ĐẶT VẤN ĐỀCùng với sự phát triển của các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu nói chung, số lượng và chủng loại tinh dầu trên thị trường Việt Nam cũng ngày càng tăng cao. Tuy nhiên hiện nay các biện pháp kiểm soát chất lượng tinh dầu còn chưa thực sựđược quan tâm, do đó làm thế nào để đánh giá chất lượng tinh dầu vẫn còn là một câu hỏi lớn.Trong khi hiện nay sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký khí (SKK) là hai phương pháp bắt buộc phải tiến hành khi đánh giá chất lượng tinh dầu theo quy định trong tất cả các chuyên luận tinh dầu của Dược điển Châu Âu thì theo thống kê, ở Dược điển Việt Nam IV chỉ có 7 chuyên luận về tinh dầu trên tổng số 283 chuyên luận về dược liệu. Đặc biệt chưa có chuyên luận nào quy định sử dụng phương pháp sắc ký khí, và chỉ có 4 chuyên luận quy định sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để đánh giá chất lượng tinh dầu.Điều đó cho thấy các quy định về kiểm nghiệm tinh dầu ở nước ta hiện nay chưa được chú trọng; các phương pháp kiểm nghiệm tiên tiến và hiện đại chưa được áp dụng phổ biến trong kiểm nghiệm tinh dầu. Do đó cần có thêm nhiều nghiên cứu về tinh dầu đồng thời áp dụng các kỹ thuật tiên tiến sẵn có vào công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng các loại tinh dầu đang lưu hành .Vì vậy đề tài: ―Ứng dụng sắc kí lớp mỏng và sắc kí khí trong kiểm nghiệm một số loại tinh dầu‖ được thực hiện với mục tiêu ứng dụng phương pháp SKLM và sắc ký khí kết hợp khối phổ (GCMS) để phân tích nhằm đưa ra điều kiện sắc ký tối ưu nhất trong kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dầu, tạo cơ sở bước đầu cho việc xây dựng tiêu chuẩn SKLM và SKK đối với một số tinh dầu thường dùng.Nội dung nghiên cứu của khoá luận:1. Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu trong các dược liệu nghiên cứu 2. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp SKLM3. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp GCMS
BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ MAI ỨNG DỤNG SẮC KÍ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ \ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ MAI ỨNG DỤNG SẮC KÍ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Lê Thanh Bình Nơi thực hiện : Bộ môn Dƣợc liệu HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Lê Thanh Bình và TS. Nguyễn Quỳnh Chi, Bộ môn Dược Liệu – Trường Đại Học Dược Hà Nội, là người đã truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu cũng như giúp em có thêm nhiều kiến thức về cuộc sống. Bằng những kiến thức và kinh nghiệm quý báu học được, em đã có thể hoàn thành khoá luận đồng thời có thêm hành trang chuẩn bị bước vào nghề. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Dược Liệu đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện để em có thể hoàn thành khoá luận một cách tốt nhất. Cảm ơn các thầy cô giáo đã cung cấp cho em những kiến thức quý báu trong suốt 5 năm qua. Và em cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè luôn ở bên cạnh tin tưởng, động viên em giúp em có được kết quả như ngày hôm nay. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lê Thị Mai MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………… 2 1.1. Tổng quan về sắc kí lớp mỏng ……………………………… 2 1.1.1. Giới thiệu chung về phương pháp ………………………… 2 1.1.2. Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm dược liệu ………. 4 1.1.3. Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm tinh dầu ………… 5 1.2. Tổng quan về sắc kí khí - khối phổ ……………….……………… 5 1.2.1. Sắc kí khí ……… …………………………………………. 5 1.2.2. Detector khối phổ trong sắc kí khí …………………………. 7 1.2.3. Ứng dụng của sắc kí khí trong kiểm nghiệm …………….… 7 1.2.4. Ứng dụng của sắc kí khí - khối phổ trong kiểm nghiệm tinh dầu …………………………………………………… 8 1.3. Tổng quan về các dƣợc liệu nghiên cứu ………………………… 9 1.3.1. Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth., Lamiaceae)…………………………………………………. 9 1.3.2. Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng, Lamiaceae)…………………………………………………. 10 1.3.3. Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L., Lamiaceae) … 11 1.3.4. Hương nhu tía (Ocimum sanctum L., Lamiaceae) ……… 12 1.3.5. Tràm Úc (Melaleuca alternifolia (Maiden Betche) Cheel, Myrtaceae)………………………………………………… 12 1.3.6. Tràm lá dài (Melaleuca cajuputi Pwell, Myrtaceae) ………. 13 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 14 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị …….……………………………………… 14 2.1.1. Nguyên vật liệu ………….…………………………………. 14 2.1.2. Hóa chất ………….…………………………………………. 15 2.1.3. Thiết bị ………….………………………………………… 15 2.2. Nội dung nghiên cứu……………………………………………… 15 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………… 15 2.3.1. Chiết xuất và xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước……………………………………… 16 2.3.2. Phân lập chất đối chiếu bằng phương pháp sắc kí cột ……… 16 2.3.3. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM .……. 17 2.3.4. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ …………………………………………… 17 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 18 3.1. Chiết xuất, xác định hàm lƣợng tinh dầu trong các mẫu dƣợc liệu nghiên cứu ……………………………………………………… 18 3.2. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp SKLM ………… 18 3.2.1. Tinh dầu Hoắc hương ………………………………… 18 3.2.2. Tinh dầu Húng chanh 21 3.2.3. Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía 24 3.2.4. Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài …………………………… 28 3.3. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ ……………………………………………………… 31 3.3.1. Tinh dầu Hoắc hương …………………….………………… 31 3.3.2. Tinh dầu Húng chanh ………………………………………. 34 3.3.3. Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía ………………… 36 3.3.4. Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài …………………………… 38 3.4. Bàn luận …………………………………………………………… 41 3.4.1. Về chiết xuất và xác định hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên cứu ……………………………… 41 3.4.2. Về định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM 44 3.4.3. Về định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí kết hợp khối phổ …………………………………………… 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT…………………………………………… 48 Kết luận …………………………………………………… 48 Đề xuất ……………………………………………………… 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẲT DĐVN: Dược điển Việt Nam GC-MS: Sắc kí khí kết hợp khối phổ NXB: Nhà xuất bản SKK: Sắc kí khí SKLM: Sắc kí lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM 3 2 Bảng 2.1. Các mẫu dược liệu sử dụng trong nghiên cứu 14 3 Bảng 3.1. Hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược liệu nghiên cứu 18 4 Bảng 3.2. Kết quả phân tích mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi bằng GC-MS 32 5 Bảng 3.3. Kết quả phân tích tinh dầu Hoắc hương khô bằng GC- MS 33 6 Bảng 3.4. Kết quả phân tích tinh dầu Hoắc hương ủ bằng GC- MS 34 7 Bảng 3.5. Kết quả phân tích tinh dầu Húng chanh bằng GC-MS 35 8 Bảng 3.6. Kết quả phân tích tinh dầu Hương nhu trắng bằng GC- MS 37 9 Bảng 3.7. Kết quả phân tích tinh dầu Hương nhu tía bằng GC- MS 38 10 Bảng 3.8. Kết quả phân tích tinh dầu Tràm Úc bằng GC-MS 39 11 Bảng 3.9. Kết quả phân tích tinh dầu Tràm lá dài bằng GC-MS 40 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên bảng Trang 1 Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo máy sắc kí khí 6 2 Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ 7 3 Hình 2.1. Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến 16 4 Hình 3.1. Hình ảnh sắc kí đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương quan sát ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu 20 5 Hình 3.2. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Húng chanh quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu 23 6 Hình 3.3. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 26 7 Hình 3.4. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu 27 8 Hình 3.5. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu 30 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của các sản phẩm có nguồn gốc từ dược liệu nói chung, số lượng và chủng loại tinh dầu trên thị trường Việt Nam cũng ngày càng tăng cao. Tuy nhiên hiện nay các biện pháp kiểm soát chất lượng tinh dầu còn chưa thực sự được quan tâm, do đó làm thế nào để đánh giá chất lượng tinh dầu vẫn còn là một câu hỏi lớn. Trong khi hiện nay sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký khí (SKK) là hai phương pháp bắt buộc phải tiến hành khi đánh giá chất lượng tinh dầu theo quy định trong tất cả các chuyên luận tinh dầu của Dược điển Châu Âu thì theo thống kê, ở Dược điển Việt Nam IV chỉ có 7 chuyên luận về tinh dầu trên tổng số 283 chuyên luận về dược liệu. Đặc biệt chưa có chuyên luận nào quy định sử dụng phương pháp sắc ký khí, và chỉ có 4 chuyên luận quy định sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để đánh giá chất lượng tinh dầu. Điều đó cho thấy các quy định về kiểm nghiệm tinh dầu ở nước ta hiện nay chưa được chú trọng; các phương pháp kiểm nghiệm tiên tiến và hiện đại chưa được áp dụng phổ biến trong kiểm nghiệm tinh dầu. Do đó cần có thêm nhiều nghiên cứu về tinh dầu đồng thời áp dụng các kỹ thuật tiên tiến sẵn có vào công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng các loại tinh dầu đang lưu hành . Vì vậy đề tài: ―Ứng dụng sắc kí lớp mỏng và sắc kí khí trong kiểm nghiệm một số loại tinh dầu‖ được thực hiện với mục tiêu ứng dụng phương pháp SKLM và sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) để phân tích nhằm đưa ra điều kiện sắc ký tối ưu nhất trong kiểm tra, đánh giá chất lượng tinh dầu, tạo cơ sở bước đầu cho việc xây dựng tiêu chuẩn SKLM và SKK đối với một số tinh dầu thường dùng. Nội dung nghiên cứu của khoá luận: 1. Chiết xuất, xác định hàm lượng tinh dầu trong các dược liệu nghiên cứu 2. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp SKLM 3. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp GC-MS [...]... khí - khối phổ trong kiểm nghiệm tinh dầu Sắc kí khí - khối phổ là một kĩ thuật phân tích hiện đại và ngày càng được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là trong lĩnh vực kiểm nghiệm tinh dầu Mặc dù thiết bị đắt 9 tiền và tốn nhiều thời gian hơn nhưng khả năng phân tách của GC-MS là vượt trội hơn hẳn so với các kĩ thuật phân tách khác [18] Sự phù hợp của sắc kí khí đối với kiểm nghiệm tinh dầu: phạm vi khối lượng... được 2 – 3ml dịch cất trong 1 phút Cất cho đến khi thể tích tinh dầu thu được không tăng thêm nữa Ngừng cất, sau ít nhất 10 phút đọc thể tinh dầu cất được trong ống hứng Bộ phận hứng tinh dầu nặng hơn nước Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu được tính theo công thức: Hình 2.1 Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến Trong đó: X: Hàm lượng phần trăm tinh dầu (ml/g) a: Thể tích tinh dầu đọc được sau khi... kiểm nghiệm dƣợc liệu [3], [24] SKLM là một phương pháp được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: dược phẩm, hoá sinh, lâm sàng… để phân tích, kiểm nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn Đối với kiểm nghiệm nói chung và kiểm nghiệm dược liệu nói riêng, SKLM có thể được ứng dụng để phân tích định tính, thử tinh khiết và định lượng các hoạt chất trong mẫu phân tích Thử tinh khiết 5 Là một ứng dụng. .. sử dụng mà độ chính xác của phép định lượng ở cấp độ khác nhau 1.1.3 Ứng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm tinh dầu SKLM là một trong những kĩ thuật sắc kí đầu tiên đã và đang được sử dụng trong nhiều năm để phân tích tinh dầu Phương pháp này cung cấp các thông tin rất có giá trị so với các phương pháp đơn giản khác vì vậy mà nó được thực hiện như là một tiêu chuẩn để mô tả đặc tính của tinh dầu trong. .. ảnh sắc ký đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 1 Tinh dầu Hương nhu trắng 2 Tinh dầu Hương nhu tía 3 Eugenol Nhận xét: Khi quan sát sắc kí đồ dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, cả tinh dầu Hương nhu trắng và tinh dầu Hương nhu tía đều xuất hiện vết rất đậm có giá trị Rf tương đương với eugenol Ngoài ra, trong tinh dầu Hương nhu trắng, số. .. thêm và tín hiệu các mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn từ đó tính được nồng độ chất có trong mẫu - Phương pháp nội chuẩn: Trong phương pháp này, người ta chọn một chất chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu Tỷ số diện tích của các chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích được dùng để xây dựng đường chuẩn 1.2.4 Ứng dụng của sắc kí khí - khối phổ trong. .. phổ Wiley, Nist và Flavor 18 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Chiết xuất, xác định hàm lƣợng tinh dầu trong các mẫu dƣợc liệu nghiên cứu Tinh dầu được tách ra khỏi dược liệu bằng phương pháp cất kéo hơi nước Định lượng tinh dầu trong dược liệu bằng bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến Mỗi mẫu được định lượng 3 lần, lấy giá trị trung bình Kết quả hàm lượng tinh dầu trong các mẫu dược... thử hiện màu 1 Tinh dầu Hoắc hương tươi 2 Tinh dầu Hoắc hương khô 3 Tinh dầu Hoắc hương ủ 4 Patchouli alcol 21 Nhận xét: Hình ảnh sắc kí đồ thu được của tinh dầu Hoắc hương chiết xuất từ lá tươi, lá khô và lá ủ xuất hiện các vết tương tự nhau về màu sắc và vị trí, trong đó đều xuất hiện vết màu hồng tím với giá trị Rf tương đương vết patchouli alcol Kết quả hình ảnh sắc ký đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương... dùng trong y học cổ truyền, tính ấm, vị cay đắng, tác dụng vào kinh vị và đại tràng, có tác dụng giải cảm nắng, thanh nhiệt ở tỳ vị trong trường hợp đầy bụng, ăn không tiêu, đi tả, nôn Hoắc hương cũng là một trong số rất ít loài cho tinh dầu có tác dụng định hương Đây là nguồn nguyên liệu không thể thiếu trong các kĩnh vực hương phẩm và mỹ phẩm Tinh dầu Hoắc hương còn có tính kháng khuẩn nên được sử dụng. .. liệu cất tinh dầu để tách eugenol dùng trong nha khoa và tổng hợp vanillin Tinh dầu Hương nhu còn là nguyên liệu để làm dầu cao xoa xuất khẩu 12 Hương nhu trắng còn được dùng làm thuốc chữa cảm mạo nhức đầu, xông cho ra mồ hôi, chữa lở miệng, đau bụng Hương nhu trắng cũng có tác dụng chống viêm, giảm đau và hạ nhiệt… Tinh dầu Hương nhu trắng có thể được dùng thay thế cho một số loại tinh dầu khác . có vào công tác kiểm tra và đánh giá chất lượng các loại tinh dầu đang lưu hành . Vì vậy đề tài: Ứng dụng sắc kí lớp mỏng và sắc kí khí trong kiểm nghiệm một số loại tinh dầu được thực hiện. của sắc kí khí - khối phổ trong kiểm nghiệm tinh dầu Sắc kí khí - khối phổ là một kĩ thuật phân tích hiện đại và ngày càng được ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là trong lĩnh vực kiểm nghiệm tinh dầu. . sử dụng phương pháp sắc ký khí, và chỉ có 4 chuyên luận quy định sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng để đánh giá chất lượng tinh dầu. Điều đó cho thấy các quy định về kiểm nghiệm tinh dầu