3.2.4.1. Phân lập 4-terpineol và 1,8-cineol từ tinh dầu Tràm Úc
Tiến hành phân lập 4-terpineol và 1,8-cineol từ tinh dầu Tràm Úc bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel, cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (Merck).
Silicagel được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ rồi đem nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt. Cột thủy tinh có khóa, có lót bông thủy tinh, đường kính 1cm, rửa sạch, sấy khô. Trộn silicagel đã hoạt hóa bằng dung môi khai triển là n-hexan, đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Ổn định cột trong 2 giờ.
Tinh dầu Tràm Úc được pha loãng bằng dung môi n-hexan với tỉ lệ 1 : 3 (tt/tt), sau đó đưa lên cột.
Rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (99,5 : 0,5), tốc độ rửa giải khoảng 20 giọt/phút. Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm sạch, khô, mỗi ống khoảng 1ml.
Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (9 : 1). Kết quả thu được hai phân đoạn, mỗi phân đoạn cho 1 vết trên sắc ký đồ.
Kiểm tra hai phân đoạn này bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ, với cột sắc ký DB-WAX, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 50:1, sử dụng khí mang Heli với tốc độ khí mang 1 ml/phút. Chương trình nhiệt độ như sau:
Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC)
Cột 0-5 50
5-31 50-180 31-36 180 Nhiệt độ hóa hơi 250
Kết quả thu được ở mỗi phân đoạn xuất hiện một pic chính trên hình ảnh sắc ký đồ (phụ lục 6 và 7), so sánh kết quả khối phổ của hai pic này với các thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor cho thấy hai chất phân lập được là 1,8-cineol và 4-terpineol.
Hai chất mới phân lập sẽ được sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài bằng SKLM.
3.2.4.2. Định tính tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài bằng SKLM
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:
Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài được pha loãng trong dung môi chloroform. Hai chất đối chiếu 1,8-cineol và 4-terpineol trong hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (99,5 : 0,5).
- Tiến hành:
+ Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 (Merck), hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ.
+ Chấm dịch chiết: Sử dụng máy CAMAG - Linomat 5, phần mềm winCATS. + Hệ dung môi khai triển: Sau khi lựa chọn và khảo sát với một số hệ dung môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (9 : 1) cho kết quả tách tốt nhất trên sắc ký đồ.
+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi rồi hiện màu bằng thuốc thử vanillin-acid sulfuric.
+ Chụp ảnh: sử dụng hệ thống CAMAG reprostar3 kết hợp với phần mềm winCATS.
Kết quả sắc ký lớp mỏng tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài với hai chất đối chiếu 1,8-cineol và 4-terpineol, hệ dung môi khai triển n-hexan : ethyl acetat (9 : 1) quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm được thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu
1. Tinh dầu Tràm lá dài 2. Tinh dầu Tràm Úc 3. 1,8-cineol
4. 4-terpineol
Nhận xét: Sau khi hiện màu và quan sát ở ánh sáng thường, sắc kí đồ của tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài có một số vết đặc trưng giống nhau, trong đó cả hai mẫu tinh dầu đều xuất hiện vết có màu sắc và giá trị Rf tương đương chất đối chiếu 1,8-cineol. Ngoài ra, trên sắc kí đồ của tinh dầu Tràm Úc xuất hiện vết có màu sắc và giá trị Rf tương đương chất đối chiếu 4-terpineol, trong khi đó vết này hầu như không quan sát được trên sắc kí đồ của tinh dầu Tràm lá dài.
Kết quả hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài quan sát ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu có thể tóm tắt như trong hình sau:
Vùng tím (Rf = 0,68) Vùng xanh (Rf =0,47) Vùng tím (Rf =0,39) Vùng xanh (Rf = 0,31) 2 vùng tím (Rf = 0,23, Rf = 0,18) Vùng tím (Rf = 0,16) Vùng tím (Rf = 0,68) Vùng xanh (Rf = 0,47) Vùng xanh (Rf = 0,28) Vùng tím (Rf = 0,23, Vùng tím (Rf = 0,16) Vùng xanh (Rf =0,47) Vùng xanh (Rf = 0,28)
Tràm lá dài Tràm Úc 1,8-cineol 4-terpineol