KIỂM NGHIỆM bài sắc kí GIẤY

Sắc Ký Giấy (Paper Chromatography) Nguyên tắc  Giấy làm giá mang pha tónh  Pha tónh pha động chất lỏng  Pha tónh hấp phụ lỗ xốp chất mang  Pha tónh thường nước  Sau chấm hỗn hợp phân tích giấy, cho dung môi thứ hai (pha động) qua, cấu tử hỗn hợp phân bố thành vùng giấy  Các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng nhiều đến hiệu tách Sự cân pha tónh pha động đòi hỏi dụng cụ để SKG phải thật kín có giá đỡ giấy sắc ký Để tách tốt, hướng chuyển động dung môi phải trùng với hướng sợi giấy Trang thiết bị – Giấy sắc ký  Cellulose tinh khiết: độ dày độ hút khác  hiệu lực tách khác  Hút nước  Tách chất hữu không tan nước: tẩm thêm chất kỵ nước (dầu silicon, dầu parafin)  Các thông số kỹ thuật:  Độ dày (mm)  Trọng lượng (g/m2)  Chiều cao thấm nước đơn vị thời gian  Thời gian khai triển đoạn dung môi (h) Trang thiết bị – Giấy sắc ký  Điều kiện lựa chọn  Sức cản vừa đủ  Đồng cỡ hạt tỷ trọng  Tinh khiết hóa học  Ít hấp phụ  Giấy Whatman (Wh) Giấy Wh Số 3MM Trọng lượng (g/m2) 87 97 185 185 92 Độ dày (mm) 0,16 0,18 0,38 0,31 0,20 Thời gian hút nước đến độ cao 7,5 cm Thời gian khai triển đoạn dung môi 40 cm Đặc điểm 12,5 9 15 15 13,5 12,5 giờ Giấy chuẩn Giấy chuẩn Giấy chuẩn Tách nhiều chất Nhanh Trang thiết bị – Giấy sắc ký  Giấy FN Giấy FN số Trọng lượng (g/m2) 85-90 120-125 85-90 120-125 85-90 120-125 145-150 Độ dày (mm) 0,18-0,20 0,20-0,23 0,18-0,20 0,20-0,23 0,17-0,19 0,20-0,23 0,28-0,30 Mức hút nước/30 phút (mm) 140-160 140-160 90-100 90-100 60-70 60-70 140-160 Tương đương giấy Wh 20 Trang thiết bị – Giấy sắc ký  Các loại giấy sắc ký thường dùng Loại giấ y Whatman Schilcicher & Schull Arches Durieux Grycksbo Papersbruck FN Cỡsố 17 20 31 2040a 2040b 2043a 2043b 2045a 2045b 598G 602hp 1101 1104 1,2 3,4 5,6 7,8 Tính chấ t Hay dù n g nhấ t Chả y chậ m (dù n g cho acid amin, peptid, protein) Giấ y dà y , chả y trung bình Cótố c độchả y lớ n (dù n g cho acid amin vàđườ n g) Hạt giấ y lớ n , tố c độchả y trung bình giữ a và4 Rấ t dà y vàmề m , tố c độchả y trung bình (dù n g điệ n di vàsắ c kýsơ khở i trê n tỷlệnhỏ ) Chả y rấ t chậ m , đô i dù n g đểtá ch cá c acid amin Giấ y dà y , rử a vớ i acid, chả y nhanh Mề m , nhanh (bằ n g vớ i Whatman cỡsố4) Mề m , dà y loại 2040a Cứ n g, nhanh trung bình (bằ n g vớ i Whatman cỡsố1) Cứ n g, nhanh trung bình, dà y loại 2043a Cứ n g, rấ t chậ m Cứ n g, rấ t chậ m , dà y loại 2045a Mề m , dà y vànhanh (dù n g cho sắ c kýđi lê n) Lá n g, n g vàchậ m Chậ m vàtương đố i dà y Nhanh trung bình, tương đố i dà y Nhanh Trung bình Chậ m Nhanh Trang thiết bị – Dung môi  Dung môi làm pha tónh thường dung dịch nước  Pha động thường dung môi có độ phân cực thấp pha tónh  Dung môi phải đạt yêu cầu sau:  Tinh khiết  Dung môi dùng làm pha động pha tónh không hỗn hòa  Độ tan hệ số phân bố cấu tử phải khác pha Độ tan cấu tử pha động nên nhỏ pha tónh  Thành phần dung môi trình sắc ký không biến đổi  Dung môi dễ loại khỏi giấy Trang thiết bị – Pha tónh  Nước dung dịch nước: Giấy sắc ký nhúng vào dung dịch nước làm khô tự nhiên, sau cho vào bình bão hòa nước Với pha tónh nước nhúng giấy vào nước, treo giấy lên cho chảy dư treo giấy vào môi trường bão hòa nước thời gian đủ để giấy bão hòa nước  Các dung môi thân nước (các alcol): Treo giấy vào bình bão hòa dung môi pha tónh (MeOH, EtOH) nhúng giấy vào dung dịch pha tónh Trong trường hợp hệ dung môi hai pha pha thân nước làm pha tónh, pha kỵ nước làm pha động  Dung môi hữu không phân cực (đảo pha): Để tách chất hữu không tan nước người ta dùng SKG đảo pha Giấy tẩm dung môi không phân cực (silicon/nhexan) hay ankyl hóa, acetyl hóa Trang thiết bị – Pha động  Dung môi làm pha động SKG thường có tính phân cực dung môi pha động SKLM  Một số hệ dung môi thường dùng SKG Các chất tan nhiều  Isopropanol - amoniac - nước (9:1:2), (6:3:1) nước  n-BuOH - acid acetic - nước (4:1:5), (4:1:1)  Giấy thấm formamid 40% EtOH, pha động chloroform (formamid // chloroform)  Formamid // benzen - chloroform (Tỷ lệ pha động benzen – chloroform Các chất thân thay đổi từ 1:9 đến 9:1 tùy thuộc tính tan chất cần phân tích) nước  Formamid // benzen  Formamid // benzen - cyclohexan (1:9 đến 9:1)  Dimetylformamid // cyclohexan (pha tónh dung dòch dimetylformamid 50% EtOH)  Kerosene // 70% isopropanol (pha tónh kerosene 10-20% ete dầu Các chất kỵ hỏa)  Dầu parafin // dimetylformamid - MeOH - nước (10:10:1) (pha tónh nước dung dịch dầu parafin 10% benzen) Trang thiết bị – Bình sắc ký – Dụng cụ khác  Bình sắc ký  Thủy tinh, nắp đậy kín, mép mài nhám, không dùng nút cao su  Hình trụ hay hình hộp chữ nhật với nhiều kích thước khác  Có thể dùng ống nghiệm hay ống đong có nút hay nắp kín  Các dụng cụ khác  Dụng cụ chấm sắc ký: ống mao quản, micropipet  Tủ sấy giấy sắc ký  Bình phun thuốc thử hay khay nhúng thuốc thử  Kẹp plastic, inox Quá trình kỹ thuật sắc ký  Chuẩn bị: bình sắc ký, dung môi, giấy sắc ký  Chấm dung dịch lên giấy  Khai triển sắc ký  Phát vết giấy  Màu sắc tự nhiên vết  Phun thuốc thử cho màu đặc trưng  Soi UV  Vị trí vết sắc ký đồ: Rf hay Rs Các kỹ thuật khai triển SKG  Sắc ký lên Phương pháp Sắc ký lên Đầu giấy có chấm chất phân tích nhúng vào dung môi đáy bình Pha động chạy lên nhờ lực hút mao quản Giấy kiểu dụng cụ Chậu đựng dung môi Ưu điểm - Dụng cụ đơn giản - Thao tác nhanh - Có thể định lượng tách chất có Rf khác xa Nhược điểm Trọng lực tác dụng ngược chiều với lực hút mao quản nên tốc độ hút giảm nhanh chạy lên Các kỹ thuật khai triển SKG  Sắc ký xuống Phương pháp Sắc ký xuống Đầu giấy có chấm chất phân tích nhúng vào máng dung môi Pha động chạy từ xuống nhờ trọng lực Giấy kiểu dụng cụ Ưu điểm Nhược điểm - Có thể tách Dụng cụ phức chất có Rf khác tạp phương nhỏ pháp khác - Có thể định lượng Các kỹ thuật khai triển SKG  Sắc ký ngang – Sắc ký hình tròn Phương pháp Sắc ký ngang Giấy cắt hình vuông hình chữ nhật đặt nằm ngang đũa thủy tinh Đầu giấy chấm chất phân tích nhúng vào chậu dung môi Phương pháp Sắc ký hình tròn Giấy cắt hình tròn, có bấc, nhúng vào chén dung môi Pha động từ tâm theo vòng tròn Giấy kiểu dụng cụ Giấy kiểu dụng cụ Ưu điểm - Dụng cụ đơn giản đặt tủ ấm tủ lạnh - Định lượng nhanh đường, acid amin, chất béo Ưu điểm Nhược điểm - Thao tác nhanh - Vùng tách nhỏ, xác - Hiệu ứng tách cao phương pháp - Chỉ dùng để định tính - Việc so sánh với chất mẫu có khó khăn Ứng dụng SKG  Định tính thử tinh khiết  Dựa vào Rf  Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A sắc đồ  Điều kiện X A: Rf(X) = Rf(A) với hệ dung môi khác  Chất thử coi tinh khiết sắc ký đồ vết lạ  Bán định lượng – định lượng  Đo chiều dài hay đo diện tích vết (bằng máy, cách cân khoanh giấy có vết, đếm ô vuông,…)  Đo cường độ màu vết (bằng máy, mắt)  Phương pháp rửa: cắt khoanh giấy có vết, chiết dung môi định lượng phương pháp thích hợp Ứng dụng SKG  SKG theo chế kết tủa  Giấy chất mang chứa thuốc thử làm kết tủa  Pha động chứa chất tan  Sự tạo thành kết tủa xảy bề mặt giấy tương tác phân tử thuốc thử bị hấp phụ giấy với ion pha động  Một số ion sắc ký kết tủa giấy Ion Al3+ Ag+ Bi3+ Hg2+ Chất làm kết tủa K4Fe(CN)6 4% KI KI KI Hàm lượng chất kết tủa (%) 5 Thuốc thử phát - màu Alizarin - đỏ vàng đen đỏ Ưu nhược điểm SKG  Ưu điểm:  Kỹ thuật dụng cụ đơn giản, dễ thực  Phương pháp vi phân tích lượng mẫu cần dùng nhỏ ( g)  Có thể ứng dụng để xác định nhiều tiêu định tính, định lượng, xác định tạp liên quan,…  Hiện phương pháp đơn giản để tách phát hợp chất có chứa nguyên tố phóng xạ  Nhược điểm:  Không làm sắc ký chế hóa SKG  Không dùng hóa chất có tính ăn mòn phát vết  Thời gian khai triển lâu từ - (thậm chí từ -3 ngày)  Giấy dễ hấp phụ chất khác có môi trường nên phải bảo quản giấy sắc ký thật kỹ  ... bị: bình sắc ký, dung môi, giấy sắc ký  Chấm dung dịch lên giấy  Khai triển sắc ký  Phát vết giấy  Màu sắc tự nhiên vết  Phun thuốc thử cho màu đặc trưng  Soi UV  Vị trí vết sắc ký đồ:... dung môi 40 cm Đặc điểm 12,5 9 15 15 13,5 12,5 giờ Giấy chuẩn Giấy chuẩn Giấy chuẩn Tách nhiều chất Nhanh Trang thiết bị – Giấy sắc ký  Giấy FN Giấy FN số Trọng lượng (g/m2) 85-90 120-125 85-90... SKG  Sắc ký ngang – Sắc ký hình tròn Phương pháp Sắc ký ngang Giấy cắt hình vuông hình chữ nhật đặt nằm ngang đũa thủy tinh Đầu giấy chấm chất phân tích nhúng vào chậu dung môi Phương pháp Sắc