Ánh sáng hấp thụ đóng vai trò quan trọng trong tạo hình cây nuôi cấy in vitro. Ánh sáng đỏ và xanh của quang phổ trông thấy ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro. Ánh sáng xanh lơ hoặc tím kích thích việc tạo chồi, ánh sáng đỏ cảm ứng việc sinh tạo rễ. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng khoảng 1000lux. Trong giai đoạn chuẩn bị cây in vitro trước khi đem trồng ngoài vườn ươm, cần cường độ ánh sáng tăng khoảng từ 3000 lux đến 10000 lux.
Bộ Công Thương Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TPHCM Khoa Công nghệ Sinh học & KTMT Bộ môn Nhập mơn Cơng nghệ Sinh học Tên đề tài: NI CẤY MƠ THỰC VẬT GVHD: ThS Trần Hồng Ngâu SVTH: Nhóm 09 TPHCM, Tháng 10 năm 2014 Mục lụ Ni cấy mô thực vật - Cây Hông Mục lục BẢNG PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ .4 Nuôi cấy mô thực vât .5 I Tổng quan Lịch sử hình thành phát triển công nghệ nuôi cấy mô thực vật Khái niệm nuôi cấy mô thực vật 2.1 Nhân giống vơ tính .5 2.2 Vi nhân giống Yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật 3.1 Điều kiện nuôi cấy 3.1.1 Nhiệt độ 3.1.2 Độ ẩm 3.1.3 Ánh sáng 3.1.4 Đất 3.2 Môi trường nuôi cấy .7 3.3 Dụng cụ thiết bị 3.4 Nguồn nuôi cấy mô thực vật: .8 Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật .8 4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: 4.2 Nuôi cấy mô sẹo 4.3 Nuôi cấy tế bào đơn 4.4 Nuôi cấy protoplast-chuyển gen 4.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội II Ý nghĩa công nghệ nuôi cấy mô thực vật Về mặt lý luận sinh học Về mặt thực tiễn 10 2.1 Nhân giống trồng 10 SVTH nhóm Ni cấy mơ thực vật - Cây Hông 2.2 Chọn tạo giống 10 2.3 Trong lĩnh vực khác 10 III Quy trình ni cấy Hơng .10 Giới thiệu hông 11 Phương pháp nhân giống phòng thí nghiệm 12 2.1 Vật liệu phương pháp tiến hành 13 2.3.1 Vật liệu 13 2.3.2 Phương pháp .13 2.2 Quy trình nhân giống Hơng 14 Kết 16 IV Kết luận công nghệ nuôi cấy mô thực vật 17 Ưu điểm hạn chế công nghệ nuôi cấy mô thực vật .17 Tình hình phát triển 18 Đề xuất 18 Tài liệu tham khảo .23 SVTH nhóm Ni cấy mơ thực vật - Cây Hơng BẢNG PHÂN CƠNG NHIỆM VỤ MỨC ĐỘ HỢP TÁC HỌ VÀ TÊN MSSV PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC Trần Hoài Tâm 2008120179 Phần I4, II3.4.5 Tốt Nguyễn Lê Hoài Nhân 2008120086 Tổng hợp word Tốt 2008130033 Phần I, I1,I2 Tốt Nguyễn Lê Trâm Anh 2008130007 Phần II2.4.1.2.3, Tốt Trần Thị Diệu Hiền 2008120001 Phần IV.1,2 Tốt Nguyễn Hiếu Thuyên 2008130022 Phần I3 Tốt Trần Thị Kim Chỉ 2008130014 Phần III2.4.4.5, III3 Tốt Phạm Thị Phi Yến 2008130281 Phần III1.2.3 Tốt Nguyễn Văn Lâm CHỮ KÝ Nuôi cấy mơ thực vât I Tổng quan Lịch sử hình thành phát triển công nghệ nuôi cấy mô thực vật - 1902: Haberlandt đưa ý kiến cấy mơ sinh vật ngồi thể đưa vào ống nghiệm (in vitro) - 1919: Mô động vật cấy A.Carrel - 1934: White phát sống vô hạn việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua - 1964: Ball người tìm mầm rể từ việc ni cấy chồi - 1951: Skoog Miller phát hợp chất điều khiển nhân chồi SVTH nhóm Ni cấy mơ thực vật - Cây Hông - 1962: Murashige Skoog cải tiến môi trường nuôi cấy sử dụng rộng rãi ngày - 1960 – 1964: Morel cho nhân giống vơ tính lan ni cấy đỉnh sinh trưởng Khái niệm nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật kĩ thuật nuôi cấy tế bào thực vật, hay mô phân sinh bệnh mơi trường nhân tạo thích hợp để tạo khối tế bào hay hồn chỉnh ống nghiệm 2.1 Nhân giống vơ tính Sinh sản vơ tính tự nhiên: Trong tự nhiên, thực vật có khả tạo thể từ phận thân bị (Sinh sản vơ dâu tây, rau má), thân rễ (cỏ gấu), thân củ (khoai tây), (thuốc bỏng), rễ củ (khoai lang) Sinh sản vơ tính nhân tạo: sinh sản, người chủ động nhân lên tạo thể từ phận cắt rời thể bố mẹ Các dạng sinh sản vô tính nhân tạo gồm: giâm (cành, lá, rễ), chiết (cành), ghép (cành, chồi), nuôi cấy mô tế bào Sau số hình thức nhân giống vơ tính nhân tạo: Chiết: hình thức tạo rễ đoạn cành cịn gắn với cây, sau cắt rời cành có rễ để nguyên vẹn Ghép: chuyển quan mô thực vật, động vật người Ở thực vật ghép kỹ thuật quan trọng nghề làm vườn, phần (cành ghép) cá thể đem phối hợp (ghép nối, ghép nêm, ghép vỏ gần gốc) với phần khác (gốc ghép) lồi khác lồi Sau thời gian chỗ ghép liền lại gốc ghép nuôi cành ghép lớn lên thành cá thể mang đặc tính chung hai cá thể gốc ghép cành ghép SVTH nhóm Nuôi cấy mô thực vật - Cây Hông Giâm: việc cắt đoạn thân cành mẹ cắm vùi xuống cát đất pha cát để mọc rễ đâm chồi thành Đây phương pháp trồng chủ yếu sắn, mía, dâu tằm, rau muống, khoai lang,… Nuôi cấy mô tế bào:là kĩ thuật cấy nuôi mô, tế bào động - thực vật môi trường nhân tạo ống nghiệm bình thuỷ tinh 2.2 Vi nhân giống Nhân giống in vitro (invitro propagation) hay gọi vi nhân giống (micropropagation) việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật điều kiện vô trùng ống Một số sản phẩm: Hình 2:Cây sứa-Dallbergia tonkinensis Hình 3:Hoa cát tường-Eustoma grandiflorum sp Yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô thực vật Điều kiện ni cấy 3.1.1 Nhiệt độ Trong q trình tiến hành tối ưu hóa nhiệt độ cho giai đoạn sinh trưởng Nhiệt độ chung thường điều chỉnh 22±2 0C Trong đó,nhiệt độ 200C ±10C dành cho ôn đới, nhiệt dộ 250C ±10C dành cho nhiệt đới .1.2 SVTH nhóm Độ ẩm Ni cấy mô thực vật - Cây Hông Độ ẩm tương đối bình chứa kiểm sốt phương tiện khác thơng khí, làm lạnh đáy, nồng độ agar .1.3 Ánh sáng Ánh sáng hấp thụ đóng vai trị quan trọng tạo hình nuôi cấy in vitro Ánh sáng đỏ xanh quang phổ trông thấy ảnh hưởng đến việc nuôi cấy in vitro Ánh sáng xanh lơ tím kích thích việc tạo chồi, ánh sáng đỏ cảm ứng việc sinh tạo rễ Việc nuôi cấy in vitro tốt điều kiện ánh sáng khoảng 1000lux Trong giai đoạn chuẩn bị in vitro trước đem trồng vườn ươm, cần cường độ ánh sáng tăng khoảng từ 3000 lux đến 10000 lux .1.4 Đất Môi trường để cấy con,cần ý điều kiện pH đất, độ giữ ẩm, độ thống khí dinh dưỡng cần ý .2 Môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường thay đổi tuỳ theo lồi phận ni cấy Đối với mẫu cấy tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần mơi trường thay đổi Mơi trường cịn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa mẫu cấy Tuy nhiên, tất môi trường nuôi cấy bao gồm năm thành phần: Khoáng đa lượng: N, P, K, Mg, S, Ca, với hàm lượng thường lớn 30mg/l có vai trị tạo mơ tế bào xây dựng thành phần cấu trúc Khoáng vi lượng: Fe, Mo, Mn, B, I, Co, Zn,…với hàm lượng nguyên tố nhỏ 30mg/l Chúng thành phần coenzyme để xúc tác phản ứng sinh hóa diễn tế bào Vitamin: vitamin dễ hòa tan nước B1, B2, B3, B5, B6,… với hàm lượng từ đến vài mg/l Chúng thành phần coenzyme tham gia vào xúc tác phản ứng sinh hóa Đường (nguồn carbon): thường đường mía saccaroza với nồng độ 2030g/l(một số trường hợp sử dụng đường maltoza, glucoza, lactoza,…) SVTH nhóm Ni cấy mơ thực vật - Cây Hơng Các chất điều hịa sinh trưởng thực vật: Auxin, Cytokinin, Giberilin, giúp điều khiển q trình phân hóa phản phân hóa tế bào thể tính tồn tế bào môi trường nuôi cấy tế bào .3 Dụng cụ thiết bị Dụng cụ: Bình tam giác (250 mL), Ống nghiệm, Nắp đậy, Giấy cấy vô trùng, Ống đong thủy tinh, Bécher (cốc đốt thuỷ tinh) 500 mL, 1000 mL; Forceps (kẹp), dao cấy, đèn cồn, Đĩa petri vô trùng, Thiết bị: Autoclave, Tủ sấy, Tủ cấy (laminar), Tủ lạnh, Máy điều hòa nhiệt độ, Máy lắc nằm ngang, Tử ấm, Hệ thống đèn chiếu, Tủ sấy 60-200 0C, Cân kỹ thuật, cân phân tích, Máy cất nước lần, lần; Máy khuấy từ, pH kế; Máy kỹ thuật số; Kính hiển vi mắt (độ phóng đại 1000 lần), Kính lúp mắt (độ phóng đại 75 lần), Nguồn ni cấy mơ thực vật: Có thể dùng lá, thân, rễ hay chồi, để tiến hành nuôi cấy mô thực vật Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật 4.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng: gồm nuôi cấy chồi đỉnh chồi bên Sau vô trùng, mẫu nuôi cấy mơi trường thích hợp chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khống vơ hữu mơi trường khống có bổ sung chất kích thích sinh trưởng Từ đỉnh sinh trưởng, sau khoảng thời gian nuôi cấy định mẫu phát triển thành hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triển vươn thân, rễ để trở thành hoàn chỉnh Cây chuyển đất dần thích nghi phát triển bình thường 4.2 Ni cấy mơ sẹo Mơ sẹo khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành phản phân hóa tế bào phân hóa, đặc biệt mơi trường có auxin Khối mơ sẹo có khả tái sinh thành hồn chỉnh mơi trường khơng có chất kích thích tạo mơ sẹo Ni cấy mơ sẹo thực cho lồi thực vật khơng có khả nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 4.3 SVTH nhóm Ni cấy tế bào đơn Nuôi cấy mô thực vật - Cây Hông Tế bào đơn tách từ khối mô sẹo nuôi cấy môi trường lỏng đặt máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp Sau đó, tế bào đơn lọc nuôi cấy môi trường đặc biệt để tăng sinh khối 4.4 Nuôi cấy protoplast-chuyển gen Protoplast (tế bào trần) tế bào đơn tách lớp vỏ cellolose, có sức sống trì đầy đủ chức sẵn có Trong điều kiện ni cấy thích hợp, protoplast có khả tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia tái sinh thành hồn chỉnh (tính tồn thể thực vật) 4.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội Hạt phấn ni cấy mơi trường thích hợp tạo thành mô sẹo Mô sẹp tái sinh thành hoàn chỉnh đơn bội II Ý nghĩa công nghệ nuôi cấy mô thực vật Về mặt lý luận sinh học Tìm hiểu sâu sắc chất sống So sánh đặc tính thể với hợp phần chúng tách rời khỏi thể qui luật mối tương quan phận Phân biệt giai đoạn cách cụ thể xác theo chu kỳ phát triển cá thể tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu qui luật sinh trưởng, phát triển, quan hệ chúng với môi trường…và chủ động điều khiển phát triển trồng theo ý muốn Biết nguyên nhân gây bệnh đưa biện pháp phòng bệnh cho trồng Về mặt thực tiễn Kỹ thuật nhân giống in vitro ưu việt phương pháp khác: Sử dụng mô nuôi cấy nhỏ Có thể nhân giống trồng quy mơ cơng nghiệp Có hệ số nhân giống cao cá thể đồng mặt di truyền Nuôi cấy tế bào thực vật ngành khoa học trẻ đóng góp nhiều thành tựu to lớn lĩnh vực chọn tạo giống, nghiên cứu tính di truyền – chế sinh SVTH nhóm 9 Ni cấy mơ thực vật - Cây Hông tổng hợp thực vật, Hàng loạt trồng có phẩm chất tốt, suất cao đời, như: mía, lúa, cà phê, khoai tây, phong lan, 2.1 Nhân giống trồng Ni cấy mơ giống khó nhân giống hữu tính phong lan hồ điệp, mật nhân, ba kích, giúp lưu trữ nguồn gen thực vật quý Phục tráng giống: nhằm hồi phục bị nhiễm virut, tạo bệnh, nâng cao suất góp phần cải tiến chất lượng hoạt chất sinh học Nhân nhanh giống với số lượng lớn thời gian ngắn 2.2 Chọn tạo giống Tạo nguồn nguyên liệu ban đầu tái sinh, góp phần tạo sản phẩm Tạo thể biến dị soma, làm phong phú thêm nguồn gen thực vật Nuôi cấy đơn bội 2.3 Trong lĩnh vực khác Nuôi cấy thực vật thu nhận hợp chất thứ cấp có giá trị như: diosgenin, codein, Scopolamine, Saponin, dùng làm dược liệu hay phụ gia thực phẩm, Mơ hình nghiên cứu nhằm tìm giống có tính chống chịu tốt với mơi trường (phèn, mặn, úng, hạn, ) hay sâu bệnh (thối rễ, chảy mủ gốc, ) giúp sinh trưởng tốt nhiều loại đất Tạo dòng bệnh (loại virut, vi khuẩn, ) từ mẹ nhiễm bệnh Tạo dòng hoàn toàn đồng mặt di truyền III Quy trình ni cấy Hơng Giới thiệu hơng Phân loại: - Tên khoa học: Paulownia SVTH nhóm 10 Nuôi cấy mô thực vật - Cây Hông - Họ: Scrophulariaceae - Bộ: Scophulariales - Lớp: Magnoliospida - Ngành: Angiospermae Đặc điểm: Hình thái: Thuộc loại gỗ, cao 20-30m, đường kính 30-50cm Vỏ thân trắng xám xám vàng, khơng có lơng, phần non có lơng phân nhánh Cây có tán rộng cành thưa Phân bố địa lý, sinh thái: - Cây hông phân bố Việt Nam, Trung Quốc, Lào Ở Việt Nam, hơng phân bố Cao Lạng (Cao Lộc, Lộc Bình, Bắc Sơn, Bình Gia,…), Bắc Thái, Yên Bái, Lạng Sơn, Hồ Bình, - Hơng ưa sáng, ưa khí hậu mát mẻ Thường thấy mọc vùng đồi núi thấp, độ cao từ 300-1300m so với mặt biển Cây thường gặp bìa rừng trảng bụi thường mọc thành đám, tốt chân núi, ven làng, đất ẩm, sâu dày Giá trị: Kinh tế: Gỗ hông không bị rạng nứt q trình sấy, dễ bắt màu dễ nhuộm màu gỗ khó bị mục, gõ hơng cách nhiệt tốt điểm bắt lửa cao đến 400 0C gỗ nhẹ, thơng gió tốt Theo nhà đầu tư trồng hông giá trị thị trường quốc tế gỗ hông là600-1000 USD/m3 Dược liệu: hoa trái hơng có tác dụng trị bệnh suyễn Công dụng khác: Lá hoa paulownia giàu nitơ nguồn dinh dưỡng quý, làm thứ ăn cho gia súc, phân bón Đồng thời, hoa có mùi hương dịu dùng hương liệu mỹ phẩm Phương pháp nhân giống phịng thí nghiệm Ngồi tự nhiên, nhân giống chủ yếu hạt, mầm nhỏ nên khó sống cần phải có phương pháp chăm sóc chu đáo Ở nước ta, đặc biệt phía nam SVTH nhóm 11 Ni cấy mơ thực vật - Cây Hơng khơng có hạt để gieo lượng trồng nên việc nhân giống chồi rễ đáp ứng lượng lớn đáp ứng nhu cầu 2.2.1 Nuôi cấy mô Ở nước ta, Viện sinh học nhiêt đới nhập tiến hành nhân giống paulownia phương pháp vi giâm cành sau tạo mơi trường MS/2 có bổ sung BAP tạo hồn chỉnh Người ta sử dụng: - Phơi hữu tính để tạo ni cấy mơ sẹo, sau tạo phơi trực tiếp từ mơ sẹo - Trục hạ diệp non trồng hạt điều kiện in-vitro tạo chồi trực tiếp - Đỉnh sinh trưởng tạo thành - Nuôi cấy chồi nách tạo - Chồi tạo rễ trực tiếp 2.2.2 Phương pháp quang tự dưỡng: Không sử dụng đường, vitamin chất điều hồ sinh trưởng Trong ni cấy có sục khí CO2 Ngun tắc phương pháp: Thơng qua máy bơm khí, CO2 đưa vào lồng nuôi cấy Cường độ CO đưa vào điều chỉnh van đồng hồ đo tốc độ Để hạn chế vi sinh vật nấm bệnh nhiễm vào khơng gian ni cấy, CO lọc qua lớp màng lọc milipore lượng CO2 khỏi lồng ni cấy thơng qua lỗ thốt, giúp cho CO ln ln chuyển, cung cấp đủ lượng CO2 cần thiết cho xanh quang hợp phát triển Vật liệu: Sử dụng 1,4kg florialite cho mô nuôi cấy (Florialite hỗn hợp sợi cellulose vermiculite hợp chất trơ để giúp hệ thống rễ phát triển công ty Minoru Sangyo Nhật Bản sản xuất) Mẫu cấy: đốt thân từ ống nghiệm Môi trường: Môi trường lỏng MS ½ khơng đường khơng vitamin Thể tích mơi trường 38 ml Tốc độ trao đổi khí 0,15 lần/giờ (Kozai cộng 1986) Điều kiện nuôi cấy: Cường độ ánh sáng: 145 μmol.m-2s-1 Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Nồng độ CO2 phịng ni cấy: 150±50μmol.mol-1 SVTH nhóm 12 Nuôi cấy mô thực vật - Cây Hông Nhiệt độ phịng ni cấy: 26 ± 20C Ẩm độ phịng ni cấy: 60 – 70% Thời gian nuôi cấy: 28 ngày 2.1 Vật liệu phương pháp tiến hành 2.3.1 Vật liệu Mẫu cấy: Từ trồng thiên nhiên, chọn khoẻ manh phát triển tốt không sâu bệnh Mẫu cấy đốt thân, phiến non, cuống lấy từ đến cặp thứ tư tính từ xuống Mơi trường ni cấy: Mơi trường ni cấy có thành phần khống đa lượng vi lượng ½ thành phần khống mơi trường MS (MS/2: Murashige Skoog 1962) Môi trường bổ sung: Vitamin MS (1962) Glycin: 2mg/l Đường Saccharose: 30 g/l Arga:7g/l Chất điều hoà: BAP, NAA Mơi trường có pH 5,8 2.3.2 Phương pháp Vơ trùng mẫu Đoạn thân ngồi thiên nhiên cắt thành đoạn 4-6 cm Rửa nước Savon loãng Lắc mẫu cồn 70% phút Rửa lại lần nước cất vô trùng Sau mẫu xử lý dung dịc hypochloric Calcium với nồng độ 1% 20phút Cấy mẫu SVTH nhóm 13 Nuôi cấy mô thực vật - Cây Hông Trong tủ cấy vô trùng, mẫu cấy rửa với nước cất vô trùng lần, cắt bỏ phần bị trắng tác dụng hypochlorid Calcium Các đoạn thân cắt thành đốt riêng lẻ cấy đứng mơi trường Điều kiện ni cấy: Nhiệt độ phịng nuôi: 25 ± 20C Cường độ chiếu sáng: 2800 – 3000 lux Thời gian chiếu sáng: 12h/ngày Ẩm độ trung bình: 70% 2.2 Quy trình nhân giống Hơng Quy trình nhân giống hơng Paulownia fortunei hemsl phương pháp ni cấy in-vitro SVTH nhóm 14 Ni cấy mơ thực vật - Cây Hơng Cây mẹ trồng ngồi thiên nhiên Đoạn thân Hypochlorid Calcium 1% 20 phút Cấy vào môi trường MS/2 tuần Chồi 2-3 cm Cắt đốt thân - mm MS/2 + 7mg/l BAP tuần MS/2 + BAP mg/l HSN 312/n ăm Cụm chồi MS/2 tuần tuần Mô sẹo tuần Tách chồi cao Từ cm trở lên Cây có 4-8 rễ BAP: 6- Benzyl amino purine HSN: Hệ số nhân Vườn ươm Các bước tiến hành: SVTH nhóm 15 HSN 412//nă m Ni cấy mô thực vật - Cây Hông Bước 1: Từ trồng thiên nhiên, chọn khỏe mạnh phát triển tốt, không sâu bệnh Bước 2: Tạo mẫu cấy (đoạn thân): mẹ cắt thành đoạn 4-6 cm, qua làm sơ bộ, sau mẫu xử lí dung dịch hypochloric Calcium 1% 20 phút để loại bỏ VSV mẫu Bước 3: Cấy mẫu vào mơi trường MS/2 (mơi trường ni cấy có thành phần khoáng đa lượng vi lượng 1/2 thành phần khống mơi trường MS tuần) Bước 4: - Khi chồi - cm tách mô sẹo để nuôi cấy tiếp tục nuôi cấy từ chồi - Nuôi mô sẹo: nuôi môi trường MS/2 + 7mg/l tuần để tạo cụm chồi - Nuôi chồi con: chồi cắt đốt thân từ - mm, sau tiếp tục nuôi môi trường MS/2 + BAP 7mg/l tuần để tạo cụm chồi Bước 5: Cụm chồi tiếp tục phát triển tách chồi cao môi trường MS/2 tạo thành có - rễ Bước 6: Mang vườn ươm để trồng Kết Mẫu cấy (đoạn thân) vào môi tường nhân chồi nhằm tạo số lượng lớn Khoảng 4, ngày sau cấy, chồi nách bắt đầu xuất từ nách đốt Đồng thời bên gốc có có phân cắt tế bào tạo thành mô sẹo Sau tuần, chồi dài 0,1 - 0,2 cm Chồi tách cấy sang môi trường tạo rễ Chồi cao khoảng từ 2,5 - cm tách từ cụm chồi cấy vào mơi trường có bổ sung NAA để kích thích tạo rễ Khoảng tuần rễ bắt đầu nhú Sau để tiếp tục phát triển mơi trường này, ta cấy truyền tháng lần để giữ giống môi trường nhân giống đem trồng Rễ có chiều dài cm, chiều cao khoảng 15 cm đạt tiêu chuẩn để đem trồng SVTH nhóm 16 Nuôi cấy mô thực vật - Cây Hông Qui trình nhân giống in-tro cho hơng nhận số lượng lớn cung cấp cho nhu cầu với hệ số nhân 12 x 13 12 con/năm từ mẫu ban đầu Phương pháp nhân giống đem lại hiệu kinh tế cao để ứng dụng sản xuất IV Kết luận cơng nghệ ni cấy mơ thực vật Dự đốn tương lai: Ni vấy mơ thực vật có nhiều triển vọng tương lai, mang lại nhiều lợi ích, nước có kinh tế chủ yếu nông nghiệp Việt Nam Ưu điểm hạn chế công nghệ nuôi cấy mô thực vật Nuôi cấy mô thực vật ứng dụng đạt nhiều thành công bật công nghệ sinh học thực vật 1.1 Ưu điểm: - Nhân giống nhanh với số lượng lớn giống thời gian ngắn, diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại - Có thể tiến hành số loài thực vật mà biện pháp nhân giống thông thường thực - Tạo giống bệnh đồng mặt di truyền - Có thể sản xuất giống quanh năm chủ động kiểm soát yếu tố ngoại cảnh nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, - Tạo có khả hoa, tạo sớm - Tạo dịng tồn (cây chà là) toàn đực (cây măng tây) theo mong muốn - Dễ dàng tạo giống trồng phương pháp chuyển gene - Duy trì bảo quản nhiều giống trồng quý để phục tráng giống trồng - Có thể sử dụng nhân giống từ phương pháp nuôi cấy mô để làm mẹ cho bước nhân - Hiệu kinh tế cao, người mua cấy mô sản xuất kinh doanh nhanh thu hồi vốn 1.2 Hạn chế SVTH nhóm 17 Ni cấy mơ thực vật - Cây Hơng - Chi phí đầu tư cao - Cần có kỹ thuật cao - Giá thành sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống cao - Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan cfn khoảng thời gian dài trước thích ứng trồng ngồi vườn ươm - Sự đa dạng dòng sản phẩm nhân giống hạn chế, nghĩa tạo thường đồng mặt kiểu hình - Có thể xảy đột biến tác dụng chất điều hịa sinh trưởng bổ sung vào mơi trường ni cấy Tình hình phát triển Hiện nay: Nuôi cấy mô thực vật ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, vào sản xuất hợp chất thứ cấp, nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao, hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao Ở Việt Nam, nuôi cấy mô trở thành lĩnh vực quan tâm nhiều ngành trồng trọt Công nghệ nuôi cấy mô tế bào phổ biến nghành có tiềm phát triển Hiện người ta hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật để sản xuất giống thương mại Trở thành phương pháp nhân giống chuẩn phổ biến nhiều loại trồng như: công nghiệp, lâm nghiệp, cảnh, dược liệu, ăn trái rau xanh Với phương pháp người ta nhân giống nhiều lồi từ vùng khí hậu khác giới mà phương pháp nhân giống truyền thống thực đạt chất lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất thị trường Đề xuất 3.1 Một số hệ thống nuôi cấy 3.1.1 SVTH nhóm Ni cấy lỏng có sục khí – Bioreactor 18 Nuôi cấy mô thực vật - Cây Hông Bioreactor sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật cải tiến từ loại bioreactor nuôi cấy tế bào vi sinh Bioreactor với hệ thống cung cấp xả mơi trường, hệ thống cấp khí vơ trùng thiết kế có khả tạo mơi trường ni cấy vơ trùng, kiểm sốt yếu tố môi trường bên lắc, thống khí, nhiệt độ, oxy hịa tan, pH Ngày nay, hệ thống bioreactor với cấu trúc bình lên men cánh khuấy kim loại thay ống silicon sục khí, điều khiển tốc độ dịng khí vào để hạn chế tương tác bất lợi mẫu cấy, hạn chế tổn thương mẫu Hệ thống bioreactor sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác như: ni cấy chồi phôi thực vật, chồi hoa thu hải đường, củ khoai tây bi in vitro, hoa lily, số thân gỗ đặc biệt nuôi cấy thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học ni cấy rễ nhân sâm Bioreactor có ba loại phân biệt sau: Loại dùng để sản xuất sinh khối (sản phẩm khối tế bào, đơn vị phát sinh phôi, phát sinh quan, chồi, rễ) Loại dùng để sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp, enzyme Loại dùng cho việc chuyển hố sinh học chất chuyển hóa ngoại sinh (là chất tiền thân trình trao đổi chất) 3.1.2 Nuôi cấy quang tự dưỡng Nuôi cấy quang tự dưỡng giáo sư Kozai cộng đẩy mạnh nghiên cứu thập niên 90 Từ đến có nhiều nghiên cứu thành cơng việc ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất giống trồng Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm phương pháp truyền thống Nó thúc đẩy tăng trưởng in vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy làm hạ giá thành in vitro Phương pháp trọng đến tác nhân vật lý môi trường nuôi cấy (ion, khuyết tán khí hịa tan) yếu tố ảnh hưởng đến phát triển SVTH nhóm 19 Ni cấy mơ thực vật - Cây Hơng bình nuôi cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần khơng khí, ẩm độ, nhiệt độ tốc độ ln chuyển khơng khí bình ni cấy,…) Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không sử dụng mơi trường ni cấy Nói không sử dụng chất hữu bao gồm chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ chất khoáng cho vào môi trường Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho bình ni cấy sử dụng khí CO2 có sẵn khơng khí làm nguồn carbon cho q trình tăng trưởng phát triển Sự loại bỏ đường môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn q trình ni cấy giảm Điều đem lại ý nghĩa lớn sản xuất chi phí cơng lao động giảm đáng kể song song với việc giảm nguyên vật liệu 3.2 Một số hệ thống bioreactor 3.2.1 Hệ thống RITA Hệ thống RITA, Pha 1: mô không ngập môi trường, Pha 2: tượng ngập hoạt hóa, van mở cho khí qua màng lọc đẩy mơi trường lỏng lên ngập mơ cấy, Pha 3: trao đổi khí hệ thống RITA, Pha 4: chu kỳ kết thúc, van đóng lại mơi trường lỏng rút xuống ngăn bên SVTH nhóm 20 Ni cấy mơ thực vật - Cây Hơng Hình Các thành phần hệ thống Plantima Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập SVTH nhóm 21 Ni cấy mô thực vật - Cây Hông Hệ thống bioreactor nuôi cấy rễ tơ nhân sâm Hàn Quốc Tài liệu tham khảo * Giáo trình: [1] Dương Tấn Nhựt, Ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật việc nhân nhanh lan hài lan hồ điệp [2] Dương Công Kiên, Nuôi cấy mô thực vật, NxB ĐHQG TPHCM, 2002 * Link mạng: [1] http://www.thuviensinhhoc.com/day-hoc/day-hoc-sinh-hoc-11/696-nhan-ging-vo-tinhthc-vt.html#ixzz3HJO956A7 [2] http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=4700 [3] Nguyễn Nga, nuôi cấy mô tế bào thực vật, http://www.doko.vn/tai-lieu/nuoi-caymo-va-te-bao-thuc-vat-869614 SVTH nhóm 22 Ni cấy mơ thực vật - Cây Hông [4] Bùi Anh Tú, nuôi cấy mô tế bào thực vật, http://www.doko.vn/luan-van/nuoi-cay-mote-bao-thuc-vat-307382 [5]http://www.lamdong.gov.vn/viVN/a/book/Pages/books/TonghopHoiThaoNam2004/un g%20dung%20cn%20ncm%20te%20bao%20thuc%20vat%20torng%20viec%20nhan %20nhanh%20lan%20hai%20va%20hai%20hodiep.htm SVTH nhóm 23 ... http://www.doko.vn/tai-lieu/nuoi-caymo-va-te-bao -thuc- vat- 869614 SVTH nhóm 22 Ni cấy mơ thực vật - Cây Hông [4] Bùi Anh Tú, nuôi cấy mô tế bào thực vật, http://www.doko.vn/luan-van/nuoi -cay- mote-bao -thuc- vat- 307382... 1986) Điều kiện nuôi cấy: Cường độ ánh sáng: 145 μmol.m-2s-1 Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Nồng độ CO2 phịng ni cấy: 150±50μmol.mol-1 SVTH nhóm 12 Nuôi cấy mô thực vật - Cây Hông ... [5]http://www.lamdong.gov.vn/viVN/a/book/Pages/books/TonghopHoiThaoNam2004/un g%20dung%20cn%20ncm%20te%20bao%2 0thuc% 2 0vat% 20torng%20viec%20nhan %20nhanh%20lan%20hai%20va%20hai%20hodiep.htm SVTH nhóm 23