KIỂM NGHIỆM bài sắc ký cột

Sắc ký cột Nguyên lí tách sắc kí cột loại sắc kí khác: -một mẫu thử nạp lên cột chứa chất hấp phụ (thường silica gel, nhôm oxyt) Biên soạn: PGS TS Võ thị Bạch Huệ 01/2015 Sắc ký cột - Cột chứa chất hấp phụ đóng vai trị pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột làm di chuyển cấu tử mẫu thử, cấu tử có độ phân cực khác nên lực chúng với pha tĩnh khác nhau, chúng bị dung môi giải hấp bị đẩy với vận tốc khác tạo dải riêng biệt có vị trí khác khỏi cột thời điểm khác nhau, làm sở cho việc phân tích định tính định lượng 1/- Mở đầu Pha tĩnh nhồi sẵn vào cột phía lớp (sẽ ngăn vật rắn chảy vào dịch thu được) thêm lớp mỏng cát Nếu không cẩn thận nạp mẫu thử vào dẫn đến làm xáo trộn pha tĩnh hiệu suất chiết xuất sẽ thấp cần thêm lớp cát vào phía pha tĩnh để ổn định cột Điều quan trọng không để pha tĩnh trạng thái khơ khơng có bọt khí Vì phải ln giữ cho pha tĩnh bao phủ bới pha động Bởi silica gel nhơm oxyt tạo lớp dày, q trình chiết tách có xu hướng nhiều thời gian trọng lực lực kéo pha động Q trình tăng tốc việc tăng áp suất đầu cột hay chân khơng phía cột 2.1/- Pha tĩnh Loại chất sử dụng làm pha tĩnh chất hấp phụ, thay đổi theo độ phân cực chất cần phân lập Hiện phổ biến silicagel nhôm oxyt, chất hấp phụ phân cực (chất hấp phụ pha thuận), chúng dùng để phân lập chất có độ phân cực yếu đến độ phân cực trung bình Cỡ hạt hấp phụ: Cỡ hạt nhỏ (15- 40μm), cỡ hạt trung bình (40- 63μm), cỡ hạt thơ (63- 200μm) 2.2/- Cách thức chuẩn bị cột sắc ký Cột sắc ký thường ống thủy tinh có đường kính từ 50mm trở lên, chiều cao từ 50cm đến 1m với vịi phía Chiều cao cột vừa phải, cao khả tách hiệu nguy mẫu lớn Cột rửa sạch, sấy khô, gắn trên giá vững 1/- Mở đầu 3/- PHƯƠNG PHÁP NHỒI CỘT: 3.1/- Phương pháp khô: Cột điền đầy với bột pha tĩnh khơ, sau bổ sung pha động từ từ pha tĩnh hồn tồn ướt, kể từ thời điểm khơng phép để cột khô 1/- Mở đầu 3/- PHƯƠNG PHÁP NHỒI CỘT: 3.2/- Phương pháp ướt: Một hỗn dịch tương đối lỗng, tạo từ chất hấp phụ hịa dung môi nền, đổ cẩn thận vào cột chứa lớp dung môi nằm lớp bơng đáy cột Mở khóa cột tối đa Chú ý phải loại trừ bong bóng khí cách cho từ từ thường xuyên vỗ nhẹ cột Cố gắng đưa tồn khối hỗn dịch lần rót Từ thời điểm không để khối bột khô 4/- ỔN ĐỊNH CỘT: Cột vị trí thẳng đứng, nén cột nút cao su gõ nhẹ quanh cột đến khơng cịn bọt cột, mặt thống phẳng khơng tụt xuống Sau nén cột cho dung môi chảy qua cột thời gian thích hợp tùy theo kích thước để ổn định cột Cột ổn định băng tách sẽ phẳng gọn Các kỹ thuật 5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN CộT 5.1/- Mẫu sắc ký Cần xác định rõ hợp chất cần chiết xuất Quy trình chiết xuất phải phù hợp với nhóm hợp chất Mẩu thử trước phân tích phải loại tạp phương pháp thích hợp Các kỹ thuật 5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN CộT 5.1/- Mẫu sắc ký Mẩu thử dạng bột khơ thường dạng dung dịch đậm đặc (không đậm đặc) dung môi không phân cực so với hệ dung môi dùng để khai triển cột Lý tưởng dung môi hệ dung môi pha động 10 Các kỹ thuật 5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN CộT 5.1/- Mẫu sắc ký Nều mẫu khó hịa tan dung mơi nền, dùng dung mơi khác phân cực dung mơi để hịa tan mẫu VD: Pha động Benzen - EtOAc tốt hịa tan mẫu Benzen, mẫu khơng tan Benzen dùng dung mơi phân cực Benzen chút (CH2Cl2, CH3Cl, hỗn hợp Benzen - EtOAc) để hòa tan mẫu Mẫu dạng bột khô: trộn dung dịch mẫu với giá tơi xốp vừa đủ, bốc hết dung mơi thu bột màu chất mịn tơi xốp 11 5.2/- Đưa mẫu lên cột Nạp mẫu dạng bột khơ (ít sử dụng) Rắc mẫu lên lớp dung môi vừa đủ đỉnh cột Chú ý: Lớp dung môi chừa lại đỉnh cột phải dư so với khả hút dung môi lượng bột mẫu Nạp mẫu dạng dung dịch Dùng pipet khắc độ pipet Pasteur đủ dài có gắn bóp bình lắng gạn có đầu dài đưa nhẹ nhàng dung dịch mẫu vào lớp dung môi chừa đỉnh cột Nạp mẫu xong, mở khóa cột chậm cho toàn dung dịch mẫu thấm vào chất hấp phụ Dùng dung mơi hịa tan mẫu rửa lịng cột vài lần đến dịch rửa trở nên suốt khơng màu Trong rửa vẫn mở khóa cho chảy với tốc độ thích hợp Từ trở tuyệt đối khơng để nứt cột 12 6/- DUNG MƠI SẮC KÝ: Cách lựa chọn dung mơi Tìm dung mơi sắc ký dựa vào tài liệu tham khảo thường vẫn phải dị tìm hệ dung mơi phương pháp SKLM chủng loại pha tĩnh Hệ dung môi nên gồm tối đa thành phần sau chạy xong sắc ký đồ SKLM cho kết quả: Các vết có di chuyển, có tách nhau, không bị kéo thành vệt dài Các vết cần tách có Rf khoảng 0.25 – 0.35 Các vết đối tượng cần nghiên cứu Ghi nhận hệ dung môi vừa chọn, xác định dung môi (là dung môi phân cực hệ trên) Dung môi ưu tiên hòa tan chất hấp phụ nhồi cột, hịa tan mẫu nạp cột làm dung mơi đầu khai triển cột 6/- DUNG MÔI SẮC KÝ: Chú ý: Khơng nên khai triển cột sắc kí với hệ dung môi vừa chọn SKLM mà phải dùng hệ dung môi dãy phân cực để chạy cột Thay đổi dung mơi q trình sắc ký (sự tăng dần độ phân cực dung môi): Dung môi thay đổi cho độ phân cực thay đổi không đột ngột Tỷ lệ dung môi phân cực (B) hệ dung môi (A - B) sẽ tăng từ từ Dung môi sẽ thay đổi vào thời điểm lượng dung môi cũ cột gần hết Thận trọng thay đổi dung môi dung môi phân cực mạnh 7/- PHÁT HIỆN VÀ THU NHẬN KẾT QUẢ SẮC KÝ Theo dõi khả tách: quan sát màu, chấm SKLM silica gel F254 soi UV Thu phân đoạn: Hứng sớm tốt phân lập chất không màu Để gộp phân đoạn: Theo dõi băng SKLM, gộp ống hứng có sắc ký đồ giống nhau, ghi lai thể tích phân đoạn gộp Báo cáo kết quả: phải ghi rõ thông số chi tiết Khi kiểm tra thành phần phân đoạn, ln chấm kèm mẫu tồn phần để tiện theo dõi Các thành phần thu sau sắc ký sử dụng phương pháp đo UV, huỳnh quang, HPLC, GC,… để tiến hành kiểm tra, đánh giá, nhận biết xác thành phần có mẫu 15 8/- ƯU VÀ NHƯỢC ĐIỂM 8.1/- Ưu điểm: Có thể sử dụng hai lĩnh vực phân tích điều chế Sắc ký cột dùng để xác định số lượng thành phần hỗn hợp mà cịn dùng để tách tinh chế thành phần phân tích Pha tĩnh dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm; triển khai với lượng lớn mẫu chất 8.2/- Nhược điểm Khi chạy cột sắc ký cần đòi hỏi ý theo dõi liên tục đễ trì mức dung mơi khơng sẽ dễ gây xuất bọt khí làm tắc cột, nứt cột, biến dạng đường dung môi Chạy cột tốn thời gian và công việc lặp lặp lại, đặc biệt chạy mẫu lớn Quá trình tách chậm hiệu thấp so với sắc ký lỏng cao 16 áp http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm 9/- ỨNG DỤNG Phân lập hormon tăng trưởng steroid, hormon sinh dục hợp chất liên quan Rửa giải thuốc trừ sâu Tách thuốc trừ sâu gốc clo Phân lập kháng sinh Tách chất lipid Phân lập alkaloid Tách hợp chất chứa nito từ hydrocarbon Làm tinh khiết dược liệu Tách hợp chất vòng thơm từ hỗn hợp mạch thẳngvòng thơm Phân tích vitamin Khử màu dầu, chất béo sáp phương pháp 17 thấm lọc  ... thức chuẩn bị cột sắc ký Cột sắc ký thường ống thủy tinh có đường kính từ 50mm trở lên, chiều cao từ 50cm đến 1m với vòi phía Chiều cao cột vừa phải, cao khả tách hiệu nguy mẫu lớn Cột rửa sạch,... bột khô 4/- ỔN ĐỊNH CỘT: Cột vị trí thẳng đứng, nén cột nút cao su gõ nhẹ quanh cột đến khơng cịn bọt cột, mặt thống phẳng không tụt xuống Sau nén cột cho dung mơi chảy qua cột thời gian thích... thích hợp tùy theo kích thước để ổn định cột Cột ổn định băng tách sẽ phẳng gọn Các kỹ thuật 5/- CHUẩN Bị MẪU SắC KÝ, ĐƯA MẫU LÊN CộT 5.1/- Mẫu sắc ký Cần xác định rõ hợp chất cần chiết xuất