SẮC kí LỎNG HIỆU NĂNG CAO

SKL cao áp hay SKL hiệu cao HPLC (High Performance Liquid Chromatography) có ưu điểm là:  Thời gian sắc ký  Kích thước hạt  Độ phân giải SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ĐẠI HỌC Y DƯC TP HCM- KHOA DƯC BỘ MÔN PHÂN TÍCH-KIỂM NGHIỆM-10/2016 Ts Phan Thanh Dũng SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC (High Performance Liquid Chromatography) MỤC TIÊU  Định nghóa HPLC  Phân loại  Trang thiết bị HPLC  Các thông số đặc trưng HPLC  Ứng dụng HPLC 1.ĐỊNH NGHĨA - HPLC kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp cột nhồi đầy hạt có kích thước  10 m Dùng bơm có áp suất cao (high pressure)  300 atm để đẩy pha động (mobile phase) qua cột (pha tỉnh) với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút cho phép phân giải nhanh (High Performance) lượng mẫu nhỏ cở 20 g - HPLC đời từ 1960 đến sử dụng rộng rãi phòng thí nghiệm áp dụng nhiều lónh vực do: + Có độ nhạy cao + Độ độ xác cao đáp ứng yêu cầu định lượng + Thích hợp với hợp chất không bay chịu nhiệt A B C D (A) Hỗn hợp chất cần phân tích bơm vào cột  Tập trung ưu tiên pha động (B)  Tập trung ưu tiên pha tĩnh (B) (C) Cân thiết lập (D) Quá trình lặp lại liên tục, sau thời gian chất tách rời Bơm mẫu Chiều di chuyển pha động Detector T=0 T=10’ T=20’ Mạnh Tương tác với pha tĩnh Rf Yếu tr Điều kiện sắc ký: mẫu: 40 ng thành phần; cột: cm 4,6 nm, ID; pha tĩnh: ChromSphere UOP C18, 1,5 m; pha động: hỗn hợp nước: acetonitril (85:15); tốc độ dịng: 3,5 ml/phút; nhiệt độ phân tích: 350C; phát hiện: detector UV 254 nm; peak tách hoàn toàn: 1= bromazepam, 2= nitrazepam; 3= clorazepam; 4= oxazepam; 5= flunitrazepam; 6= hydroxydiazepam( ternazepam); 7= desmethyldiazepam( nordazepam); 8= diazepam(valium) PHÂN LOẠI Dựa vào chế tách chiết phương pháp SKLHNC chia làm loại: - Sắc ký phân bố (partition chromatography) - Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography) - Sắc ký ion (ion chromatography) - Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography) Trong sắc ký phân bố ứng dụng nhiều phân tích hợp chất từ không phân cực đến hợp chất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử khơng q lớn (< 3000) PHÂN LOẠI SKPB: chia thành hai loại dựa độ phân cực tương đối pha tĩnh pha động: - Sắc ký pha thường (Normal phase chromatography): Pha tỉnh phân cực chất mang phủ liên kết với chất phân cực (nước, oxydipropionitril, PEG, trimethylenglycol….) Pha động dung môi hữu phân cực Trong NP, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao pha động NP dùng để tách phân tích hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn - Sắc ký pha đảo (Reversed phase chromatography): Pha tỉnh chất lỏng phân cực (hydrocarbon….) Pha động dung môi phân cực (nước, methanol, acetonitril…) Trong RP pha tĩnh phân cực pha động, dùng phân tích hợp chất từ không phân cực đến phân cực Hầu hết hợp chất hữu có mạch carbon dài (ít phân cực) thích hợp cho phân tích RP Dung môi sử dụng RP dung mơi phân cực, dung mơi nước đóng vai trị quan trọng mà lại rẻ tiền Do đó, RP ứng dụng nhiều phổ biến NP TRANG THIẾT BỊ Bình đựng pha động Bộ phận khử khí Hệ thống bơm cao áp Bộ phận nạp mẫu Lọc tiền cột Cột sắc ký Bộ phận phát Bộ phận xử lý ghi tín hiệu 4.2 ĐỊNH LƯNG 4.2.2.1 Chuẩn hóa với chất chuẩn ngoại (Phương pháp chuẩn ngoại) So sánh trực tiếp độ lớn tín hiệu (diện tích pic chiều cao pic) mẫu thử chưa biết với dung dịch chuẩn đối chiếu chất phương pháp phổ biến phương pháp sắc ký Phương pháp yêu cầu bơm thể tích xác định điều kiện sắc ký cho hai mẫu thử mẫu chuẩn so sánh Phương pháp tiến hành nồng độ khác (chuẩn hóa điểm hay nhiều điểm) Trong phương pháp chuẩn điểm nồng độ mẫu tính sau: Cst C a  Sa  S st Ca: nồng độ mẫu thử Cst: nồng độ chất chuẩn Sa: độ lớn pic mẫu thử (diện tích chiều cao pic) Sst: độ lớn pic mẫu chuẩn Với phương pháp xác định hai hay nhiều điểm, phương trình đường cong chuẩn phải xác định qua việc khảo sát điểm đo kết hợp với phương pháp phân tích hồi qui 4.2 ĐỊNH LƯNG 4.2.2.2 Chuẩn hóa với chất chuẩn nội (Phương pháp chuẩn nội) Để giảm sai số đạt độ lặp lại cao phép định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao, người ta sử dụng phương pháp chuẩn hóa với chất thứ hai thêm vào chất chuẩn ngoại mẫu thử Chất gọi chuẩn nội Chất chuẩn nội phải có cấu trúc hóa học tương ứng với chất khảo sát Trong điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải có thời gian lưu gần với thời gia lưu chất cần phân tích mẫu phải tách hoàn toàn Độ nhạy phát chất chuẩn nội chất cần phân tích thường khác nhau, yếu tố hiệu chỉnh Fx phải xác định với dung dịch chuẩn tinh khiết Nếu gọi Cx nồng độ dung dịch chuẩn Cis nồng độ dung dịch chất chuẩn nội Sx độ lớn peak chuẩn (chất chuẩn ngoại) Sis  C x Sis độ lớn peak chuẩn nội Fx  S x  Cis Thì Nếu yếu tố hiệu chỉnh Fx số vùng nồng độ nghiên cứu, nồng độ Cs mẫu mà người ta thêm chất S chuẩn nội tính sau Cs  s  Cis  Fx Sis 4.2 ĐỊNH LƯNG 4.2.2.3 Chuẩn hoá phương pháp thêm Phương pháp thêm chất chuẩn sử dụng tronng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao chủ yếu có vấn đề ảnh hưởng chất phụ Dung dịch mẫu thử thêm lượng xác định chất chuẩn, pic thu hai dung dịch mẫu thử mẫu thử thêm chất chuẩn vào phải khảo sát điều kiện sắc ký Phương pháp thêm chất chuẩn thực lần, hai hay nhiều lần Trong trường hợp đơn giản với lần thêm chất chuẩn, nồng độ chưa biết mẫu Ca tính chênh lệch nồng độ C (lượng chất chuẩn thêm vào) độ tăng độ lớn pic S theo công thức sau C Ca  Sa  S Với phương pháp thêm nhiều lần, nồng độ mẫu chuẩn tính toán phương pháp phân tích hồi qui Ưu điểm phương pháp thêm chất chuẩn có độ xác cao loại trừ yếu tố ảnh hưởng khác Sự thay đổi lớn nhiệt độ, áp suất mô tả bù trừ đồ thị chuẩn mà không ảnh hưởng đến kết qủa đo đạc Tuy nhiên phương pháp đòi hỏi nhiều thời gian phân tích phải chuẩn hóa mẫu 4.2 ĐỊNH LƯNG 4.2.2.4 Phương pháp qui 100% diện tích pic Phương pháp đơn giản ứng dụng hạn chế sắc ký lỏng hiệu cao, thường hay dùng sắc ký khí Phương pháp đòi hỏi cấu tử hỗn hợp cần phân tích phải rửa giải phát Khi có đáp ứng phận phát cấu tử X, Y, Z với cường độ tín hiệu, ta có công thức: Ax 100 %X  Ax  Ay  Az %, X: giá trị % cấu tử X hỗn hợp X, Y, Z Ax, Ay, Az: diện tích pic cấu tử X, Y, Z Trong sắc ký lỏng hiệu cao, công thức đáp ứng phận phát cáu tử X, Y, Z 4.3 MỘT VÀI ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ứng dụng nhiều ngành Dược để định lượng chất sau: - Kháng sinh, thuốc an thần, thuốc hạ nhiệt, giảm đau, thuốc kháng nấm, thuốc tim mạch, thuốc sốt rét, vitamin, thuốc ung thư… - Acid amin, protein, hydrate carbon, lipid - Các chất chuyển hoá thuốc thể - Các chất phân cực, đồng phân (ví dụ: dẫn chất ortho, meta para phenol) - Các ion vô hữu cơ, acid amin - Các hợp chất cao phân tử khác (ít 10%) protein, acid béo - Các hợp chất có phân tử lượng cao tách khỏi hợp chất có phân tử lượng thấp MỘT VÀI ÁP DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC CEPHALEXIN C18 UV CIPROFLOXACIN HYDROCLORID C18 UV VIÊN NÉN CIPROFLOXACIN C18-UV COLECALCIFEROL C 50-S UV DOXYCYCLIN HYDROCLORID C18- UV ERGOCALCIFEROL C18 UV VIÊN NÉN GRISEOFULVIN C18 UV VIÊN BAO IBUPROFEN C18 UV LINCOMYCIN HYDROCLORID C8 UV 10 NANG LINCOMYCIN C8 UV RP8 11 THUỐC TIÊM LINCOMYCIN C8 UV RP9 12 THUỐC TIÊM MORPHIN HYDROCLORID C18 UV 13 TETRACICLIN HYDROCLORID STYREN-DIVINYLBENZEN COPOLYMER UV 14 THUỐC TIÊM THIAMIN HYDROCLORID C18 UV 15 VIÊN NÉN VITAMIN B1 C18 UV 16 ALPHA TOCOPHEROL C18 UV 17 ALPHA TOCOPHEROL ACETAT C18 UV 18 VINBLASTIN SULFAT C8 UV 19 VINCRISTIN SULFAT C8 UV THAÅM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH TÍNH TNG THÍCH CỦA HỆ THỐNG: Tiến hành chạy sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử n lần ( n6) Tính RSD thông số: thời gian lưu, diên tích đỉnh, chiều cao đỉnh, hệ số bất đối, độ phân giải, số đóa lý thuyết… Điều kiện: RSD  2% THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu (specificity) hay gọi tính chọn lọc (selectivity) qui trình phân tích khả qui trình cho phép xác định xác đặc hiệu chất cần phân tích Tính đặc hiệu độ nhiễu phương pháp Độ nhiễu phương pháp thấp, tính đặc hiệu cao Cách xác định: chuẩn bị mẫu giả định có thành phần giống mẫu thử mẫu trắng có thành phần giống mẫu thử không chứa hoạt chất cần thử Yêu cầu: Thời gian di chuyển mẫu thử phải tương đương thời gian di chuyển mẫu đối chiếu, đồng thời mẫu trắng đỉnh trùng với đỉnh hoạt chất Khi thêm lượng chất đối chiếu vào mẫu thử, diện tích đỉnh hoạt chất phải tăng lên so với trước thêm chất đối chiếu Phổ tử ngoại mẫu thử giống phổ tử ngoại mẫu đối chiếu Độ tinh khiết peak lớn 99% THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH Độ xác Độ xác mức độ sát gần kết thử riêng rẽ xI với giá trị trung bình X thu áp dụng phương pháp đề xuất cho mẫu thử đồng điều kiện xác định Độ xác bị ảnh hưởng sai số ngẫu nhiên (random errors) Độ xác phương pháp biểu thị bằng: SD: độ lệch chuẩn (standard deviation) RSD: độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation) Hay CV: hệ số biến thiên (coeffcient of variation) Cách xác định: với mẫu thử, tiến hành xác định theo phương pháp đề xuất n lần (n  6) Các lần thử phải tiến hành độc lập nhau, có tiến hành mẫu làm đồng Mẫu thử: pha loãng dung dịch chuẩn nồng độ C cho đỉnh hấp thu có chiếu cao H khoảng lần biên độ dao động lớn Hmax tín hiệu nhiễu đường Mẫu trắng: chạy đường có chiều dài gấp 20 lần bề rộng ứng với 1/2 chiều cao đỉnh hấp thu ứng với nồng độ C, đo Hmax tín hiệu nhiễu Tính giới hạn phát giới hạn định lượng theo công thức THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH Độ Độ (accuracy) phương pháp phân tích mức độ sát gần giá trị tìm thấy với giá trị thực áp dụng phương pháp đề xuất mẫu thử làm đồng điều kiện xác định Độ bị ảnh hưởng sai số hệ thống (systematic errors) Độ thường biểu thị tỷ lệ phục hồi (%) (recovery) giá trị tìm thấy với giá trị thực thêm vào mẫu thử Cách xác định: -Xác định hàm lượng chất cần thử mẫu đem thử phương pháp đề xuất -Cho vào mẫu thử lượng chất chuẩn chất cần thử; người ta khuyên nên áp dụng với ba mức thêm vào 80%, 100%, 120% hàm lượng lý thuyết, tiến hành xác định phương pháp đề xuất, mức tiến hành ba lần (triplicate) Sau mô hình thực nghiệm với độ đúng: Xo: hàm lượng lý thuyết X’: hàm lượng xác định X'X o  100% Xo THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH Mô hình thực nghiệm độ Hàm lượng % thêm vào Xo X’  80% - - - 100% - - - 120% Độ độ xác hai tiêu để đánh giá phương pháp phân tích định lượng Nếu phương pháp đạt riêng độ hay độ xác chưa đủ, phương pháp phải đáp ứng độ lẫn độ xác Qui trình đảm bảo bị ảnh hưởng sai số ngẫu nhiên sai số hệ thống THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH Khoảng tính chất tuyến tính Tính chất tuyến tính qui trình phân tích khả luận kết phương pháp dựa vào đường biểu diễn phụ thuộc độ đáp ứng đại lượng đo nồng độ chất cần phân tích Tính chất tuyến tính biểu thị hệ số tương quan R Cách xác định: tiến hành thực nghiệm để xác định giá trị đo y theo nồng độ x Nếu có phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn đoạn thẳng tuân theo phương trình: (x  X)(y  Y) R Y = ax + b (x  X) ( y  Y) Và R tính theo công thức: Nếu R = 1: có tương quan tuyến tính rõ rệt Sau xác định khoảng tuyến tính phương pháp ta xây dựng phương trình hồi qui khoảng này, tức xác định hệ số a, b Giá trị R2 dùng để đánh giá phương trình hồi qui trắc nghiệm t dùng để kiểm tra hệ số mặt ý nghóa thống kê THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH Giới hạn phát D Giới hạn phát (detection limit) lượng chất thử có mẫu mà phương pháp phân tích phát không thiết phải xác định xác hàm lượng Giới hạn phát xác định sau: giả sử tín hiệu thu từ mẫu trắng B, tín hiệu thu từ mẫu thử S D xác định S/B = 3/1 THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH Giới hạn định lượng Q Giới hạn định lượng (quantitation limit) qui trình phân tích lượng thấp chất cần thử có mẫu thử xác định với độ độ xác thích hợp Tương tự giới hạn phát hiện, Q xác định S/B = 10/1 Mẫu thử: pha loãng dung dịch chuẩn nồng độ C cho đỉnh hấp thu có chiều cao H khoảng lần biên độ dao động lớn Hmax tín hiệu nhiễu đường Mẫu trắng: chạy đường có chiều dài gấp 20 lần bề rộng ứng với 1/2 chiều cao đỉnh hấp thu ứng với nồng độ c, đo Hmax tín hiệu nhiễu Tính giới hạn phát giới hạn định lượng theo công thức: D = Hmax F Q = 10 Hmax F Chúc bạn đạt kết cao học tập ...SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ĐẠI HỌC Y DƯC TP HCM- KHOA DƯC BỘ MÔN PHÂN TÍCH-KIỂM NGHIỆM-10/2016 Ts Phan Thanh Dũng SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC... Refactometer) loại phận phát thứ dùng phổ biến sắc ký lỏng hiệu cao Đặc tính chung bền nhạy sử dụng rộng rãi cho: - Sắc ký lỏng hiệu cao phân tích - Sắc ký rây phân tử (exclusion chromatography)... SKLHNC chia làm loại: - Sắc ký phân bố (partition chromatography) - Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography) - Sắc ký ion (ion chromatography) - Sắc ký rây phân tử (size