào đặc biệt chúng hiện diện huyết với các dạng chlolesterol và steroid Yếu tố vi lượng Bao gồm kẽm, đồng, selenium… và các tricarboxylic acid trung gian, đó selenium là chất giúp tách các gốc oxy tự Tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà ta bổ sung vào môi trường các yếu tố vi lượng thích hợp Huyết Vai trò của huyết thanh: - Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào các nguyên tố vi lượng, amino - acid thiết yếu Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân chia Kích thích sự phục hồi của các tế bào cấy chuyền, các protein huyết - gây bất hoạt trypsin, tránh các enzyme gây tổn thương tế bào Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng Chống oxy hóa: huyết kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tố của oxy Cải thiện tính bám dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi cấy I.4 ĐIỀU KIỆN LÝ – HÓA TRONG KỸ THUẬT NI CẤY TẾ BÀO Nhiệt độ Đa sớ các tế bào của người và động vật có vú được nuôi cấy ở nhiệt độ 37 oC quá trình nuôi cấy, tế bào động vật không chịu nhiệt độ cao 2oC so với nhiệt độ phát triển thích hợp của chúng Chỉ vài giờ sau tăng nhiệt độ, tế bào đã có thể chết Ở nhiệt độ 40oC, tế bào chết rất nhanh Tuy nhiên, tế bào lại có khả chịu đựng được nhiệt độ thấp nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng Ở 4oC, tế bào động vật có khả sống vài ngày, có thể cấp đông tế bào động vật ở nhiệt độ -196 oC mà không ảnh hưởng đến sự phát triển về sau Tế bào của những loài động vật khác có nhiệt độ nuôi cấy khác Ví dụ, tế bào của động vật có vú và người phát triển tốt ở nhiệt độ 37oC, tế bào của các loài chim phát triển tốt ở 38,5oC, tế bào của các loài côn trùng phát triển tốt ở nhiệt độ 25oC Để trì nhiệt độ nuôi cấy người ta thường sử dụng tủ ấm Nhìn chung các tủ ấm trì nhiệt độ bằng cách làm ấm và tuần hoàn khí nóng để đáp ứng với những thay đổi nhiệt và trả lại nhiệt độ nhanh chóng sau mở hay đóng cửa tủ Đối với các tủ ấm có bổ sung nước ở khay bên dưới sẽ trì độ ẩm cao pH Môi trường nuôi cấy có pH quá cao hoặc quá thấp sẽ ảhonh hưởng đến tế bào nuôi cấy pH không quan trọng việc trì sự cân bằng ion thích hợp mà còn trì chức tối ưu của các enzyme nội bào, cũng sự gắn kết của các hormone và nhân tố tăng trưởng lên các receptor bề mặt Sự biến đổ pH có thể làm thay đổi chuyển hóa tế bào, dẫn tới sự cảm ứng sản xuất protein shock nhiệt, một quá trình dẫn tới sự chết tế bào (apoptosis) Do vậy, kiểm soát pH là cần thiết để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Môi trường nuôi cấy của tế bào động vật đều được điều chỉnh ở pH 7,0 – 7,4 (trung bình 7,2) bởi hầu hết các tế bào sống môi trường có ngưỡng pH 6,5 – 7,8 Áp suất thẩm thấu Muối và glucose là hai tác nhân chính hình thành nên áp suất thẩm thấu, mặc dù các amino acid cũng rất quan trọng Thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào sẽ ảnh hưởng đến sự phát triển và chức của tế bào Khi áp suất thẩm thấu bên ngoài môi trường quá cao, nước từ tế bào ngoài làm tế bào co lại, ngược lại tế bào sẽ căng phồng áp suất bên ngoài quá thấp Nếu tế bào môi trường có áp suất thẩm thấu không phù hợp tế bào sẽ bị biến dạng Các môi trường thương mại được thiết kế áp suất thẩm thấu là 300 mOsm (tế bào phát triển tốt khoảng 290 – 310 sOsm) Cách tốt nhất để kiểm tra áp suất thẩm thấu là dùng Osmom kế (Osmometer) Có thể điều chỉnh áp suất thẩm thấu bằng cách thêm NaCl, cứ 0,0292g/lít NaCl sẽ làm tăng mOsm Các loại khí Ba loại khí cần quan tâm: CO2, O2, và N2 Tỷ lệ của chúng được phối trộn thích hợp theo các chương trình thiết kế sẵn của tủ nuôi, nhờ các phân áp khí được tạo thích hợp với đặc điểm sinh lý của tế bào và mơ sớng I.5 CÁC KIỂU NI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Nuôi cấy sơ cấp Là phương pháp sử dụng các tế bào sau được tách từ các mảnh mô và trước lần cấy chuyền đầu tiên Quy trình được tiến hành từ việc thu nhận các mảnh sinh phẩm, các mảnh mô sống Sau đó, các mảnh mô được xử lý sơ bộ để loại bỏ vi khuẩn, nấm cũng các thành phần không mong muốn khác Tiếp theo, chúng được tách để tạo huyền phù tế bào đơn trước nuôi cấy Nuôi cấy sơ cấp thường được sử dụng để khai thác các tế bào ban đầu những mảnh mô, nhằm tạo các dòng tế bào mới THU NHẬN MẪU MÔ Cắt nhỏ (chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt nhỏ phần mô chết) Cắt nhỏ (mảnh nhỏ để nuôi) Tách tế bào bằng học ( nghiền, ép) Nuôi mẫu mô sơ cấp Trypsin lạnh Tách tế bào bằng enzyme Trypsin ấm Collagenas e Nuôi cấy thứ cấp Ly tâm Được tiến hành sau tế bào được tạo dòng từ nuôi cấy sơ cấp Hầu hết các tế bào được bảo quản lạnh nên việc đầu tiên của quá trình ni cấy thứ cấp là giải đơng và NI SƠ CẤP phùchính cho nuôi cấy điều kiện thích hợp Các tế bào nuôi cấy thứ cấpTái là huyền đối tượng các nghiên cứu cũng ứng dụng của công nghệ tế bào động vật Thu nhận tế bào mới Cấy chùn 10 Ni mãnh mơ thứ cấp DỊNG TẾ BÀO Nuôi cấy huyền phù Thường được sử dụng để nuôi cấy tế bào thu nhận từ mẫu máu Đây là phương pháp nuôi cấy không gian ba chiều với kỹ thuật nhân sinh khối bằng fermenter, thông qua hệ thống bioreactor nhằm thu nhận một lượng lớn các tế bào mong muốn Nuôi cấy lớp đơn Đây là phương pháp để nuôi cấy các tế bào thu nhận từ các mô rắn phổi, thận, da, xương, cần nuôi phát triển thành lớp đơn Ngoài ra, một số dòng tế bào có thể biểu hiện trạng thái bán bám dính Khi đó dụng cụ nuôi sẽ xuất hiện hỗn hợp hai quần thể tế bào: các tế bào bám dính và các tế bào huyền phù I.6 CÁC DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ Dụng cụ nuôi cấy: hộp đĩa nuôi cấy đĩa 35 mm, đĩa 60 mm, bình Roux, … các dụng cụ nuôi cấy có thể được làm bằng thủy tinh hay bằng nhựa, được vô trùng sẵn và sử dụng một lần ( đối với dụng cụ được làm bằng vật liệu nhựa ) Đĩa ni cấy Bình Roux Các thiết bị phịng thí nghiệm: 11 Tủ cấy vô trùng là thiết bị phổ biến và quan trọng nuôi cấy tế bào động vật nhằm tạo không gian vô trùng, các sản phẩm và mẫu vật sẽ được bảo vệ thông qua hệ thống màng lọc HEPA ( Hight efficiency particulate air) Tủ cấy vô trùng Các thiết bị khảo sát và phân tích mẫu : tủ ấm CO2 , kính hiển vi, máy li tâm, máy đếm tế bào,… ngoài còn một số dụng cụ không thể thiếu phòng thí nghiệm : đũa thủy tinh, pipet, micro pipet, máy vortex,… Máy vortex Kính hiển vi 12 Nồi hấp khử trùng Tủ sấy Pasteur pipette Micropippette Máy ly tâm II NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ II.1 Khái niệm Tế bào gốc trung mô là một những tế bào gốc của thể, có khả làm mới và phân chia thời gian dài, và đặc biệt là có khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác Tế bào gốc trung mô có các đặc điểm khác biệt : có hình dạng giống các nguyên bào sợi ( hình que, hình thoi,…), có khả bám dính với giá thể nuôi cấy 13 Theo tác giả Phan Kim Ngọc, Công Nghệ Tế Bào Gốc, ( trang 174), tế bào gốc trung mô được định nghĩa sau : “ Trong thời kỳ phát triển phôi, những tế bào thuộc trung mô ( hay trung phôi bì) sẽ biệt hóa thành tất cả các tế bào của mô liên kết xương, sụn, chất nềm tủy xương, mô xơ ở khoảng giữa hai tổ chức, vân, những dầy gân,dây chằng cũng mô mỡ.” II.2 Lịch sử nghiên cứu Các tế bào tiền thân trung mô hiện diện tủy xương được nghiên cứu từ đầu thế kỷ XIX bởi nghiên cứu của Goujon ( 1869) Ông là người đầu tiên mô tả tiềm biệt hóa thành xương cấy ghép “lạc vị” ( sai chỗ) của tủy xương thỏ Năm 1960, Danis cho thấy tất cả tế bào tủy xương có thể biệt hóa thành xương Đồng thời khẳng định các tế bào tủy xương này không phải là những tế bào cảm ứng hay có khả hấp dẫn hóa học cho các tế bào xương Ngoài ra, còn rất nhiều các nghiên cứu về tế bào gốc trung mô và đạt được những thành tựu to lớn Ví dụ như: Năm 1978 Owen trình bày về khái niệm tế bào gốc cư trú tủy xương,… II.3 Nguồn thu nhận Để thu nhận tế bào gốc trung mô, chúng ta có thể tiến hành thu nhận nhiều nguồn khác Ta cũng có thể phân thành hai nhóm nguồn để thu nhận như: Lấy cuốn rốn, thai hay máu cuốn rốn của trẻ sơ sinh Ở người trưởng thành ta tiến hành thu nhận từ tủy xương, gan, phổi,… II.4 nuôi cấy tế bào gốc MSC Điều kiện nuôi cấy Giá thể nuôi cấy: có bề mặt phù hợp với tế bào bám dính và thấm được CO và O2, bề mặt bằng nhựa mỏng thích hợp cho việc quan sát dưới kính hiển vi quang học hoặc hoặc điện tử Pha khí là CO2 và O2 Độ sâu tối ưu của môi trường vào khoảng 2-5 mm ( 0,2 -0,5 ml/cm2) nuôi cấy tĩnh ( Đặng Thị Tùng Loan, 2007) pH từ 7,4 - 7,7 là tốt nhất cho việc nuôi cấy, phenol red được dùng chất thị pH ( màu đỏ ở pH 7,4; cam ở pH 7; vàng pH bằng 7,8) Nhiệt độ thích hợp là 37O C, 5% CO2 14 Môi trường nuôi cấy Hệ đệm thường được sử dụng nuôi cấy Bicarbonate, N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-ethane (HEPES), ( theo Đặng Thị Tùng Loan, 2007) Môi trường được sử dụng nuôi cấy tế bào gốc MSC thường là E’MEM và DMEM II.5 Các đường biệt hóa của tế bào gốc MSC Môi trường nuôi cấy chung của tế bào gốc MSC là nhau, môi trường bổ sung thêm thêm các yếu tố khác thì tế bào gốc MSC sẽ có những đường biệt hóa thành các dòng tế bào khác xương, sụn, máu, mỡ,… 15 II.5.1 Con đường biệt hóa thành tế bào xương Môi trường nuôi cấy bổ sung thêm các tác nhân biệt hóa : 1,25 (OH)2D3, βglycerophosphate,ascorbic acid, BMP-2, dexamethasone, valproic acid Các tế MSC sẽ biệt hóa theo dòng tế bào tạo xương Quy trình thu nhận và nuôi mẫu được tiến hành thông qua các bước sau: Bước 1: Thu nhận mẫu và nuôi tạo tế bào gốc MSC : tủy xương ( khoảng 2mL tủy xương + 300mL Hepanrin ) Ly tâm đẳng tỷ trọng + dd Ficoll –Paque thu tế bào đơn nhân tủy xương Nuôi mẫu Tế bào được nuôi chai Mật độ nuôi 105- 106 TB/ 5mL MT Môi trường nuôi cấy: 5mL môi trường DMEM (Gibco) + 15% FBS + ( Penecilin + Streptomycin) Điều kiện nuôi cấy Nuôi tủ ấm 37oC, 5% CO2 Chú ý: môi trường thay mới ngày/ lần Bước 2: biệt hóa tế bào gốc MSC thu được thành tế bao xương Ở lần cấy chuyền thứ 2, TB được đem biệt hóa thành nguyên bào xương bằng cách loại bỏ môi trường cũ Môi trường là DMEM: 15% FBS+ 10-7M Dexamethasone+ 10mM/ml b-Glycerol phosphate+ 50ng/ml Ascorbic acid+10ng/ml FGF9+ 10"7M vitamin D2 và pen/strep (1, 15) Nuôi tủ ấm 37oC, 5% CO2 16 Hình : quy trình thu nhận tế bào gốc MSC từ tủy xương Xác định dịng tế bao gốc trung mơ từ tủy xương sau nuôi cấy Sau nuôi cấy in vitro, tế bào được cố định bằng dung dịch và nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang với marker desmin và vimentin Kháng thể đơn dòng khángDesmin thu từ chuột (Sigma-Aldrich: D1033 clone DE-U-10) và kháng thể đơn dòng kháng-Vimentin thu từ chuột (Sigma-Aldrich: V5255 clone VIM-13.2) Biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương người thành nguyên bào xương Ở lần cấy chuyền thứ 2, tế bào được đem biệt hóa thành nguyên bào xương bằng cách loại bỏ môi trường cũ và thay bằng môi trường cảm ứng tạo nguyên bào xương gồm: IMDM, 15% FBS, 10-7M Dexamethasone, 10mM/ml b-Glycerol phosphate, 50ng/ml Ascorbic acid, 10ng/ml FGF9, 10"7M vitamin D2 và pen/strep (1, 15) Tế bào được nuôi tủ ấm ở 370C, 5%CO2 Thay môi trường mới ngày/ lần Xác định tế bao gốc trung mơ biệt hóa ngun bao xương Tế bào sau khoảng thời gian nuôi cấy từ 14 - 21 ngày, sẽ đánh giá khả biệt hóa thành nguyên bào xương bằng cách nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang với marker Osterix (M15: SC-22538, Santa Cruz Biotechnology inc) và RUNX2 (C-19:SC 17 8566, Santa Cruz Biotechnology inc) Ngoài ra, thực hiện phản ứng RT-PCR để đánh giá sự biểu hiện của marker Osteocalcin và Osteopontin đặc hiệu cho nguyên bào xương II.5.2 Con đường biệt hóa tế bào gốc MSC thành Sụn MSC có thể biệt hóa thành tế bào sụn giàn khung 3D, khả khử biệt hóa và chuyển biệt hóa hệ thống nuôi cấy 2D có phần không thuận lợi Các giàn polymere hóa: alginate, agarose, chitosan, polyethylene glycol diacrylate (PEGDA) hydrogel cũng được sử dụng môi trường 3D cho sự biệt hóa các tế bào MSC thành sụn Sự biệt hóa tế bào MSC thành sụn là một dấu hiệu quan trọng của việc tái sinh sụn sụn có khả tái sinh thấp bởi sự khan hiếm các tế bào tiền thân tao sụn thể người trưởng thành Hầu hết các tế bào sụn tế bào xương đều là các tế bào sụn trưởng thành thay vì là các tế bào tiền thân có khả tăng sinh nhanh và biệt hóa thành sụn Tuy nhiên, các tế bào có khả đạc biệt tế bào tiền thân này chưa được làm rõ Bằng cách li tâm, các MSC có đáy ống li tâm, chẳng hạn 250000 đến 1,5 triệu tế bào và sử dụng môi trường không huyết kết hợp với các nhân tố tăng trưởng, hMSC sẽ biệt hóa thành các dòng tế bào sụn Môi trường biệt hóa sụn thường là DMEM, có nồng độ glucose cao ngược với môi trường cho tăng sinh hMSC Ở một số công thức, các nhân tố hoạt hóa sinh học chọn lọc được thêm vào như: L-proline tại 40 µg/ml, ITS (insulin, transferring và sodiumselenite) ở nồng dộ dung dịch 1X và sodium pyruvate 100 µg/ml Dexamethasone nờng đợ 100 mM và L-ascobic acid 2phosphate (AsAP) nờng đợ 50 µg/ml Quy trình ni cấy  Môi trường: 95% EMDM high glucose 1% 1X ITS + solution, 1% kháng sinh, 100 µg/ml sodium pyruvate, 50 µg/ml L-ascobic acid 2- phosphate (AsAP), 40 µg/ml L- proline, 0,1µM dexamethasone, 10 ng/ml TGF-β3  Thao tác Ly tâm 2,5.105 tế bào hMSC ống 15ml, tiến hành ly tâm tốc độ 500g/ phút ở nhiệt độ 40C 18 Thu dịch ly tâm, tiến hành nuôi cấy, thay môi trường lần một tuần Thời gian nuôi cấy thường lớn hoặc bằng 14 ngày Tiến hành nuôi cấy tủ ấm ở 37oC, 5% CO2 Phương pháp đánh giá sự biệt hóa thành sụn của tế bào MSC Sử dụng thuốc nhuộm mô là cách tiện lợi để quan sát sự biệt hóa thành sụn của tế bào MSC Thuốc nhuộm là tác nhân nhạy cảm với proteoglycan và glycosaminoglycan sulfate Các thuốc nhuộm này đã được sử dụng để đánh dấu sụn khớp và sự phát triển của đĩa sụn, đó chúng là Market đáng tin cậy cho sự biệt hóa sụn Ngoài ra, việc phân tích cấu trúc mô sụn cũng rất cần thiết để xá định sự tạo mô sụn có cấu trúc vi mô và vĩ mô giống các mô sụn gốc của thể II.5.3 Con đường biệt hóa thành mô mỡ của tế bào MSC Sự biệt hóa tạo mỡ của các MSC có một số điểm quan trọng Trước hết, sự biệt hóa của MSC thành tế bào xương và mỡ được điều hòa tế nhị và cân bằng Thứ hai, những kiến thức hiểu biết về bệnh béo phì dường được cải thiện nhờ sự hiểu biết về sự điều hòa di truyền của quá trình biệt hóa tạo mỡ từ MSC Thứ ba, mô mỡ là cấu trúc quan trọng để phục hồi những giải phẫu trị liệu, tái cấu trúc thẫm mĩ Khi môi trường nuôi cấy bổ sung thêm các tác nhân biệt hóa : Dexamethasonc (0,5µM), Indomethacin ( 50-100µM), MSC ni cấy lớp đơn sẽ biệt hóa tạo mỡ Insulin là một phần quan trọng khác, thường được bổ sung vào môi trường biệt hóa tạo mỡ Quy trình biệt hóa tạo mơ: Mơi trường biệt hóa: 89% DMEM low glucose, 10% FBS, 1% kháng sinh; 0,5µM dexamethasone; 0,5µM IBMX, 100 µM Indomethacin Cách thực hiện − − − − Trải ở mật độ 20000 tế bào /cm2, hay 80% mật độ nuôi cấy lớp đơn Tiếp tục nuôi cấy môi trường tạo mỡ đến 28 ngày Lipit có thể nhìn thấy rõ vào ngày thứ 7, bàng kính hiển vi đảo ngược đối pha Nuôi cấy lớp đơn có thể tiến hành kiểm tra bằng nhuộm mô, sau cố định hay phân tích sinh hóa định lượng bằng cách xử lí với Triton- X100 1% để phá vỡ tế bào Phương pháp đánh giá quá trình biệt hóa thành mô mỡ của tế bào MSC Một những nhân tố phiên mã quan trọng cho quá trình biệt hóa MSC thành mỡ là Receptor hoạt hóa Peroxisome (PPAR2), được phát hiện nhờ RT-PCR 19 Nhuộm Oil red là phương pháp phổ biến và tiện dụng cho tế bào mỡ Cố định nuôi cấy tế bào với formalin 10%, các không bào chứa lipid được tổng hợp bên tế bào sẽ gắn thuốc nhuộm Oil Red tạo màu đỏ Hình: Tế bào mỡ được biệt hóa từ tế bào MSC III ỨNG DỤNG VÀ HẠN CHẾ CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT III.1 Ứng dụng Công nghệ nuôi cấy tế bào động vật phát triển đã tạo nhiều bước ngoặc lớn tạo tiền đề phục vụ cho các ngành khoa học đặc biệt là ngành y học, với các sản phẩm thiết yếu : Sản xuất vacin virus : vacin chống bại liệt, viêm gan virus B, chống sán lá ở động vật, chống bệnh quai bị, bệnh dại,… Sản xuất các Protein : Interferon, kháng thể và các hormone trị liệu Các Protein trị liệu này có giá thành cao hiệu quả trị liệu rất tốt vì chúng được tạo gần điều kiện tự nhiên của tế bào nên được trì sản xuất Sản xuất các protein tái tổ hợp bằng chuyển gen tPA, các nhân tố máu VIII và IX, erythropoietine,… Các chế phẩm miễn dịch chủ yếu là các kháng thể đơn dòng dùng để chuẩn đoán bệnh và dùng nghiên cứu Tạo các Hormone hormone tăng trưởng ở người, prolactin được sản xuất bằng nuôi tế bào 20 Sản xuất vi rút diệt côn trùng bằng cách nuôi tế bào côn trùng và cho nhiễm virus vvaf tiến hành thu chế phẩm Đặc biệt là nuôi các tế bào gốc để dùng liệu pháp tế bào Ứng dụng tế bao gốc trung mô Liệu pháp dựa vào tế bào gốc trung mô được tiến hành cho việc phục hồi các khiếm khuyết chấn thương, bệnh nãm tính, những dị thường bẩm sinh và cắt bỏ khối u Một số ứng nổi bật hiện như: Sử dụng các sản phẩm nuôi cấy tế bào MSC để tiến hành cấy ghép, sữa chữa các hệ quan bị tổn thương cần được thay thế ví dụ : cấy ghép da, xương, cơ, gân,… và phục hồi hệ thần kinh III.2 Hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật Hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật Mặc dù tiềm ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, việc nuôi cấy một số lượng lớn tế bào động vật thường gặp các khó khăn sau: - Các tế bào động vật có kích thước lớn và cấu trúc phức tạp các tế bào vi sinh vật - Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật Vì thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc trì điều kiện nuôi cấy vô trùng một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn - Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng nhiều so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và vỡ - Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết máu rất đắt tiền - Tế bào động vật là một phần của mô đã được tổ chức (phân hóa) là một thể đơn bào riêng biệt vi sinh vật 21 - Hầu hết các tế bào động vật sinh trưởng được gắn một bề mặt 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phạm Thành Hổ, 2005, Nhập Môn Công Nghệ Sinh Học, NXB Giáo Dục Phan Kim Ngọc, 2009, Công Nghệ Tế Bào Gốc, NXB Giáo Dục Internet http://www.mekostem.com/vn/tin-tuc/Su-Dung-Te-Bao-Goc-Trung-Mo-TuyXuong-Va-Te-Bao-Don-Nhan-Tu-Tuy-Xuong-De-Dieu-Tri-Thieu-Mau-Cuc-BoVa-Loet-O-Chan-Do-Benh-Tieu-Duong.html http://www.thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/nuoi-cay-va-biet-hoa-te-bao-goctrung-mo-tuy-xuong-nguoi-thanh-nguyen-bao-xuong-tren-gia-the-san-ho-invitro/5108.yhoc http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh-vat-hoc/sinhhoc/25506_tao-xuong-ham-tu-te-bao-goc.aspx http://www.thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/cong-nghe-sinh-hoc/5298nuoi-cay-te-bao-dong-vat.html#ixzz3Hob4WG00 23 ... Ngọc, 2009, Công Nghệ Tế Bào Gốc, NXB Giáo Dục Internet http://www.mekostem.com/vn/tin-tuc/Su-Dung -Te- Bao- Goc-Trung-Mo-TuyXuong-Va -Te- Bao- Don-Nhan-Tu-Tuy-Xuong-De-Dieu-Tri-Thieu-Mau-Cuc-BoVa-Loet-O-Chan-Do-Benh-Tieu-Duong.html... http://www.thuvienykhoa.vn/chi-tiet-tai-lieu/nuoi -cay- va-biet-hoa -te- bao- goctrung-mo-tuy-xuong-nguoi-thanh-nguyen -bao- xuong-tren-gia-the-san-ho-invitro/5108.yhoc http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh -vat- hoc/sinhhoc/25506_tao-xuong-ham-tu -te- bao- goc.aspx... http://www.khoahoc.com.vn/khampha/sinh -vat- hoc/sinhhoc/25506_tao-xuong-ham-tu -te- bao- goc.aspx http://www.thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/cong-nghe-sinh-hoc/5298nuoi -cay- te- bao- dong- vat. html#ixzz3Hob4WG00 23