KIỂM NGHIỆM bài sắc kí lớp MỎNG

Sắc ký lớp mỏng Biên soạn: PGS TS Võ thị Bạch Huệ 3/2012 1/- Mở đầu Các kỹ thuật tách sắc ký phương pháp tách thành phần mẫu phân bố vào hai pha: pha tĩnh pha động Pha tĩnh chất rắn, chất lỏng giữ chất rắn hay gel Pha tĩnh nhồi vào cột, trải thành lớp, hay phân tán thành lớp phim v.v Pha động chất khí, chất lỏng hay chất lưu siêu tới hạn (cịn gọi chất lỏng siêu tới hạn) http://www.instructables.com/id/EW1YDCYF4REC0IU/ 1/- Mở đầu Sự tách sắc ký dựa chế khác - hấp phụ, - phân bố khối lượng (hay phân chia), - trao đổi ion, - dựa khác tính chất lý hố phân tử kích thước, khối lượng, thể tích, v.v… 2/- Lịch sử Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tswett (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát minh kĩ thuật sắc kí vào năm 1903 ông nghiên cứu chlorophyll 1/- Mở đầu Khi cho dung dịch sắc tố thực vật ether dầu hỏa lên cột nhồi bột mịn calci carbonat, ông nhận thấy sắc tố bị hấp phụ đầu cột Khi cho dung môi nguyên chất (ether dầu hỏa) lên cột, sắc tố di chuyển cột tách thành vòng màu xếp chồng lên Phương pháp sau đặt tên sắc ký 1/- Mở đầu (Chromatography: Sắc ký nghĩa ghi màu, tiếng Hy Lạp chữ chroma có nghĩa màu; vừa tên Tsvet nghĩa tiếng Nga vừa màu sắc tố thực vật ơng phân tích lúc giờ, graphein viết) Tên tiếp tục dùng dù phương pháp sử dụng để tách chất không màu Các kỹ thuật 1938 Izmailov Schraiber xây dựng sau năm 1958 Stahl hồn thiện phương pháp sắc ký lớp mỏng Các kỹ thuật Sắc ký tiếp tục phát triển không ngừng nhờ vào kết nghiên cứu Archer John Porter Martin Richard Laurence Millington Synge suốt năm thập niên 40 50 kỷ 20 Hai ông đưa nguyên tắc kỹ thuật sắc ký phân bố làm động lực cho phát triển nhiều phương pháp sắc ký khác sắc ký giấy (PC), sắc ký khí (GC) sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 3/- Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng kỹ thuật tách chất tiến hành cho pha động di chuyển qua pha tĩnh đặt hỗn hợp chất cần tách 3/- Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh chất hấp phụ chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, trải thành lớp mỏng đồng cố định phiến kính phiến kim loại Solvent 3/- Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng: Pha động hệ dung môi đơn đa thành phần trộn với theo tỷ lệ quy định chuyên luận Trong trình di chuyển qua lớp hấp phụ, cấu tử hỗn hợp mẫu thử di chuyển lớp mỏng, theo hướng pha động, với tốc độ khác Kết quả, thu sắc ký đồ lớp mỏng MF MW o Bp ( C) Density (g/mL) Hazards* Dipole Hexane CH3(CH2)4CH3 C6H14 86.17 68.7 0.659 Flammable Toxic 0.08 Elution Stength () 0.01 Toluene C6H5CH3 C7H8 92.13 110.6 0.867 Flammable Toxic 0.31 0.22 Diethyl ether CH3CH2OCH2CH3 C4H10O 74.12 34.6 0.713 Flammable Toxic, CNS Depressant 1.15 0.29 Dichloromethane CH2Cl2 CH2Cl2 84.94 39.8 1.326 Toxic, Irritant Cancer suspect 1.14 0.32 Ethyl Acetate CH3CO2CH2CH3 C4H8O2 88.10 77.1 0.901 Flammable Irritant 1.88 0.45 Acetone CH3COCH3 C3H6O 58.08 56.3 0.790 Flammable Irritant 2.69 0.43 Butanone CH3CH2COCH3 C4H8O 72.10 80.1 0.805 Flammable Irritant 2.76 0.39 1-Butanol CH3CH2CH2CH2OH C4H10O 74.12 117.7 0.810 Flammable Irritant 1.75 0.47 Propanol CH3CH2CH2OH C3H8O 60.09 82.3 0.785 Flammable Irritant 1.66 0.63 Ethanol CH3CH2OH C2H6O 46.07 78.5 0.789 Flammable Irritant 1.70 0.68 Methanol CH3OH CH4O 32.04 64.7 0.791 Flammable Toxic 1.7 0.73 Water HOH H2O 18.02 100.0 0.998 1.87 >1 10 5.4/- Triển khai sắc ký: Ðặt mỏng gần thẳng đứng với bình triển khai, vết chấm phải bề mặt lớp dung mơi khai triển Ðậy kín bình để n nhiệt độ không đổi Khi dung môi triển khai mỏng đoạn theo quy định chuyên luận, lấy mỏng khỏi bình, đánh dấu mức dung mơi, làm bay dung mơi cịn đọng lại mỏng vết theo dẫn chuyên luận riêng 23 Quan sát vết xuất hiện, tính giá trị Rf Rr tiến hành định tính, phát tạp chất định lượng quy định chuyên luận riêng Việc sắc ký lớp mỏng tiến hành điều kiện chuẩn hoá cho kết có độ tin cậy cao Hiện người ta thường tiến hành sắc ký với giúp đỡ hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu cao Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển chất phân tích hệ số di chuyển Rf tính tỷ lệ khoảng dịch chuyển chất thử khoảng dịch chuyển dung môi: 24 a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu thử, tính cm a’ khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết mẫu đối chiếu, tính cm b khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo đường vết, tính cm Rf: Chỉ có giá trị từ đến l 25 5.5/- Phương pháp phát thu nhận kết sklm điều chế: 5.5.1/- Phun xịt với thuốc thử đặc trưng : Giúp biết vị trí vết mẫu 26 5.5/- Phương pháp phát thu nhận kết sklm điều chế: 5.5.2/- Soi đèn UV : Nhanh, tiện lợi, nhìn vết mà khơng gây hao hụt mẫu Tuy nhiên, vết vị trí x bản, mắt lại nhìn thấy vị trí biểu kiến nó, nghĩa vị trí khác Cần kiểm tra vài lần cách che môt phần phun xịt thuốc thử để nhìn rõ vị trí vết 27 5.5/- Phương pháp phát thu nhận kết sklm điều chế: 5.5.3/- Hơ iod : Đặt buồng có iod, thấy vết lên bản, lấy khỏi buồng, đánh dấu vị trí vết, phơi ngồi quạt iod bay 28 6/- Ưu nhược điểm khả ứng dụng : 6.1/- Ưu điểm Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, thực phịng thí nghiệm Thời gian thực nhanh, tối đa vài Do cách thực đơn giản nên dùng SKLM để khảo sát hệ dung môi cho phương pháp sắc ký khác Nhìn chung SKLM phương pháp có tính ứng dụng cao, thông dụng Nhanh, dễ tìm dung mơi thích hợp để tách chất Các vùng có chứa chất cần thiết tập trung vị trí định dễ dàng phát hiện, dễ dàng nhận biết SKLM tách tốt nhờ tỷ lệ lớn chất tách : chất hấp thu silicagel từ 1:1000 đến 1:10000 tỷ lệ sắc ký cột 1:50 đến 1:100 29 6.2/ Nhược điểm : Thành phần pha động dễ thay đổi trình khai triển Các vết sau khai triển thường bị kéo đuôi filter paper A B U C D A B U C D 30 31 32 TLC - Optimizing for column chromatography Optimum: 0.2 < Rf < 0.5 34 Thin-Layer Chromatography: A TwoComponent Mixture s o l v e n t fr o n t c o m p o n en t B Less polar! c o m p o n en t A More polar! s o l v e n t fr o n t c o m p o n en t B c o m p o n en t A o ri g in mixture s o l v e n t fr o n t o ri g in Increasing Development Time o ri g in Thin-Layer Chromatography: Determination of Rf Values solvent front Rf of component A = dA component B dS dS Rf of component B = dB dB component A dS The Rf value is a decimal fraction, generally only reported to two decimal places dA origin Thin-Layer Chromatography: Qualitative Analysis A B unknown ... kỹ thuật sắc ký phân bố làm động lực cho phát triển nhiều phương pháp sắc ký khác sắc ký giấy (PC), sắc ký khí (GC) sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 3/- Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng: Sắc ký lớp mỏng kỹ... Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh chất hấp phụ chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, trải thành lớp mỏng đồng cố định phiến kính phiến kim loại Solvent 3/- Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng: Pha động... định chuyên luận riêng Việc sắc ký lớp mỏng tiến hành điều kiện chuẩn hố cho kết có độ tin cậy cao Hiện người ta thường tiến hành sắc ký với giúp đỡ hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu cao Ðại lượng đặc