Ứng dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí trong kiểm nghiệm một số loại tinh dầu

ĐẶT VẤN ĐỀCùng với sự phát triển của các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu nói chung, số lượng và chủng loại tinh dầu trên thị trường Việt Nam cũng ngày càng tăng cao. Tuy nhiên hiện nay các biện pháp kiểm soát chất lượng tinh dầu còn chưa thực sựđược quan tâm, do đó làm thế nào để đánh giá chất lượng tinh dầu vẫn còn là một câu hỏi lớn.Trong khi hiện nay sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký khí (SKK) là hai phương pháp bắt buộc phải tiến hành khi đánh giá chất lượng tinh dầu theo quy định trong tất cả các chuyên luận tinh dầu của Dược điển Châu Âu thì theo thống kê, ở Dược điển Việt Nam IV chỉ có 7 chuyên luận về tinh dầu trên tổng số 283 chuyên luận về dược liệu. Đặc biệt chưa có chuyên luận nào quy định sử dụng phương pháp sắc ký khí, và chỉ có 4 chuyên luận quy định sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để đánh giá chất lượng tinh dầu.Điều đó cho thấy các quy định về kiểm nghiệm tinh dầu ở nước ta hiện nay chưa được chú trọng; các phương pháp kiểm nghiệm tiên tiến và hiện đại chưa được áp dụng phổ biến trong kiểm nghiệm tinh dầu. Do đó cần có thêm nhiều nghiên cứu về tinh dầu đồng thời áp dụng các kỹ thuật tiên tiến sẵn có vào công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng các loại tinh dầu đang lưu hành .Vì vậy đề tài: ―Ứng dụng sắc kí lớp mỏng và sắc kí khí trong kiểm nghiệm một số loại tinh dầu‖ được thực hiện với mục tiêu ứng dụng phương pháp SKLM và sắc ký khí kết hợp khối phổ (GCMS) để phân tích nhằm đưa ra điều kiện sắc ký tối ưu nhất trong kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dầu, tạo cơ sở bước đầu cho việc xây dựng tiêu chuẩn SKLM và SKK đối với một số tinh dầu thường dùng.Nội dung nghiên cứu của khoá luận:1. Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu trong các dược liệu nghiên cứu 2. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp SKLM3. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp GCMS

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ MAI

ỨNG DỤNG SẮC KÍ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM

MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

\

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ MAI

ỨNG DỤNG SẮC KÍ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM

MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS Lê Thanh Bình và

TS Nguyễn Quỳnh Chi, Bộ môn Dược Liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội, là

người đã truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu cũng như giúp em có thêm nhiều kiến thức về cuộc sống Bằng những kiến thức và kinh nghiệm quý báu học được,

em đã có thể hoàn thành khoá luận đồng thời có thêm hành trang chuẩn bị bước vào nghề

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược Liệu đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện để em có thể hoàn thành khoá luận một cách tốt nhất Cảm ơn các thầy cô giáo đã cung cấp cho em những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm qua

Và em cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè luôn ở bên cạnh tin tưởng, động viên em giúp em có được kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Mai

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……… 2

1.1 Tổng quan về sắc kí lớp mỏng ……… 2

1.1.1 Giới thiệu chung về phương pháp ……… 2

1.1.2 Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm dược liệu ……… 4

1.1.3 Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm tinh dầu ………… 5

1.2 Tổng quan về sắc kí khí - khối phổ ……….……… 5

1.2.1 Sắc kí khí ……… ……… 5

1.2.2 Detector khối phổ trong sắc kí khí ……… 7

1.2.3 Ứng dụng của sắc kí khí trong kiểm nghiệm ……….… 7

1.2.4 Ứng dụng của sắc kí khí - khối phổ trong kiểm nghiệm tinh dầu ……… 8

1.3 Tổng quan về các dược liệu nghiên cứu ……… 9

1.3.1 Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth., Lamiaceae)……… 9

1.3.2 Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng, Lamiaceae)……… 10

1.3.3 Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L., Lamiaceae) … 11

1.3.4 Hương nhu tía (Ocimum sanctum L., Lamiaceae) ……… 12

1.3.5 Tràm Úc (Melaleuca alternifolia (Maiden Betche) Cheel, Myrtaceae)……… 12

1.3.6 Tràm lá dài (Melaleuca cajuputi Pwell, Myrtaceae) ……… 13

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 14

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị …….……… 14

2.1.1 Nguyên vật liệu ………….……… 14

2.1.2 Hóa chất ………….……… 15

2.1.3 Thiết bị ………….……… 15

2.2 Nội dung nghiên cứu……… 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 15

2.3.1 Chiết xuất và xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước……… 16

2.3.2 Phân lập chất đối chiếu bằng phương pháp sắc kí cột ……… 16

2.3.3 Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM …… 17

2.3.4 Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ ……… 17

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 18

3.1 Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên cứu ……… 18

3.2 Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM ………… 18

3.2.1 Tinh dầu Hoắc hương ……… 18

3.2.2 Tinh dầu Húng chanh 21

3.2.3 Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía 24

3.2.4 Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài ……… 28

3.3 Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ ……… 31

3.3.1 Tinh dầu Hoắc hương ……….……… 31

3.3.2 Tinh dầu Húng chanh ……… 34

3.3.3 Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía ……… 36

3.3.4 Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài ……… 38

3.4 Bàn luận ……… 41

3.4.1 Về chiết xuất và xác định hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên cứu ……… 41

3.4.2 Về định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM 44 3.4.3 Về định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ ……… 45

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… 48

Kết luận ……… 48

Đề xuất ……… 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẲT

DĐVN: Dược điển Việt Nam

GC-MS: Sắc kí khí kết hợp khối phổ

NXB: Nhà xuất bản

SKK: Sắc kí khí

SKLM: Sắc kí lớp mỏng

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM 3

2 Bảng 2.1 Các mẫu dược liệu sử dụng trong nghiên cứu 14

7 Bảng 3.5 Kết quả phân tích tinh dầu Húng chanh bằng GC-MS 35

8 Bảng 3.6 Kết quả phân tích tinh dầu Hương nhu trắng bằng

9 Bảng 3.7 Kết quả phân tích tinh dầu Hương nhu tía bằng

10 Bảng 3.8 Kết quả phân tích tinh dầu Tràm Úc bằng GC-MS 39

11 Bảng 3.9 Kết quả phân tích tinh dầu Tràm lá dài bằng GC-MS 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo máy sắc kí khí 6

2 Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ 7

3 Hình 2.1 Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến 16

4 Hình 3.1 Hình ảnh sắc kí đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương quan

sát ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu 20

5

Hình 3.2 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Húng chanh quan sát dưới

ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và ánh sáng thường sau khi

phun thuốc thử hiện màu

23

6 Hình 3.3 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương

nhu tía quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 26

7

Hình 3.4 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương

nhu tía quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện

màu

27

8 Hình 3.5 Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài quan

sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu nói chung,

số lượng và chủng loại tinh dầu trên thị trường Việt Nam cũng ngày càng tăng cao Tuy nhiên hiện nay các biện pháp kiểm soát chất lượng tinh dầu còn chưa thực sự được quan tâm, do đó làm thế nào để đánh giá chất lượng tinh dầu vẫn còn là một câu hỏi lớn

Trong khi hiện nay sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký khí (SKK) là hai phương pháp bắt buộc phải tiến hành khi đánh giá chất lượng tinh dầu theo quy định trong tất cả các chuyên luận tinh dầu của Dược điển Châu Âu thì theo thống

kê, ở Dược điển Việt Nam IV chỉ có 7 chuyên luận về tinh dầu trên tổng số 283 chuyên luận về dược liệu Đặc biệt chưa có chuyên luận nào quy định sử dụng phương pháp sắc ký khí, và chỉ có 4 chuyên luận quy định sử dụng phương pháp sắc

ký lớp mỏng để đánh giá chất lượng tinh dầu

Điều đó cho thấy các quy định về kiểm nghiệm tinh dầu ở nước ta hiện nay chưa được chú trọng; các phương pháp kiểm nghiệm tiên tiến và hiện đại chưa được

áp dụng phổ biến trong kiểm nghiệm tinh dầu Do đó cần có thêm nhiều nghiên cứu

về tinh dầu đồng thời áp dụng các kỹ thuật tiên tiến sẵn có vào công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng các loại tinh dầu đang lưu hành

Vì vậy đề tài: ―Ứng dụng sắc kí lớp mỏng và sắc kí khí trong kiểm nghiệm

một số loại tinh dầu‖ được thực hiện với mục tiêu ứng dụng phương pháp SKLM

và sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) để phân tích nhằm đưa ra điều kiện sắc ký tối ưu nhất trong kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dầu, tạo cơ sở bước đầu cho việc xây dựng tiêu chuẩn SKLM và SKK đối với một số tinh dầu thường dùng Nội dung nghiên cứu của khoá luận:

1 Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu trong các dược liệu nghiên cứu

2 Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp SKLM

3 Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp GC-MS

 Nguyên tắc

Quá trình tách xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỉ lệ thích hợp Pha động thấm theo lớp mỏng chủ yếu dưới tác dụng của lực mao quản Trong quá trình di chuyển của pha động, nhờ các quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau, mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động với các tốc độ khác nhau Kết quả, mỗi chất trong hỗn hợp phân tích sẽ ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng nên được tách riêng [5], [17]

a – khoảng cách di chuyển của chất phân tích

b – khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ thời điểm chấm mẫu

Rf có giá trị từ 0 đến 1

Các yếu tố ảnh hưởng đến Rf trong SKLM bao gồm chất lượng và hoạt tính của chất hấp phụ; bề dày của lớp mỏng; tính chất, thành phần và độ tinh khiết của pha động; độ bão hoà dung môi trong bình sắc kí; phương pháp khai triển sắc kí; tốc

độ di chuyển của pha động; đoạn đường pha động đi được; vị trí đưa chất tan lên bản mỏng; lượng mẫu đưa lên bản mỏng; ảnh hưởng của các chất tan khác, chất tạo phức, pH, nhiệt độ; độ chính xác của phép đo khoảng cách…[1]

 Pha tĩnh

Pha tĩnh là các hạt có kích thước 10-30μm được rải đều và kết dính thành lớp

mỏng đồng nhất dày khoảng 250 μm trên giá đỡ hình vuông Bản mỏng có sẵn trên

thị trường có kích thước khác nhau, thường 5x20 cm hoặc 20x20cm, nhiều khi có thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích

Bảng 1.1: Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM

STT Pha tĩnh Cơ chế sắc kí Ứng dụng phân tích

1 Silica Hấp phụ Acid amin, hydrocarbon, alcaloid,

vitamin

2 Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực

3 Cellulose Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid

4 Alumina Hấp phụ Hydrocarbon, alcaloid, chất màu

thực phẩm, lipid

5 Cát biển Phân bố Đường, acid béo

6 Cellulose trao đổi

ion Trao đổi ion Acid nucleic, nucleotid, ion kim

loại, halogenid

7 Gel Sephadex Loại cỡ Polymer, protein, phức kim loại Trong đó Silicagel thường dùng nhất theo cơ chế sắc kí hấp phụ Các loại bản mỏng silica gel: Silicagel G: có trộn thạch cao 5%; Silicagel H: không trộn thạch cao; Silicagel GF254: có trộn thạch cao và chất huỳnh quang (fluorescent)[1][25]

 Pha động

Để tăng cường rửa giải, thường kết hợp 2 hay nhiều dung môi

Nguyên lí lựa chọn: Tuỳ thuộc tính chất phân cực và ái lực với pha tĩnh để chọn lựa dung môi sao cho phù hợp Khảo sát lựa chọn theo nguyên tắc tam giác

Stahl, nghĩa là muốn tách những chất không hoặc ít phân cực, phải dùng chất hấp phụ có hoạt năng cao và dung môi khai triển yếu (ít phân cực) hoặc ngược lại[1]

 Phát hiện sắc kí đồ

Phát hiện các vết tách dưới ánh sáng thường bằng mắt, quan sát được các vết

có màu Ngoài ra, có thể sử dụng hệ thống đèn tử ngoại với 2 bước sóng thường sử dụng là 254 nm và 366nm Cũng có thể quét bản mỏng qua bộ phận Scanner Densitometer trong khoảng bước sóng 200-800 nm để lựa chọn bước sóng phát hiện phù hợp Trong một số trường hợp cần dùng thuốc thử để hiện vết trên sắc kí đồ thì

sử dụng bình phun thuốc thử[1]

 Ưu điểm của phương pháp [1], [22], [23], [24], [25]

- Yêu cầu trang thiết bị cần thiết rất đơn giản

- Cho kết quả nhanh, rất thuận tiện cho theo dõi phản ứng, dự đoán nhanh các chất…

- Thời gian thực hiện ngắn

- Khá kinh tế nên rất hiệu quả trong thăm dò kết quả của nhiều quá trình khác nhau

 Nhược điểm [1]

- Khả năng phân tách còn hạn chế

- Không thể tự động hoá hoàn toàn

- Độ lặp lại Rf thấp do pha động thay đổi trong quá trình triển khai

- Tăng giãn rộng của pic sắc ký do khuếch tán vì tốc độ dòng pha động thấp

1.1.2 Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm dƣợc liệu [3], [24]

SKLM là một phương pháp được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: dược phẩm, hoá sinh, lâm sàng… để phân tích, kiểm nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn Đối với kiểm nghiệm nói chung và kiểm nghiệm dược liệu nói riêng, SKLM có thể được ứng dụng để phân tích định tính, thử tinh khiết và định lượng các hoạt chất trong mẫu phân tích

 Thử tinh khiết

Là một ứng dụng rất phổ biến của SKLM nhằm kiểm tra sự tinh khiết của các hợp chất: khai triển dung dịch mẫu với các hệ dung môi khác nhau để phát hiện các vết lạ ngoài vết chính của hợp chất

Một ứng dụng thử tinh khiết rất hay gặp khác của SKLM là sử dụng để nhận biết sơ bộ thành phần của hỗn hợp phản ứng, các phân đoạn chiết xuất, các phân đoạn của sắc kí cột…

 Định tính

Mỗi chất trong một hệ sắc kí có một giá trị Rf đặc trưng Do vậy để định tính một chất cụ thể ta cần so sánh Rf của mẫu thử với mẫu chuẩn tiến hành sắc kí trong cùng điều kiện Để việc định tính được chính xác, không được thay đổi điều kiện thực nghiệm khi so sánh và phải thực hiện một loạt phép đo để xác định giá trị trung bình

 Định lượng và bán định lượng

Bằng các biện pháp chính xác hoá lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể áp dụng SKLM để định lượng Tuỳ theo phương tiện sử dụng mà độ chính xác của phép định lượng ở cấp độ khác nhau

1.1.3 Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm tinh dầu

SKLM là một trong những kĩ thuật sắc kí đầu tiên đã và đang được sử dụng trong nhiều năm để phân tích tinh dầu Phương pháp này cung cấp các thông tin rất

có giá trị so với các phương pháp đơn giản khác vì vậy mà nó được thực hiện như là một tiêu chuẩn để mô tả đặc tính của tinh dầu trong Dược điển

Mặc dù rất đơn giản và thực hiện nhanh chóng, kĩ thuật này đang dần trở nên lỗi thời đối với phân tích các hỗn hợp phức tạp như tinh dầu Tuy nhiên, trong các cuộc khảo sát nhanh về các thành phần hoá học của tinh dầu hoặc sự khác nhau về thành phần tinh dầu của các loài, phương pháp này vẫn còn rất hữu ích [18]

tĩnh chứa trong cột Sắc kí khí được áp dụng để tách những chất hoặc dẫn xuất của chúng mà có thể hoá hơi ở nhiệt độ phân tích

Sắc kí khí dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc loại theo kích thước (dùng rây phân tử) [3], [12]

 Nguyên tắc [12]

Mẫu được bơm đưa vào trong và theo dòng khí mang (thường là N2) đưa lên cột sắc kí (pha tĩnh) Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó Sau

đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi đầu dò

Từ các tín hiệu nhận được, máy tính sẽ xử lí và biểu hiện kết quả bằng sắc kí đồ Các chất được xác định nhờ giá trị thời gian lưu (là thời gian từ khi bơm mẫu đến khi rửa giải) trên sắc kí đồ

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo máy sắc kí khí

 Ưu điểm của phương pháp[12]

- Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất

- Không cần làm bay hơi mẫu

- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

- Độ nhạy cao nhờ đầu dò

- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100μl)

- Dễ dàng kết hợp với khối phổ

 Nhược điểm[12]

- Máy móc hiện đại

- Yêu cầu phải có trình độ kĩ thuật, chuyên môn cao

1.2.2 Detector khối phổ trong sắc kí khí [18]

* Khái niệm

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hoá học bằng việc phân tách các ion phân tử hay các ion mảnh của phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z)

Về bản chất, có thể coi khối phổ là một loại detector, nhưng là một detector đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện, khối phổ còn có khả năng tách các chất đồng rửa giải dựa trên sự khác nhau về khối lượng của chúng

* Nguyên tắc hoạt động

Mẫu từ máy sắc kí khí đưa vào máy khối phổ sẽ được ion hoá trong buồng ion

để tạo các phần tử mang điện, sau đó được chuyển đến bộ phận lọc và phân tích khối để tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z Các ion được bộ phận phát hiện thu nhận, tín hiệu thu được chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ

 Cấu tạo

Máy khối phổ gồm có 3 bộ phận chính là: nguồn ion hoá, bộ phân tích khối và

bộ phát hiện [9]

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ

1.2.3 Ứng dụng của sắc kí khí trong kiểm nghiệm [1]

 Phân tích định tính

- So sánh thời gian lưu tR của chất phân tích với tR của chất chuẩn đối chiếu

trong cùng điều kiện sắc kí

- So sánh sắc kí đồ của mẫu phân tích với sắc kí đồ của mẫu phân tích đã thêm

chất chuẩn đối chiếu

- So sánh khối phổ của chất phân tích với chất chuẩn đối chiếu trong cùng điều

kiện sắc kí và so sánh phổ khối của chất phân tích với phổ khối các chất có trong

thư viện phổ Phương pháp này cho kết quả tin cậy nhất

 Phân tích định lượng

Sắc kí khí có thể ứng dụng để định lượng bằng một số phương pháp như:

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượng phần trăm của một thành phần

trong mẫu phân tích được xác định bằng tỉ số (tính theo phần trăm) giữa diện tích

pic của các thành phần đó và tổng diện tích các pic của tất cả các thành phần có mặt

trong mẫu (trừ pic của dung môi, thuốc thử và của các thành phần có hàm lượng

nhỏ hơn giới hạn phát hiện của chúng)

- Phương pháp ngoại chuẩn: Đường chuẩn được lập dựa trên mối tương quan

giữa các lượng chất chuẩn đối chiếu khác nhau và diện tích pic tương ứng của

chúng Nồng độ các chất phân tích trong mẫu thử được định lượng dựa trên đường

chuẩn này

- Phương pháp thêm chuẩn: Phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu cùng điều

kiện như phân tích mẫu bình thường Dựa trên lượng chuẩn thêm và tín hiệu các

mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn từ đó tính được nồng độ chất có trong

mẫu

- Phương pháp nội chuẩn: Trong phương pháp này, người ta chọn một chất

chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu Tỷ số

diện tích của các chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng

để xây dựng đường chuẩn

1.2.4 Ứng dụng của sắc kí khí - khối phổ trong kiểm nghiệm tinh dầu

Sắc kí khí - khối phổ là một kĩ thuật phân tích hiện đại và ngày càng được ứng

dụng rộng rãi, đặc biệt là trong lĩnh vực kiểm nghiệm tinh dầu Mặc dù thiết bị đắt

tiền và tốn nhiều thời gian hơn nhưng khả năng phân tách của GC-MS là vượt trội hơn hẳn so với các kĩ thuật phân tách khác [18]

Sự phù hợp của sắc kí khí đối với kiểm nghiệm tinh dầu: phạm vi khối lượng hoạt động của sắc kí khí là từ 2 (phân tử H2) đến khoảng 1500 đơn vị khối lượng; đồng thời các chất phải có khả năng hoá hơi tại nhiệt độ quy định Trong khi đó thành phần của tinh dầu chủ yếu là các terpenoid, có khối lượng phân tử khoảng dưới 400, và rất dễ bay hơi nên đặc biệt phù hợp để sử dụng sắc kí khí phân tích [20]

Sau khi qua cột sắc kí khí, các tinh dầu phức tạp có thể cho các pic chồng chất, che khuất nhau, nên sẽ luôn tồn tại một tỉ lệ không chắc chắn về mức độ tinh khiết của pic ghi chép được Khi đó khối phổ trở nên hiệu quả vì có thể nhận ra các pic chồng chất và xác định số lượng các thành phần tại vị trí xảy ra sự chồng chất pic [20]

Sắc kí khí tách các cấu tử riêng biệt của tinh dầu và định lượng tổng số cấu tử hiện diện Xác định đặc tính thực vật của tinh dầu bằng cách so sánh sự hiện diện và

số lượng của mỗi thành phần Sắc kí khí có thể sàng lọc các thành phần không tự nhiên, thành phần bị khuyết, hoặc các thành phần có tỷ lệ không tự nhiên cao, có biểu hiện pha trộn hay giả mạo Cùng với việc kết hợp với khối phổ, GC-MS có khả năng xác định các thành phần trong tinh dầu theo tên và phát hiện sự giả mạo[20] Tóm lại, các loại tinh dầu thường là một hỗn hợp phức tạp của rất nhiều chất khác nhau, trong đó có một số chất có cấu trúc hoá học tương tự nhau, đồng thời khả năng phân tách của SKLM lại rất hạn chế, nên việc sử dụng SKLM trong kiểm nghiệm tinh dầu gặp rất nhiều khó khăn Do khả năng phân tách tốt các hỗn hợp phức tạp chứa các thành phần dễ bay hơi như tinh dầu nên GC-MS có thể sử dụng trong cả định tính, thử tinh khiết, định lượng từng thành phần cấu thành trong tinh dầu

1.3 Tổng quan về các dược liệu nghiên cứu

1.3.1 Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth., Lamiaceae)

Từ lâu cây Hoắc hương đã được đưa trồng rộng rãi để lấy tinh dầu ở nhiều nước Đông Nam Á, đặc biệt là ở Inđônêsia và ở Trung Quốc Hiện nay, chúng được trồng ở các vùng nhiệt đới như châu Á và châu Phi với qui mô lớn để lấy tinh dầu Những nước sản xuất Hoắc hương nhiều nhất hiện nay là Ấn Độ, Malaysia, Philipin, Mangat, Inđônesia [11] Ở Việt Nam, cây Hoắc hương được biết từ rất lâu đời và được coi là một vị thuốc trong y học dân gian Cây hiện được trồng ở khắp các làng bản trên hầu hết các khu vực từ Bắc vào Nam Lá Hoắc hương có chứa tinh dầu, hàm lượng 2,2-2,6% (tính trên trọng lượng khô tuyệt đối) Nếu ủ men trước khi cất, có thể đạt hàm lượng cao hơn [4] Tinh dầu Hoắc hương là một hỗn hợp phức tạp của những chất hoá học khác nhau, trong đó thành phần chính là patchouli alcol (32-38%) - là thành phần quyết định phẩm chất tinh dầu; ngoài ra còn có chứa các hợp chất hydrocarbon sesquiterpenic như elemen, caryophyllen, patchoulen, guaien… Hoắc hương là vị thuốc dùng trong y học cổ truyền, tính ấm, vị cay đắng, tác dụng vào kinh vị và đại tràng, có tác dụng giải cảm nắng, thanh nhiệt ở tỳ vị trong trường hợp đầy bụng, ăn không tiêu, đi tả, nôn Hoắc hương cũng là một trong

số rất ít loài cho tinh dầu có tác dụng định hương Đây là nguồn nguyên liệu không thể thiếu trong các kĩnh vực hương phẩm và mỹ phẩm Tinh dầu Hoắc hương còn có tính kháng khuẩn nên được sử dụng trong nhiều chế phẩm diệt côn trùng, nhậy Tinh dầu Hoắc hương là loại tinh dầu có giá trị cao trên thị trường thế giới [2], [7],

16]

1.3.2 Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng, Lamiaceae)

Tên gọi khác: rau tần; tần dầy lá; cần dầy lá; rau thơm lùn

Húng chanh có nguồn gốc ở Inđônêsia, một số tài liệu lại ghi là ở Châu Phi Hiện chỉ gặp Húng chanh phân bố ở các khu vực thuộc vùng nhiệt đới Đến nay, Húng chanh đã được đưa trồng ở nhiều nước Đông Nam Á và Nam Á Ở nước ta, loài Húng chanh đã được đưa trồng rải rác ở nhiều địa phương từ Bắc vào Nam Chi Húng chanh gồm khoảng 200 loài và phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới Châu Phi được coi là trung tâm đa dạng và phong phú nhất của chi Húng chanh Trong hệ thực vật Việt Nam, chi Húng chanh hiện đã biết 7 loài

Lá Húng chanh có chứa tinh dầu, hàm lượng từ 0,05-0,12% (tính trên nguyên liệu tươi) Thành phần hoá học chủ yếu trong tinh dầu Húng chanh ở nước ta gồm:

carvacrol (39,5-82,8%); γ-terpinen (2,3-19,0%); α-terpinen (vết-16,8%);

β-caryophyllen (2,6-5,9%); α-bergamoten (1,9-3,0%); myrcen (vết-1,9%)… Húng chanh là cây lấy tinh dầu và được dùng làm gia vị trong chế biến thực phẩm, có tác dụng lợi phế, trừ đờm, chữa ho, chữa cảm sốt, tiêu chảy, sát trùng hoặc đắp lên các vết do rết và bọ cạp cắn.Tinh dầu Húng chanh có tác dụng chữa cảm, cúm, sốt cao, sốt không ra mồ hôi được, viêm phế quản, ho, hen, ho ra máu, viêm họng, khản tiếng, nôn ra máu, chảy máu cam Theo những nghiên cứu gần đây, tinh dầu Húng

chanh còn có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn như Staphylococcus, Shigella

flexneri, Shiga, Streptococcus, D.pneumoniae… Hoạt tính kháng sinh mạnh này của

Húng chanh là do nhóm các chất phenolic, đặc biệt là hàm lượng cao của các hợp chất carvacrol trong tinh dầu quyết định Trên thị trường ngày nay, tinh dầu Húng chanh là loại tinh dầu có giá trị rất cao, do đó cần có các phương pháp kiểm tra thích hợp để đảm bảo chất lượng tinh dầu lưu hành trên thị trường, hạn chế sự giả mạo [6], [8]

1.3.3 Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L., Lamiaceae)

Tên khác: É lớn lá; hương nhu

Hương nhu trắng được gieo trồng và mọc tự nhiên ở nhiều nước nhiệt đới và cận nhiệt đới Nguồn gốc của Hương nhu trắng là vùng nhiệt đới ở Châu Phi Cây Hương nhu trắng được trồng ở nhiều nơi trên thế giới: Liên Bang Nga, Ấn Độ, Sri Lanka Ở Việt Nam, cây mọc hoang và được trồng ở nhiều nơi Hương nhu trắng có chứa 0,78-1,38% tinh dầu (hoa 2,77%; lá 1,38%; toàn cây 1,14%, tính trên trọng lượng khô tuyệt đối) DĐVN IV quy định, dược liệu phải chứa ít nhất 1% tinh dầu Thành phần hoá học tinh dầu Hương nhu trắng rất đa dạng, trong đó eugenol là chất chính (60-70%), DĐVN IV quy định hàm lượng eugenol không dưới 60%; ngoài ra trong tinh dầu còn có D-germacren (8,8%), β-ocimen (7%)… Hương nhu trắng là nguồn nguyên liệu cất tinh dầu để tách eugenol dùng trong nha khoa và tổng hợp vanillin Tinh dầu Hương nhu còn là nguyên liệu để làm dầu cao xoa xuất khẩu

Hương nhu trắng còn được dùng làm thuốc chữa cảm mạo nhức đầu, xông cho ra

mồ hôi, chữa lở miệng, đau bụng Hương nhu trắng cũng có tác dụng chống viêm, giảm đau và hạ nhiệt… Tinh dầu Hương nhu trắng có thể được dùng thay thế cho một số loại tinh dầu khác có chất lượng cao hơn và giá trị hơn (tinh dầu đinh hương

và β-caryophyllen Hương nhu tía mới chỉ được dùng theo kinh nghiệm dân gian để chữa cảm sốt, đau bụng đi ngoài, nôn mửa, cước khí, thuỷ thũng Tinh dầu Hương nhu tía thể hiện tác dụng tốt trong điều trị nấm Candida [19] Ở nước ta, tinh dầu Hương nhu tía chưa được khai thác, sử dụng nhiều

1.3.5 Tràm Úc (Melaleuca alternifolia (Maiden Betche) Cheel, Myrtaceae)

Tên khác: Tràm lá hẹp, dầu trà

Có nguồn gốc từ Australia, được Viện Dược liệu di thực vào nước ta từ năm

1986 Lá Tràm Úc có chứa tinh dầu, thành phần hoá học chính của tinh dầu Tràm

Úc trồng ở Việt Nam gồm: terpinen-4-ol; terpinolen; 1,8-cineol… Tinh dầu Tràm

Úc được sử dụng nhiều trong Y tế, làm thuốc chữa các bệnh về đường hô hấp, thần kinh suy nhược, phong thấp, phù thũng… Ngoài ra, tinh dầu Tràm Úc còn có tác dụng sinh học kháng khuẩn và nấm nên được sử dụng để chữa các bệnh nhiễm trùng, bỏng, lở miệng, vết nứt, vết trầy teo lợi, hoại thư, bệnh lậu, nấm da chân… Tinh dầu Tràm Úc không gây kích ứng da ngay ở liều lượng cao Tinh dầu Tràm Úc

là loại tinh dầu rất quý [13], [14]

1.3.6 Tràm lá dài (Melaleuca cajuputi Pwell, Myrtaceae)

Tên khác: Khuynh diệp, chè đồng, chè cay

Tràm mọc nhiều ở vùng đồi núi, và đầm lầy của nhiều nước Đông Nam Á: Inđônêsia, Việt Nam, Philipin, Myanmar, Malaysia, Campuchia Ở Việt Nam, Tràm mọc ở cả hai miền Bắc và Nam nhưng tập trung nhiều ở các tỉnh phía Nam: Quảng Bình, Long An, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang… Lá Tràm có chứa tinh dầu Hàm lượng tinh dầu thay đổi theo từng vùng và theo mùa ở các tỉnh miền Trung DĐVN IV quy định hàm lượng tinh dầu Tràm không dưới 1% (tính trên nguyên liệu khô tuyệt đối) Thành phần hoá học chủ yếu trong tinh dầu Tràm là 1,8-cineol (20-60%); và các hợp chất khác có hàm lượng đáng kể như: sesquiterpen, alcol globulol, spathuleol, ngoài ra còn có một số thành phần khác với hàm lượng nhỏ như:

limonen; β-caryophyllen… Lá Tràm có tác dụng kháng khuẩn, giải cảm và giảm

đau nên được dùng để điều trị các vết thương, vết bỏng, cảm lạnh, cúm và ăn khó tiêu Lá Tràm đôi khi còn được sử dụng làm chè uống thay nước giúp tiêu hoá, chữa

ho hoặc xông giải cảm Tinh dầu Tràm và cineol có tác dụng sát khuẩn đường hô hấp, kích thích trung tâm hô hấp, chữa viêm nhiễm đường hô hấp Tinh dầu Tràm còn có tác dụng kháng khuẩn, làm lành vết thương, chữa bỏng, làm chóng lành da [3], [7], [21]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Các mẫu dược liệu sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các mẫu dược liệu sử dụng trong nghiên cứu

(Blanco) Benth.,

(Lour.) Spreng,

L., Lamiaceae

Lá tươi

Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc

Hà Nội, Viện Dược

L., Lamiaceae

Lá tươi

Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc

Hà Nội, Viện Dược

(Maiden Betche) Cheel, Myrtaceae

Lá tươi

Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc

Hà Nội, Viện Dược

Powell, Myrtaceae

Lá tươi

Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc

Hà Nội, Viện Dược

liệu

26/08/2013

Các mẫu dược liệu sau khi thu hái được giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại Học Dược Hà Nội, tiêu bản được lưu tại Phòng tiêu bản cây thuốc (HNIP) - Trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục I và phụ lục II)

2.1.2 Hoá chất:

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

- Các dung môi: ether dầu hoả, n-hexan, toluen, ethyl acetat, chloroform

- Thuốc thử: Vanillin-acid sulfuric gồm 2 dung dịch

+ Dung dịch 1: Vanillin 1% pha trong ethanol

+ Dung dịch 2: Acid sulfuric 10% pha trong ethanol

Trộn dung dịch 1 với dung dịch 2 theo tỉ lệ 1:1 (tt/tt) ngay trước khi sử dụng Sau khi phun, bản mỏng được sấy ở 110°C trong 5 phút để hiện màu

- Hệ thống SKK Agilent 7890A kết hợp khối phổ Agilent 5975C

- Pipet, ống đong, ống nghiệm thuỷ tinh…

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên cứu

- Phân lập các thành phần chính trong các mẫu tinh dầu để làm chất đối chiếu, định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM

- Định tính các mẫu tinh dầu nghiên cứu bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất và xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước [2]

Tinh dầu từ các mẫu dược liệu nghiên

cứu được chiết xuất và định lượng bằng

phương pháp cất kéo hơi nước sử dụng bộ

dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến (Hình

2.1)

Cách tiến hành: Cân chính xác tới

0,01g một lượng dược liệu (đã được chia

nhỏ qua rây số 2000) cho vào bình cất

Thêm 300 đến 500ml nước cất Lắp dụng

cụ Đun bình cho đến sôi, sau đó nếu

không có chỉ dẫn gì khác thì điều chỉnh tốc

độ cất sao cho cất được 2 – 3ml dịch cất

trong 1 phút Cất cho đến khi thể tích tinh

dầu thu được không tăng thêm nữa Ngừng

cất, sau ít nhất 10 phút đọc thể tinh dầu cất

được trong ống hứng

Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu

được tính theo công thức:

Trong đó: X: Hàm lượng phần trăm tinh dầu (ml/g)

a: Thể tích tinh dầu đọc được sau khi cất (ml)

b: Khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm (g)

Sau khi thu được tinh dầu, loại nước bằng natri sulfat khan, sau đó bảo quản tinh dầu trong lọ thuỷ tinh sẫm màu

2.3.2 Phân lập chất đối chiếu bằng phương pháp sắc kí cột

Bộ phận hứng tinh dầu nhẹ hơn nước

Bộ phận hứng tinh dầu nặng hơn nước

Hình 2.1 Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến

Các thành phần chính trong các mẫu tinh dầu nghiên cứu được phân lập bằng sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel pha thường, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm Theo dõi các phân đoạn bằng SKLM Nhận dạng chất phân lập được bằng hệ thống sắc kí khí kết hợp khối phổ, so sánh với thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor

2.3.3 Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM

Các mẫu tinh dầu nghiên cứu được pha loãng bằng dung môi hữu cơ thích hợp rồi đưa lên bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck) bằng máy CAMAG Linomat 5 với thể tích chính xác đến 0,1μl Bản mỏng được khai triển bằng hệ dung môi thích hợp Sắc ký đồ thu được sau khi khai triển sẽ quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm, 366 nm và hiện màu bằng thuốc thử vanillin- acid sulfuric, sau đó chụp ảnh bằng hệ thống CAMAG Reprostar 3

2.3.4 Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ

 Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu tinh dầu sau khi đã loại nước bằng natri sulfat khan được pha loãng trong dung môi chlorofom đến nồng độ 10-2

(tt/tt)

 Mẫu tinh dầu sau đó được phân tích trên trên hệ thống sắc kí khí (GC) Agilent 7890A kết nối với detector khối phổ (MS) 5975C, sử dụng cột HP-5MS hoặc DB-WAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm)

Các chất được nhận dạng dựa trên kết quả phổ khối, thời gian lưu, đối chiếu với thư viện phổ Wiley, Nist và Flavor

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên cứu

Tinh dầu được tách ra khỏi dược liệu bằng phương pháp cất kéo hơi nước Định lượng tinh dầu trong dược liệu bằng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến Mỗi mẫu được định lượng 3 lần, lấy giá trị trung bình Kết quả hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên cứu

Dược liệu Khối

lượng trung bình (g)

Độ ẩm trung bình (%)

Thời gian cất (tính từ thời điểm sôi) (giờ)

Thể tích tinh dầu trung bình (ml)

Hàm lượng phần trăm tinh dầu (%)

4

4

4

0,30 0,60 0,95

1,89 1,19 2,92 Húng chanh 300 82,67 3 0,04 0,08 Hương nhu

Nhận xét: Hàm lượng tinh dầu ở các mẫu dược liệu nghiên cứu đều cao trên

1%, riêng dược liệu Húng chanh có hàm lượng tinh dầu thấp (0,08%) Với dược liệu Hoắc hương, mẫu dược liệu ủ có hàm lượng cao nhất (2,92%), tiếp đến là mẫu dược liệu tươi (1,89%), thấp nhất là mẫu dược liệu khô với hàm lượng tinh dầu là 1,19%

3.2 Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM

3.2.1 Tinh dầu Hoắc hương

3.2.1.1 Phân lập patchouli alcol từ tinh dầu Hoắc hương

Tiến hành phân lập patchouli alcol từ tinh dầu Hoắc hương mẫu dược liệu ủ bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel, cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (Merck) Silicagel được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ rồi đem nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt Cột thủy tinh có khóa, có lót bông thủy tinh, đường kính 1cm, rửa sạch, sấy khô Trộn silicagel đã hoạt hóa bằng dung môi khai triển là n-hexan,

đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ Ổn định cột trong 2 giờ

Tinh dầu Hoắc hương được pha loãng bằng dung môi n-hexan với tỉ lệ 1 : 3 (tt/tt), sau đó đưa lên cột

Rửa giải bằng dung môi n-hexan, tốc độ rửa giải khoảng 20 giọt/phút Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm sạch, khô, mỗi ống khoảng 1ml

Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi Toluen: ethyl acetat (10 : 1) Kết quả thu được một phân đoạn cho 1 vết trên sắc ký đồ

Kiểm tra phân đoạn này bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ, với cột sắc ký WAX, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 50:1, sử dụng khí mang Heli với tốc

DB-độ khí mang 0,9 ml/phút Chương trình nhiệt DB-độ như sau:

Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) Cột 0-5 110

5-17 110-170 17-32 170 Nhiệt độ hóa hơi 250

Kết quả thu được một pic chính trên hình ảnh sắc ký đồ (phụ lục 3), so sánh kết quả khối phổ của pic này với các thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor cho thấy chất phân lập được là patchouli alcol

Patchouli alcol mới phân lập sẽ được sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh dầu Hoắc hương bằng SKLM

3.2.1.2 Định tính các mẫu tinh dầu Hoắc hương bằng SKLM

- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:

Ba mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi, Hoắc hương khô và Hoắc hương ủ được pha loãng trong dung môi ether dầu hỏa

Chất đối chiếu patchouli alcol trong dung môi n-hexan

- Tiến hành:

+ Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 (Merck), hoạt hoá ở

1100C trong 1 giờ

+ Chấm dịch chiết: Sử dụng máy CAMAG - Linomat 5

+ Hệ dung môi khai triển: Sau khi lựa chọn và khảo sát với một số hệ dung môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi Toluen: ethyl acetat (10 : 1) cho kết quả tách tốt nhất trên sắc ký đồ

+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi rồi hiện màu bằng thuốc thử vanillin-acid sulfuric

+ Chụp ảnh: sử dụng hệ thống CAMAG reprostar3 kết hợp với phần mềm winCATS

Kết quả sắc ký lớp mỏng các mẫu tinh dầu Hoắc hương với chất đối chiếu patchouli alcol, hệ dung môi khai triển Toluen: ethyl acetat (10 : 1) quan sát ở ánh sáng thường sau khi hiện màu với thuốc thử được thể hiện ở hình 3.1

Hình 3.1 Hình ảnh sắc ký đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương quan sát ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu

1 Tinh dầu Hoắc hương tươi

2 Tinh dầu Hoắc hương khô

3 Tinh dầu Hoắc hương ủ

4 Patchouli alcol

Nhận xét: Hình ảnh sắc kí đồ thu được của tinh dầu Hoắc hương chiết xuất từ

lá tươi, lá khô và lá ủ xuất hiện các vết tương tự nhau về màu sắc và vị trí, trong đó đều xuất hiện vết màu hồng tím với giá trị Rf tương đương vết patchouli alcol Kết quả hình ảnh sắc ký đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương có thể tóm tắt như trong hình sau:

Dung dịch thử Patchouli alcol

3.2.2 Tinh dầu Húng chanh

3.2.2.1 Phân lập carvacrol từ tinh dầu Húng chanh

Tiến hành phân lập carvacrol từ tinh dầu Húng chanh bằng sắc ký lớp mỏng chế hóa với bản mỏng tráng sẵn silicagel F254

Bản mỏng silicagel F254 kích thước 10 x 20 cm được hoạt hóa ở 1100C trong

1 giờ

Tinh dầu Húng chanh được pha loãng bằng dung môi chloroform với tỉ lệ 1 :

10 (tt/tt), sau đó đưa lên bản mỏng bằng máy CAMAG Linomat 5

Khai triển bản mỏng bằng hệ dung môi: n-hexan: ethyl acetat (9 : 1)

Bản mỏng sau khi khai triển, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, bước sóng 254

nm, đánh dấu các vết quan sát được

Cắt hai bên bản mỏng, mỗi bên có chiều rộng 1,5 cm, rồi phun thuốc thử hiện màu vanillin-acid sulfuric Ghép vào bản mỏng và đánh dấu những vết cho màu đậm và tách rõ ràng trên bản mỏng

Dùng kim mũi mác cạo lấy lớp silicagel ở các vùng đã đánh dấu Gộp riêng từng vùng rồi rửa giải bằng dung môi chloroform

Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi: n-hexan: ethyl acetat (9 : 1) Kết quả thu được một phân đoạn cho 1 vết trên sắc ký đồ

Kiểm tra phân đoạn này bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ, với cột sắc ký 5MS, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 5:1, sử dụng khí mang Heli với tốc độ khí mang 1 ml/phút Chương trình nhiệt độ như sau:

HP-Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC)

5-33 60-200 33-38 200 Nhiệt độ hóa hơi 250

Kết quả thu được một pic chính trên hình ảnh sắc ký đồ (phụ lục 4), so sánh kết quả khối phổ của pic này với các thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor cho thấy chất phân lập được là carvacrol

Carvacrol mới phân lập sẽ được sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh dầu Húng chanh bằng SKLM

3.2.2.2 Định tính tinh dầu Húng chanh bằng SKLM

- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:

Tinh dầu Húng chanh được pha loãng bằng dung môi chloroform

Chất đối chiếu carvacrol trong dung môi chloroform