ỨNG DỤNG sắc kí lớp MỎNG và sắc kí KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM một số LOẠI TINH dầu

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ MAI ỨNG DỤNG SẮC KÍ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ \ HÀ NỘI - 2014 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ MAI ỨNG DỤNG SẮC KÍ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Lê Thanh Bình Nơi thực : Bộ môn Dƣợc liệu HÀ NỘI - 2014 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới ThS Lê Thanh Bình TS Nguyễn Quỳnh Chi, Bộ môn Dược Liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội, người truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu giúp em có thêm nhiều kiến thức sống Bằng kiến thức kinh nghiệm quý báu học được, em hoàn thành khoá luận đồng thời có thêm hành trang chuẩn bị bước vào nghề Em xin chân thành cảm ơn thầy cô anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược Liệu tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện để em hoàn thành khoá luận cách tốt Cảm ơn thầy cô giáo cung cấp cho em kiến thức quý báu suốt năm qua Và em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè bên cạnh tin tưởng, động viên em giúp em có kết ngày hôm Hà Nội, tháng năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mai WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… CHƢƠNG TỔNG QUAN…………………………………………… 1.1 Tổng quan sắc kí lớp mỏng ……………………………… 1.1.1 Giới thiệu chung phương pháp ………………………… 1.1.2 Ứng dụng SKLM kiểm nghiệm dược liệu ……… 1.1.3 Ứng dụng SKLM kiểm nghiệm tinh dầu ………… 1.2 Tổng quan sắc kí khí - khối phổ ……………….……………… 1.2.1 Sắc kí khí ……… ………………………………………… 1.2.2 Detector khối phổ sắc kí khí ………………………… 1.2.3 Ứng dụng sắc kí khí kiểm nghiệm …………….… 1.2.4 Ứng dụng sắc kí khí - khối phổ kiểm nghiệm tinh dầu …………………………………………………… 1.3 Tổng quan dƣợc liệu nghiên cứu ………………………… 1.3.1 Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth., Lamiaceae)………………………………………………… 1.3.2 Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng, Lamiaceae)………………………………………………… 10 1.3.3 Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L., Lamiaceae) … 11 1.3.4 Hương nhu tía (Ocimum sanctum L., Lamiaceae) ……… 12 1.3.5 Tràm Úc (Melaleuca alternifolia (Maiden Betche) Cheel, Myrtaceae)………………………………………………… 12 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 1.3.6 Tràm dài (Melaleuca cajuputi Pwell, Myrtaceae) ……… 13 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 14 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị …….……………………………………… 14 2.1.1 Nguyên vật liệu ………….………………………………… 14 2.1.2 Hóa chất ………….………………………………………… 15 2.1.3 Thiết bị ………….………………………………………… 15 2.2 Nội dung nghiên cứu……………………………………………… 15 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………… 15 2.3.1 Chiết xuất xác định hàm lượng tinh dầu phương pháp cất kéo nước……………………………………… 16 2.3.2 Phân lập chất đối chiếu phương pháp sắc kí cột ……… 16 2.3.3 Định tính mẫu tinh dầu phương pháp SKLM …… 17 2.3.4 Định tính mẫu tinh dầu phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ …………………………………………… 17 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 18 3.1 Chiết xuất, xác định hàm lƣợng tinh dầu mẫu dƣợc liệu nghiên cứu ……………………………………………………… 18 3.2 Định tính mẫu tinh dầu phƣơng pháp SKLM ………… 18 3.2.1 Tinh dầu Hoắc hương ………………………………… 18 3.2.2 Tinh dầu Húng chanh 21 3.2.3 Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía 24 3.2.4 Tinh dầu Tràm Úc, Tràm dài …………………………… 28 3.3 Định tính mẫu tinh dầu phƣơng pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ ……………………………………………………… 31 3.3.1 Tinh dầu Hoắc hương …………………….………………… 31 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 3.3.2 Tinh dầu Húng chanh ……………………………………… 34 3.3.3 Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía ………………… 36 3.3.4 Tinh dầu Tràm Úc, Tràm dài …………………………… 38 3.4 Bàn luận …………………………………………………………… 41 3.4.1 Về chiết xuất xác định hàm lượng tinh dầu mẫu dược liệu nghiên cứu ……………………………… 3.4.2 Về định tính mẫu tinh dầu phương pháp SKLM 41 44 3.4.3 Về định tính mẫu tinh dầu phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ …………………………………………… 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT…………………………………………… 48 Kết luận …………………………………………………… 48 Đề xuất ……………………………………………………… 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẲT DĐVN: Dược điển Việt Nam GC-MS: Sắc kí khí kết hợp khối phổ NXB: Nhà xuất SKK: Sắc kí khí SKLM: Sắc kí lớp mỏng WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM Bảng 2.1 Các mẫu dược liệu sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu mẫu dược liệu nghiên 18 cứu Bảng 3.2 Kết phân tích mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi 32 GC-MS Bảng 3.3 Kết phân tích tinh dầu Hoắc hương khô GCMS 33 Bảng 3.4 Kết phân tích tinh dầu Hoắc hương ủ GC6 MS 34 Bảng 3.5 Kết phân tích tinh dầu Húng chanh GC-MS 35 Bảng 3.6 Kết phân tích tinh dầu Hương nhu trắng GCMS Bảng 3.7 Kết phân tích tinh dầu Hương nhu tía GCMS 37 38 10 Bảng 3.8 Kết phân tích tinh dầu Tràm Úc GC-MS 39 11 Bảng 3.9 Kết phân tích tinh dầu Tràm dài GC-MS 40 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên bảng Trang Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo máy sắc kí khí Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ Hình 2.1 Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến 16 Hình 3.1 Hình ảnh sắc kí đồ mẫu tinh dầu Hoắc hương quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử màu 20 Hình 3.2 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Húng chanh quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm ánh sáng thường sau 23 phun thuốc thử màu Hình 3.3 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 26 Hình 3.4 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử 27 màu Hình 3.5 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm Úc, Tràm dài quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử màu 30 WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với phát triển sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu nói chung, số lượng chủng loại tinh dầu thị trường Việt Nam ngày tăng cao Tuy nhiên biện pháp kiểm soát chất lượng tinh dầu chưa thực quan tâm, làm để đánh giá chất lượng tinh dầu câu hỏi lớn Trong sắc ký lớp mỏng (SKLM) sắc ký khí (SKK) hai phương pháp bắt buộc phải tiến hành đánh giá chất lượng tinh dầu theo quy định tất chuyên luận tinh dầu Dược điển Châu Âu theo thống kê, Dược điển Việt Nam IV có chuyên luận tinh dầu tổng số 283 chuyên luận dược liệu Đặc biệt chưa có chuyên luận quy định sử dụng phương pháp sắc ký khí, có chuyên luận quy định sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để đánh giá chất lượng tinh dầu Điều cho thấy quy định kiểm nghiệm tinh dầu nước ta chưa trọng; phương pháp kiểm nghiệm tiên tiến đại chưa áp dụng phổ biến kiểm nghiệm tinh dầu Do cần có thêm nhiều nghiên cứu tinh dầu đồng thời áp dụng kỹ thuật tiên tiến sẵn có vào công tác kiểm tra đánh giá chất lượng loại tinh dầu lưu hành Vì đề tài: ―Ứng dụng sắc kí lớp mỏng sắc kí khí kiểm nghiệm số loại tinh dầu‖ thực với mục tiêu ứng dụng phương pháp SKLM sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) để phân tích nhằm đưa điều kiện sắc ký tối ưu kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dầu, tạo sở bước đầu cho việc xây dựng tiêu chuẩn SKLM SKK số tinh dầu thường dùng Nội dung nghiên cứu khoá luận: Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu dược liệu nghiên cứu Định tính thành phần tinh dầu phương pháp SKLM Định tính thành phần tinh dầu phương pháp GC-MS WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 39 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM Kết phân tích sắc ký đồ tinh dầu Tràm Úc Tràm dài sau so sánh với thư viện phổ chuẩn trình bày Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.8 Kết phân tích mẫu tinh dầu Tràm Úc GC-MS DB-WAX STT Thời gian lƣu (phút) HP-5MS Hàm Tên chất lƣợng (%) Thời gian lƣu (phút) Hàm Tên chất lƣợng (%) 4,783 β-Pinen 0,23 7,360 α-pinen 0,90 6,330 β-Myrcen 0,56 9,716 β-pinen 0,28 6,868 α-Terpinen 1,58 10,817 β-myrcen 0,61 7,608 dl-Limonen 2,04 12,423 α-terpinen 1,93 8,094 1,8-Cineol 23,30 12,956 Cymen 1,93 9,938 γ-terpinen 5,81 13,207 dl-limonen 2,75 11,293 Cymen 2,10 13,335 1,8-cineol 28,85 12,038 α-terpinolen 1,29 15,194 γ-terpinen 6,43 24,237 α-gurjunen 0,21 17,010 α-terpinolen 1,29 10 27,019 0,19 22,095 4-terpineol 30,52 11 27,442 Aromadendren 0,55 22,837 α-terpineol 14,47 12 27,727 4-terpineol 35,63 33,286 α-Gurjunen 0,24 13 29,002 Alloaromadend —ren 0,28 34,521 aromadendren 0,53 14 31,075 leden/ viridifloren 0,82 35,449 Alloaromadendren 0,26 15 31,602 α-terpineol 16,50 36,903 Viridifloren 0,81 16 33,525 γ-cadinen 1,07 38,081 γ-cadinen 0,98 17 42,476 Epiglobulol 0,27 39,758 Cadinen 0,28 18 44,702 Viridiflorol 0,80 40,173 Spathulenol 0,17 19 45,966 Spathulenol 0,29 42,501 isospathulenol 0,24 20 48,328 γ-cadinol 0,17 42,662 α-cubeben 0,35 21 49,115 Isospathulenol 0,27 42,815 α-copaen 0,19 transcaryophyllen WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 40 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM Bảng 3.9 Kết phân tích tinh dầu Tràm dài GC-MS DB-WAX Thời gian STT lƣu (phút) 4,794 6,349 7,626 8,112 11,318 27,018 27,717 29,825 29,932 10 30,870 11 31,065 12 31,610 13 31,849 14 32,078 15 39,020 16 39,540 17 41,129 18 42,857 19 44,706 HP-5MS Tên chất Hàm lƣợng (%) β-pinen β-myrcen dl-limonen 1,8-cineol Cymen β-caryophyllen 4-terpineol γ-muurolen α-humulen α-muurolen β-cadinen α-terpineol β-selinen α-selinen α-calacoren α-ylangen caryophyllen oxid Ledol Viridiflorol 0,46 0,23 2,49 41,03 0,58 1,64 0,92 0,21 1,37 0,34 0,26 24,24 1,15 0,92 0,09 0,24 2,20 1,23 7,24 Thời gian lƣu (phút) 7,381 9,738 10,833 12,980 13,229 13,355 22,099 22,849 31,608 33,687 35,137 36,121 36,301 36,510 36,593 36,759 36,890 38,823 39,777 20 45,017 aromadendren 0,22 40,376 21 22 23 24 25 26 27 28 29 46,325 46,642 47,202 49,776 51,127 53,630 Neointermedeol α-cubeben α-Gurjunen β-eudesmen β-panasinen Farnesol 0,55 2,97 0,12 2,15 0,47 0,29 40,722 41,009 41,155 41,252 41,545 42,270 43,001 44,607 45,610 Tên chất α-pinen β-pinen β-myrcen Cymen dl-Limonen 1,8-cineol 4-terpineol α-terpineol α-ylangen β-caryophyllen α-Humulen α-Gurjunen α-Muurolen β-Selinen β-eudesmen Cadinen α-selinen α-calacoren Palustrol caryophyllen oxid Viridiflorol cis-α-bisabolen Ledol Germacren D Neointermedeol α-cubeben β-Guaien junipercamphor Farnesol Hàm lƣợng (%) 0,32 0,33 0,23 0,46 1,80 34,17 0,59 15,19 0,18 2,57 2,13 0,69 0,57 1,45 0,28 0,40 1,67 0,22 0,10 3,96 12,12 0,38 1,95 0,22 0,91 4,43 1,15 0,36 0,19 Nhận xét: - Tinh dầu Tràm Úc: WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 41 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM + Với cột DB-WAX: xác định có mặt 31 chất, 21 chất xác định tên, chiếm 93,96% mẫu tinh dầu nghiên cứu + Với cột HP-5MS: xác định có mặt 30 chất, 21 chất xác định tên, chiếm 94,01% mẫu tinh dầu nghiên cứu Kết phân tích cột DB-WAX HP-5MS cho thấy thành phần mẫu tinh dầu Tràm Úc 4-terpineol, tiếp đến 1,8-cineol - Tinh dầu Tràm dài: + Với cột DB-WAX: xác định có mặt 37 chất, 26 chất xác định tên, chiếm 93,61% mẫu tinh dầu nghiên cứu + Với cột HP-5MS: xác định có mặt 39 chất, 29 chất xác định tên, chiếm 89,02% mẫu tinh dầu nghiên cứu Kết phân tích cột DB-WAX HP-5MS cho thấy thành phần mẫu tinh dầu Tràm dài 1,8-cineol, tiếp đến α-terpineol 3.4 Bàn luận 3.4.1 Về chiết xuất xác định hàm lƣợng tinh dầu mẫu dƣợc liệu nghiên cứu * Về phương pháp: Trong trình thực nghiệm, hàm lượng tinh dầu mẫu dược liệu nghiên cứu xác định phương pháp cất kéo nước sử dụng dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến Việc sử dụng phương pháp tạo nhiều thuận lợi cho công việc thực nghiệm: Vừa đơn giản, thuận tiện, nhanh chóng lại chiết xuất tương đối triệt để, khai thác hết tinh dầu có nguyên liệu mà chi phí lại thấp Các thành phần tinh dầu mẫu dược liệu nghiên cứu tương đối bền với nhiệt nên tinh dầu cất giữ mùi nguyên liệu ban đầu Đặc biệt dược liệu Hương nhu trắng, Hương nhu tía, Tràm Úc, Tràm dài: Thời gian định lượng nhanh (2 tính từ thời điểm nước bắt đầu sôi) Đối với dược liệu Húng chanh, hàm lượng tinh dầu Húng chanh thấp (0,08%), yêu cầu lượng mẫu dược liệu nghiên cứu nhiều giảm sai số phép định lượng WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 42 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM Trong mẫu dược liệu nghiên cứu, riêng mẫu Hoắc hương thời gian cất tinh dầu tương đối dài, thường gấp đôi so với mẫu dược liệu khác (4 giờ) * Về hàm lượng tinh dầu: Hàm lượng tinh dầu mẫu dược liệu nghiên cứu tính theo khối lượng dược liệu khô tuyệt đối So sánh với hàm lượng tinh dầu dược liệu quy định DĐVN IV số tài liệu tham khảo Dược liệu học (Bộ Y tế), Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt Nam tất dược liệu nghiên cứu đạt tiêu chuẩn hàm lượng tinh dầu, cụ thể: - Tinh dầu Hoắc hương: DĐVN IV quy định định lượng tinh dầu Hoắc hương phương pháp cất kéo nước hàm lượng tinh dầu không 3% tính theo dược liệu khô tuyệt đối [5] Tuy nhiên tham khảo số tài liệu khác công bố hàm lượng tinh dầu Hoắc hương phụ thuộc vào việc xử lý nguyên liệu trước chưng cất Nếu tươi, hàm lượng đạt 0,38%, phơi khô hàm lượng đạt 2,6% ủ men đạt 2,7% [7] Để đánh giá hàm lượng tinh dầu mẫu dược liệu Hoắc hương sử dụng nghiên cứu này, dược liệu cất tinh dầu với ba mẫu: Lá tươi, phơi khô trực tiếp ánh nắng mặt trời ủ (ngày phơi bóng râm, tối ủ vào bao với nhiệt độ bao lên tới 45 - 500C), lặp lại tuần nguyên liệu khô Kết cho thấy mẫu dược liệu ủ đạt hàm lượng tương đối cao (2,92%), tiếp đến mẫu dược liệu tươi (1,89%) Mẫu dược liệu khô có hàm lượng thấp (1,19%) Để so sánh hàm lượng, mẫu dược liệu cất điều kiện nhiệt độ thời gian, nhiên trình cất tinh dầu, dễ nhận thấy việc cất tinh dầu từ tươi nhiều thời gian tạo bọt keo, khoảng thời gian tính từ thời điểm nước bắt đầu sôi xuất tinh dầu quan sát phận hứng tinh dầu dài Trong với hai mẫu tinh dầu Hoắc hương khô Hoắc hương ủ sau nước sôi bắt đầu quan sát tinh dầu phận hứng tinh dầu Như sản xuất tinh dầu với khối lượng lớn cần cân nhắc đến phương pháp xử lý nguyên liệu để thu tinh dầu với hàm lượng lớn khoảng thời gian cất rút ngắn - Tinh dầu Húng chanh: DĐVN IV không quy định hàm lượng tinh dầu Húng chanh Theo số tài liệu tham khảo, tinh dầu Húng chanh đạt 0,05-0,12% tính theo WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 43 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM dược liệu tươi [3], 0,02-0,09% tươi 0,5-1,2% khô tuyệt đối [8] Trong nghiên cứu này, hàm lượng tinh dầu Húng chanh đạt 0,08% tính theo dược liệu khô tuyệt đối Như mẫu dược liệu nghiên cứu co hàm lượng tinh dầu thấp - Tinh dầu Hương nhu trắng tinh dầu Hương nhu tía: DĐVN IV quy định dược liệu Hương nhu trắng Hương nhu tía phải chứa 0,5% tinh dầu tính theo dược liệu khô tuyệt đối [5] Trong số tài liệu tham khảo công bố hàm lượng tinh dầu lá, hoa cao 2,25% tính theo khối lượng khô tuyệt đối [7] Trong nghiên cứu này, hai mẫu dược liệu nghiên cứu Hương nhu trắng Hương nhu tía đạt hàm lượng tinh dầu cao (lần lượt 2,64% 2,53%) - Tinh dầu Tràm Úc: Tràm Úc chưa đưa vào tiêu chuẩn DĐVN IV, tham khảo số tài liệu thấy hàm lượng tinh dầu Tràm Úc đạt 1,8% [3] Trong nghiên cứu này, mẫu dược liệu Tràm Úc chứa tới 3,85% tinh dầu - Tinh dầu Tràm dài: DĐVN IV quy định hàm lượng tinh dầu Tràm thu phương pháp cất kéo nước không nhỏ 1% [5] Nguyên liệu sử dụng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn mặt hàm lượng tinh dầu (1,33%) 3.4.2 Về định tính mẫu tinh dầu phƣơng pháp SKLM Khả phân tích SKLM đa dạng, từ chất có độ phân cực tới chất phân cực trung bình tới mạnh Rất nhiều nhóm chất tự nhiên có tinh dầu phân tích sắc kí lớp mỏng Mặc dù khả tách không cao không nhạy GC-MS sắc kí lớp mỏng phương pháp phổ biến hữu ích phân tích dược liệu nói chung tinh dầu nói riêng Dược điển nhiều nước Việt Nam, Trung Quốc, Anh… sử dụng phương pháp sắc kí lớp mỏng tiêu chuẩn bắt buộc kiểm nghiệm tinh dầu Tuy nhiên, tham khảo chuyên luận quy định tiêu chuẩn tinh dầu DĐVN IV nhận thấy với dược liệu Hoắc hương Húng chanh, định tính tinh dầu yêu cầu đối chiếu với mẫu tinh dầu cất từ dược liệu chuẩn Trong vấn đề tìm mẫu dược liệu chuẩn dễ dàng Hơn nữa, tài liệu không mô tả cách tỉ mỉ cách đánh giá kết quả, yêu cầu mẫu tinh dầu thử phải có WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 44 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM vết màu sắc tương đương giá trị Rf với vết mẫu tinh dầu đối chiếu Việc mô tả gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm tinh dầu thực tế Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu này, để cụ thể hóa việc định tính mẫu tinh dầu phương pháp SKLM, mẫu tinh dầu nghiên cứu thử định tính với nhiều điều kiện khác lựa chọn điều kiện tối ưu dung môi pha loãng tinh dầu, mỏng sắc ký, hệ dung môi khai triển sắc ký, thuốc thử màu Các kết thể dạng hình ảnh rõ ràng, sau có khái quát thành dạng sơ đồ màu sắc vị trí tương đối vết mỏng sắc ký, điều tạo sở để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm tinh dầu cụ thể thuận lợi cho việc áp dụng tiêu chuẩn công tác kiểm nghiệm tinh dầu Đặc biệt, nghiên cứu này, từ mẫu tinh dầu nghiên cứu, thành phần phân lập với mục đích sử dụng làm chất đối chiếu định tính SKLM Các chất phân lập kiểm tra GC-MS để đảm bảo tính xác Việc sử dụng thêm chất đối chiếu thành phần có hàm lượng cao thành phần có vai trò quan trọng mẫu tinh dầu nghiên cứu như: patchouli alcol tinh dầu Hoắc hương, carvacrol tinh dầu Húng chanh, eugenol tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía, 1,8-cineol 4-terpineol tinh dầu Tràm Úc Tràm dài giúp tăng tính xác cho việc kiểm nghiệm tinh dầu SKLM Sau trình thực nghiệm, nhận thấy việc kiểm nghiệm tinh dầu bằng phương pháp SKLM vừa đơn giản lại tiết kiệm thời gian chi phí nhiều so với phương pháp GC-MS Mặc dù khả phát chất có giới hạn, phát chất có hàm lượng đủ lớn hoàn toàn sử dụng phương pháp để định tính số thành phần đặc trưng loại tinh dầu 3.4.3 Về định tính thành phần tinh dầu phƣơng pháp GC-MS * Về phương pháp: GC-MS phương pháp kĩ thuật phân tích đại hiệu phân tích tinh dầu nên ngày sử dụng rộng rãi Mặc dù thiết bị đắt tiền, WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 45 tất sở nghiên cứu hay sử dụng tinh dầu trang bị được, với phát triển kinh tế, đòi hỏi ngày cao tiêu chuẩn kiểm nghiệm để tránh việc nhầm lẫn, giả mạo dược liệu nói chung tinh dầu nói riêng, việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm GC-MS cần thiết Hiện nay, tất chuyên luận DĐVN IV quy định tiêu chuẩn tinh dầu chưa sử dụng kĩ thuật này, lại tiêu chuẩn bắt buộc quy định Dược điển Trung Quốc Dược điển Châu Âu Trong nghiên cứu này, khảo sát điều kiện tiến hành sắc kí khí cách chuẩn bị mẫu thử, lựa chọn cột sắc kí, chế độ tiêm mẫu, chương trình nhiệt độ cột sắc kí mẫu tinh dầu lựa chọn điều kiện sắc kí tối ưu cho loại tinh dầu đảm bảo thành phần tách khỏi rõ ràng hình ảnh sắc kí đồ Đặc biệt tinh dầu Tràm Úc tinh dầu Tràm dài, nghiên cứu trình bày kết phân tích tinh dầu hai loại cột sắc kí HP-5MS DB-WAX, HP-5MS cột trang bị với hệ thống GC-MS, DB-WAX cột đặt mua thêm, sở phân tích tinh dầu GC-MS Việt Nam, cột HP-5MS dùng phổ biến Tuy nhiên vấn đề gặp phải sử dụng loại cột để phân tích tinh dầu Tràm Úc Tràm dài hai thành phần dl-limonen 1,8-cineol không tách khỏi hoàn toàn, phần chân hai pic chồng chéo lên khảo sát với nhiều điều kiện sắc kí khác nhau, điều ảnh hưởng đến kết phân tích, đặc biệt gây sai số xác định hàm lượng thành (phụ lục 14 phụ lục 16) Vấn đề giải thay cột HP-5MS cột DBWAX (phụ lục 15 phụ lục 17) Do vậy, tinh dầu Tràm, việc sử dụng cột sắc kí DB-WAX cho kết phân tích xác * Về kết phân tích tinh dầu - Tinh dầu Hoắc hương Qua kết phân tích ba mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi, Hoắc hương khô Hoắc hương ủ GC-MS, nhận thấy thành phần hoá học mẫu tinh dầu tương tự Thành phần mẫu tinh dầu patchouli alcol với hàm WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 46 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM lượng cao (>60%) Ngoài có thành phần có hàm lượng cao 1% αbulnesen, α-guaien, seychellen, α-patchoulen, pogostol, caryophyllen, selinen Kết phù hợp với kết phân tích tinh dầu Hoắc hương công bố số tài liệu tham khảo [7] Tinh dầu Hoắc hương có giá trị cao, số tinh dầu có tác dụng định hương, quan trọng kỹ nghệ nước hoa xà phòng Đặc biệt, patchouli alcol hợp chất có vai trò định phẩm chất tinh dầu, theo quy định dược điển Trung Quốc tinh dầu Hoắc hương chứa không 26% patchouli alcol [15] Như mẫu dược liệu Hoắc hương sử dụng nghiên cứu vừa có hàm lượng tinh dầu cao, lại có chất lượng tốt với hàm lượng patchouli alcol cao - Tinh dầu Húng chanh Kết phân tích tinh dầu Húng chanh phương pháp GC-MS cho thấy mẫu tinh dầu nghiên cứu có thành phần carvacrol (52,22%) Ngoài có thành phần khác phù hợp với công bố tài liệu tham khảo terpinen, caryophyllen, caryophyllen oxid, α-humulen, 4-terpineol, cymen, eugenol [8] Tinh dầu Húng chanh có giá trị kinh tế cao, theo thành tựu nghiên cứu gần tác dụng sinh học cho thấy nguồn tài nguyên có nhiều triển vọng để khai thác phát triển quy mô sản xuất hàng hóa Mẫu dược liệu sử dụng nghiên cứu có hàm lượng tinh dầu chưa cao, lại chứa thành phần chủ yếu carvacrol - hợp chất có tác dụng định giá trị sử dụng tinh dầu - Tinh dầu Hương nhu trắng Hương nhu tía Kết phân tích GC-MS cho thấy thành phần tinh dầu Hương nhu trắng Hương nhu tía eugenol (lần lượt 84,98% 62,39%) Dược điển Trung Quốc quy định hàm lượng eugenol tinh dầu Hương nhu trắng không 65% [15] Ngoài tinh dầu Hương nhu trắng có thành phần đáng kể khác germacren D ocimen, tinh dầu Hương nhu tía có β-caryophyllen, elemen, caryophyllen oxid Các kết phân tích phù hợp với công bố tài liệu tham khảo thành phần tinh dầu Hương nhu trắng Hương nhu tía [3], [7] Như vậy, mẫu dược liệu Hương nhu trắng Hương nhu tía sử dụng nghiên WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 47 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM cứu có hàm lượng tinh dầu cao Đặc biệt tinh dầu Hương nhu trắng với hàm lượng eugenol cao cho thấy chất lượng tiềm khai thác nguyên liệu lớn - Tinh dầu Tràm Úc Tinh dầu Tràm Úc có giá trị sử dụng cao y học kỹ nghệ hương liệu Ở Việt Nam có kế hoạch trồng để khai thác tinh dầu [10] Tuy nhiên dược liệu chưa có tiêu chuẩn kiểm nghiệm DĐVN IV Kết phân tích mẫu tinh dầu Tràm Úc GC-MS cho thấy thành phần tinh dầu Tràm Úc 4-terpineol với hàm lượng 30%, có cineol (trên 20%) Những kết đóng góp bước đầu cho việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm tinh dầu khai thác từ dược liệu - Tinh dầu Tràm dài Việt Nam Inđônêsia hai nước có diện tích Tràm lớn Đây có giá trị sử dụng cao Tinh dầu Tràm khai thác sử dụng nhiều y học dân tộc nước ta nhiều nước khu vực Đông Nam Á Vì vậy, tiêu chuẩn kiểm nghiệm tinh dầu Tràm quy định DĐVN IV với hàm lượng 1,8-cineol không 40% Theo kết nghiên cứu này, thành phần tinh dầu Tràm nghiên cứu 1,8-cineol (hàm lượng 34,17% với cột HP-5MS 41,03% với cột DB-WAX) Như dược liệu sử dụng nghiên cứu đạt tiêu chuẩn hàm lượng 1,8-cineol, mức giới hạn WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Sau thời gian tiến hành thực nghiệm, đề tài đạt mục tiêu đề khoá luận: - Đã chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu mẫu dược liệu nghiên cứu, với hàm lượng cụ thể mẫu sau: Hoắc hương tươi chứa 1,89%, Hoắc hương khô chứa 1,19%, Hoắc hương ủ chứa 2,92%, Húng chanh chứa 0,08%, Hương nhu trắng chứa 2,64%, Hương nhu tía chứa 2,53%, Tràm Úc chứa 3,85%, Tràm dài chứa 1,33% - Đã lựa chọn điều kiện tối ưu để áp dụng phương pháp SKLM định tính mẫu tinh dầu Đồng thời phân lập thành phần từ mẫu tinh dầu gồm: patchouli alcol từ tinh dầu Hoắc hương, carvacrol từ tinh dầu Húng chanh, eugenol từ tinh dầu Hương nhu trắng, 1,8-cineol 4-terpineol từ tinh dầu Tràm Úc Sử dụng thành phần vừa phân lập để làm chất đối chiếu định tính mẫu tinh dầu nghiên cứu SKLM - Đã lựa chọn điều kiện để áp dụng phương pháp GC-MS định tính thành phần mẫu tinh dầu nghiên cứu Kết phân tích cho thấy tinh dầu Hoắc hương có hàm lượng patchouli alcol cao (trên 60%), tinh dầu Húng chanh có hàm lượng carvacrol cao (52,29%), tinh dầu Hương nhu trắng có hàm lượng eugenol cao (84,98%) hàm lượng Hương nhu tía 62,39%, Tràm Úc có hàm lượng 4-terpineol 1,8-cineol 30% 23%, Tràm dài có hàm lượng 1,8-cineol chưa cao (trên 34%) Đề xuất Trong khuôn khổ khoá luận, có dược liệu đưa vào nghiên cứu, nguồn tài nguyên tinh dầu Việt Nam phong phú ngày có nhiều sản phẩm tinh dầu lưu hành thị trường, nên để góp phần bổ sung sở dược liệu sắc kí lớp mỏng sắc kí khí kiểm nghiệm số dược liệu chứa tinh dầu, xin đưa đề xuất sau: WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON 49 WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM - Thu hái thêm mẫu dược liệu nghiên cứu địa điểm khác nhau, vào thời kì khác để đưa tiêu chuẩn kiểm nghiệm cách xác - Tiếp tục ứng dụng phương pháp SKLM GC-MS để phân tích đánh giá mẫu tinh dầu lưu hành phổ biến thị trường WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2006), Hoá phân tích - Tập II, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr108, 117, 161-163, 214-222 Bộ môn Dược liệu (2006), Thực tập dược liệu (phần hóa học), Trung tâm thông tin thư viện - Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 83-84 Bộ Y tế (2007), Dược liệu học - Tập II, NXB Y học, tr 231-232, 225-226 Uông Thị Ngọc Hà, Lê Ngọc Thạch (2012), ―Khảo sát tinh dầu từ Hoắc hương (Pogostemon cablin Benth.) thu hái thị trấn Cai Lậy‖, Tạp chí Dược học, T.52, (S.10) Hội Đồng Dược điển (2010), Dược Điển Việt Nam, NXB Y học, PL 12.13, PLL- 240, PLPL 5.2, PL 5.4 Nguyễn Thị Bích Huyền, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Châu Thị Thuý Hằng (2012), ―Khảo sát thành phần hoá học hoạt tính kháng vi sinh vật tinh dầu Húng chanh (Plectranthus amboinicus Lour.)‖, Tạp chí khoa học, tr.144147 Lã Đình Mỡi cộng (2001), Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt Nam - Tập I, NXB Nông nghiệp, tr 120-133, 154-161, 274-284 Lã Đình Mỡi cộng (2002), Tài nguyên thực vật có tinh dầu Việt Nam Tập II, NXB Nông nghiệp, tr 189-192 Trần Cao Sơn (2010), Định lượng số acid béo omega 3, omega omega đậu tương sản phẩm từ đậu tương kỹ thuật sắc kí khí khối phổ, Luận văn thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội 10 Nguyễn Thị Tâm (2003), Những tinh dầu lưu hành thị trường, NXB Khoa học kỹ thuật 11 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật, trtr 965-968 12 Phạm Hùng Việt (2005), Sắc kí khí - Cơ sở lý thuyết khả ứng dụng, NXB Đại học quốc gia WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM Tiếng anh 13 Carson, C.F Riley, T.V (2001), Safety, efficacy and provenance of tea tree (Melaleuca alternifolia) oil, Contact Dermatitis, 45(2):24 p.65-7 14 Carson, C.F.and Riley, T.V (1995), ―Antimicrobial activity of the major components of the essential oil of Melaleuca alternifolia‖, Journal of Applied Bacteriology, 78: 264–269 15 Chinese pharmacopoeia commission (2010), Pharmacopoeia of the people’s republic of China - volume I, The people’s republic of China 16 Hussin, N.Mondello, L Costa, R Dugo, P Yusoff, N.I.Yarmo, M.A.AbWahab, A.Said (2012), ―Quantitative and physical evaluation of patchouli essential oils obtained from different sources of Pogostemon cablin‖, Nat Prod Commun, 7(7): p 927-30 17 Joseph Sherma (2006), Thin-Layer chromatography, in Encyclopedia of Analytical Chemistry 18 K Husnu Can Baser, Gerhard Buchbauer (2009), Handbook of essential oils: Science, Technology, and Applications, CRC Press 991 19 Khan, A.Ahmad, A.Xess, I.Khan, L.A.Manzoor, N.(2014), ―Ocimum sanctum essential oil inhibits virulence attributes in Candida albicans‖, Phytomedicine, 21(4); p 448-52 20 Marriott, Philip J.Shellie, Robert Cornwell, Charles (2001), ―Gas chromatographic technologies for the analysis of essential oils‖, Journal of Chromatography A, 936(1–2): p 1-22 21 O.Motil, J.Hodacova, K.Ubik (1990), ―Composition of Vietnamese cajuput essential oil‖, Flavour and Fragrance Journal, 5(1): p 39-42 22 Pamela M Gorman, Hong Jiang (2004), Separation Science and Technology - volum 5, p 203-230 23 Poole, C.F (2013), THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY | Principles, in Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical Engineering, Elsevier WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM 24 Santiago, Marina Strobel, Scott (2013), Chapter Twenty-Four - Thin Layer Chromatography, in Methods in Enzymology, L Editor by Jon, Lorsch; Academic Press, p 303-324.9 25 Sherma, Joseph Fried, Bernard (2003), Handbook of thin-layer chromatography - Vol 89, CRC press WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM PHỤ LỤC Phụ lục Giấy chứng nhận mã số tiêu Phụ lục Biên giám định tên khoa học Phụ lục Hình ảnh sắc kí đồ patchouli alcol phân tích GC-MS Phụ lục Hình ảnh sắc kí đồ carvacrol phân tích GC-MS Phụ lục Hình ảnh sắc kí đồ eugenol phân tích GC-MS Phụ lục Hình ảnh sắc kí đồ 1,8-cineol phân tích GC-MS Phụ lục Hình ảnh sắc kí đồ 4-terpineol phân tích GC-MS Phụ lục Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hoắc hương tươi phân tích GC-MS Phụ lục Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hoắc hương khô phân tích GC-MS Phụ lục 10 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hoắc hương ủ phân tích GC-MS Phụ lục 11 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Húng chanh phân tích GC-MS Phụ lục 12 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng phân tích GC-MS Phụ lục 13 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu tía phân tích GC-MS Phụ lục 14 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm Úc phân tích GC-MS sử dụng cột HP-5MS Phụ lục 15 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm Úc phân tích GC-MS sử dụng cột DB-WAX Phụ lục 16 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm dài phân tích GC-MS sử dụng cột HP-5MS Phụ lục 17 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm dài phân tích GC-MS sử dụng cột DB-WAX WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON ... 1.2.1 Sắc kí khí ……… ………………………………………… 1.2.2 Detector khối phổ sắc kí khí ………………………… 1.2.3 Ứng dụng sắc kí khí kiểm nghiệm …………….… 1.2.4 Ứng dụng sắc kí khí - khối phổ kiểm nghiệm tinh dầu ……………………………………………………... tinh dầu đồng thời áp dụng kỹ thuật tiên tiến sẵn có vào công tác kiểm tra đánh giá chất lượng loại tinh dầu lưu hành Vì đề tài: Ứng dụng sắc kí lớp mỏng sắc kí khí kiểm nghiệm số loại tinh dầu ...WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ MAI ỨNG DỤNG SẮC KÍ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Lê Thanh