Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp SKLM- 123docz.net

3.2.1.1. Phân lập patchouli alcol từ tinh dầu Hoắc hương

Tiến hành phân lập patchouli alcol từ tinh dầu Hoắc hương mẫu dược liệu ủ bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel, cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (Merck).

Silicagel được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ rồi đem nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt. Cột thủy tinh có khóa, có lót bông thủy tinh, đường kính 1cm, rửa sạch, sấy khô. Trộn silicagel đã hoạt hóa bằng dung môi khai triển là n-hexan, đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Ổn định cột trong 2 giờ.

Tinh dầu Hoắc hương được pha loãng bằng dung môi n-hexan với tỉ lệ 1 : 3 (tt/tt), sau đó đưa lên cột.

Rửa giải bằng dung môi n-hexan, tốc độ rửa giải khoảng 20 giọt/phút. Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm sạch, khô, mỗi ống khoảng 1ml.

Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi Toluen: ethyl acetat (10 : 1). Kết quả thu được một phân đoạn cho 1 vết trên sắc ký đồ.

Kiểm tra phân đoạn này bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ, với cột sắc ký DB- WAX, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 50:1, sử dụng khí mang Heli với tốc độ khí mang 0,9 ml/phút. Chương trình nhiệt độ như sau:

Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) Cột 0-5 110

5-17 110-170 17-32 170 Nhiệt độ hóa hơi 250

Kết quả thu được một pic chính trên hình ảnh sắc ký đồ (phụ lục 3), so sánh kết quả khối phổ của pic này với các thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor cho thấy chất phân lập được là patchouli alcol.

Patchouli alcol mới phân lập sẽ được sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh dầu Hoắc hương bằng SKLM.

3.2.1.2. Định tính các mẫu tinh dầu Hoắc hương bằng SKLM

Ba mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi, Hoắc hương khô và Hoắc hương ủ được pha loãng trong dung môi ether dầu hỏa.

Chất đối chiếu patchouli alcol trong dung môi n-hexan.

- Tiến hành:

+ Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 (Merck), hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ.

+ Chấm dịch chiết: Sử dụng máy CAMAG - Linomat 5.

+ Hệ dung môi khai triển: Sau khi lựa chọn và khảo sát với một số hệ dung môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi Toluen: ethyl acetat (10 : 1) cho kết quả tách tốt nhất trên sắc ký đồ.

+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi rồi hiện màu bằng thuốc thử vanillin-acid sulfuric.

+ Chụp ảnh: sử dụng hệ thống CAMAG reprostar3 kết hợp với phần mềm winCATS.

Kết quả sắc ký lớp mỏng các mẫu tinh dầu Hoắc hương với chất đối chiếu patchouli alcol, hệ dung môi khai triển Toluen: ethyl acetat (10 : 1) quan sát ở ánh sáng thường sau khi hiện màu với thuốc thử được thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1. Hình ảnh sắc ký đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương quan sát ở ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu

1. Tinh dầu Hoắc hương tươi 2. Tinh dầu Hoắc hương khô 3. Tinh dầu Hoắc hương ủ 4. Patchouli alcol

Nhận xét: Hình ảnh sắc kí đồ thu được của tinh dầu Hoắc hương chiết xuất từ lá tươi, lá khô và lá ủ xuất hiện các vết tương tự nhau về màu sắc và vị trí, trong đó đều xuất hiện vết màu hồng tím với giá trị Rf tương đương vết patchouli alcol.

Kết quả hình ảnh sắc ký đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương có thể tóm tắt như trong hình sau: Vùng tím (Rf = 0,78) Vùng hồng tím (Rf = 0,47) 3 vùng tím (Rf = 0,34, Rf = 0,30, Rf = 0,27) Vùng hồng tím (Rf = 0,47)

Dung dịch thử Patchouli alcol

3.2.2. Tinh dầu Húng chanh

3.2.2.1. Phân lập carvacrol từ tinh dầu Húng chanh

Tiến hành phân lập carvacrol từ tinh dầu Húng chanh bằng sắc ký lớp mỏng chế hóa với bản mỏng tráng sẵn silicagel F254.

Bản mỏng silicagel F254 kích thước 10 x 20 cm được hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ.

Tinh dầu Húng chanh được pha loãng bằng dung môi chloroform với tỉ lệ 1 : 10 (tt/tt), sau đó đưa lên bản mỏng bằng máy CAMAG Linomat 5. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Khai triển bản mỏng bằng hệ dung môi: n-hexan: ethyl acetat (9 : 1).

Bản mỏng sau khi khai triển, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, bước sóng 254 nm, đánh dấu các vết quan sát được.

Cắt hai bên bản mỏng, mỗi bên có chiều rộng 1,5 cm, rồi phun thuốc thử hiện màu vanillin-acid sulfuric. Ghép vào bản mỏng và đánh dấu những vết cho màu đậm và tách rõ ràng trên bản mỏng.

Dùng kim mũi mác cạo lấy lớp silicagel ở các vùng đã đánh dấu. Gộp riêng từng vùng rồi rửa giải bằng dung môi chloroform.

Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi: n-hexan: ethyl acetat (9 : 1). Kết quả thu được một phân đoạn cho 1 vết trên sắc ký đồ.

Kiểm tra phân đoạn này bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ, với cột sắc ký HP- 5MS, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 5:1, sử dụng khí mang Heli với tốc độ khí mang 1 ml/phút. Chương trình nhiệt độ như sau:

Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC)

Cột 0-5 60

5-33 60-200 33-38 200 Nhiệt độ hóa hơi 250

Kết quả thu được một pic chính trên hình ảnh sắc ký đồ (phụ lục 4), so sánh kết quả khối phổ của pic này với các thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor cho thấy chất phân lập được là carvacrol.

Carvacrol mới phân lập sẽ được sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh dầu Húng chanh bằng SKLM.

3.2.2.2. Định tính tinh dầu Húng chanh bằng SKLM

- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:

Tinh dầu Húng chanh được pha loãng bằng dung môi chloroform. Chất đối chiếu carvacrol trong dung môi chloroform.

- Tiến hành:

+ Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 (Merck), hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ.

+ Hệ dung môi khai triển: Sau khi lựa chọn và khảo sát với một số hệ dung môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (9 : 1) cho kết quả tách tốt nhất trên sắc ký đồ.

+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi rồi quan sát ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanillin-acid sulfuric.

+ Chụp ảnh: sử dụng hệ thống CAMAG reprostar3 kết hợp với phần mềm winCATS.

Kết quả sắc ký lớp mỏng các mẫu tinh dầu Hoắc hương với chất đối chiếu patchouli alcol, hệ dung môi khai triển n-hexan: ethyl acetat (9 : 1), quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254nm và ánh sáng thường sau khi hiện màu với thuốc thử được thể hiện ở hình 3.2.

UV 254 nm Sau khi phun thuốc thử hiện màu Hình 3.2. Hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Húng chanh

quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu

Nhận xét: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, sắc kí đồ của tinh dầu Húng chanh xuất hiện 2 vết gần nhau, trong đó có 1 vết nhạt hơn và có Rf tương đương với carvacrol (Rf = 0,28).

Sau khi phun thuốc thử hiện màu, trên sắc ký đồ tinh dầu Húng chanh quan sát được 6 vết với các màu sắc khác nhau, trong đó xuất hiện một vết màu vàng và có giá trị Rf tương đương với carvacrol. Kết quả hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Húng chanh quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu có thể tóm tắt như trong hình sau:

Vùng tím (Rf = 0,68) Vùng tím (Rf = 0,43) Vùng xanh tím (Rf = 0,36) Vùng vàng (Rf = 0,28) Vùng tím (Rf = 0,19) Vùng xanh tím (Rf = 0,13) Vùng vàng (Rf = 0,28) Dung dịch thử Carvacrol

3.2.3. Tinh dầu Hƣơng nhu trắng, Hƣơng nhu tía

3.2.3.1. Phân lập eugenol từ tinh dầu Hương nhu trắng

Tiến hành phân lập eugenol từ tinh dầu Hương nhu trắng bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel, cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (Merck).

Silicagel được hoạt hóa ở 1100

C trong 1 giờ rồi đem nhồi cột theo phương pháp nhồi cột ướt. Cột thủy tinh có khóa, có lót bông thủy tinh, đường kính 1cm, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

rửa sạch, sấy khô. Trộn silicagel đã hoạt hóa bằng n-hexan, đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Ổn định cột trong 2 giờ.

Tinh dầu Hương nhu trắng được pha loãng bằng dung môi n-hexan với tỉ lệ 1 : 3 (tt/tt), sau đó đưa lên cột.

Rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (99,5 : 0,5), tốc độ rửa giải khoảng 20 giọt/phút. Hứng dịch rửa giải vào ống nghiệm sạch, khô, mỗi ống khoảng 1ml.

Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi Toluen : ethyl acetat (96 : 4). Kết quả thu được một phân đoạn cho 1 vết trên sắc ký đồ.

Kiểm tra phân đoạn này bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ, với cột sắc ký HP- 5MS, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 100:1, sử dụng khí mang Heli với tốc độ khí mang 1 ml/phút. Chương trình nhiệt độ như sau:

Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC)

Cột 0-5 60

5-25 60-200 25-30 200 Nhiệt độ hóa hơi 250

Kết quả thu được một pic chính trên hình ảnh sắc ký đồ (phụ lục 5), so sánh kết quả khối phổ của pic này với các thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor cho thấy chất phân lập được là eugenol.

Eugenol mới phân lập sẽ được sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh dầu Hương nhu trắng và Hương nhu tía bằng SKLM.

3.2.3.2. Định tính tinh dầu Hương nhu trắng và Hương nhu tía bằng SKLM

- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:

Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía được pha loãng trong dung môi chloroform.

Chất đối chiếu eugenol trong hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (99,5 : 0,5).

+ Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 (Merck), hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ.

+ Chấm dịch chiết: Sử dụng máy CAMAG - Linomat 5, phần mềm winCATS. + Hệ dung môi khai triển: Sau khi lựa chọn và khảo sát với một số hệ dung môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi Toluen: ethyl acetat (96 : 4) cho kết quả tách tốt nhất trên sắc ký đồ.

+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi rồi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và ánh sáng thường sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin-acid sulfuric.

+ Chụp ảnh: sử dụng hệ thống CAMAG reprostar3 kết hợp với phần mềm winCATS.

Kết quả sắc ký lớp mỏng tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía với chất đối chiếu eugenol, hệ dung môi khai triển Toluen: ethyl acetat (96 : 4) quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm được thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3. Hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm

1. Tinh dầu Hương nhu trắng 2. Tinh dầu Hương nhu tía 3. Eugenol

Nhận xét: Khi quan sát sắc kí đồ dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, cả tinh dầu Hương nhu trắng và tinh dầu Hương nhu tía đều xuất hiện vết rất đậm có giá trị Rf tương đương với eugenol. Ngoài ra, trong tinh dầu Hương nhu trắng, số lượng vết quan sát được nhiều hơn số lượng vết ở tinh dầu Hương nhu tía.

Kết quả hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm có thể tóm tắt như trong hình sau:

Vùng đen (Rf = 0,74) Vùng đen (Rf = 0,39) 3 vùng đen (Rf = 0,18, Rf = 0,06 Rf = 0,03 Vùng đen (Rf = 0,74) Vùng đen (Rf = 0,39) Vùng đen (Rf = 0,03) Vùng đen (Rf = 0,39)

Hương nhu trắng Hương nhu tía Chất đối chiếu Kết quả sắc ký lớp mỏng tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía với chất đối chiếu eugenol, hệ dung môi khai triển Toluen: ethyl acetat (96 : 4) quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm được thể hiện ở hình 3.4.

Hình 3.4. Hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu.

1. Hương nhu trắng 2. Hương nhu tía 3. Eugenol

Nhận xét: Sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin-acid sulfuric, trên sắc kí đồ, tinh dầu Hương nhu trắng xuất hiện 8 vết, tinh dầu Hương nhu tía xuất hiện 4 vết, trong đó cả hai tinh dầu này đều xuất hiện một vết đậm có màu sắc và giá trị Rf tương đương vết eugenol.

Kết quả hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu có thể tóm tắt như trong hình sau: Vùng tím (Rf = 0,74) Vùng vàng nâu (Rf =0,39) 6 vùng xanh tím (Rf = 0,27, Rf = 0,22, Rf = 0,17, Rf = 0,1, Rf = 0,07, Rf = 0,04 Vùng tím (Rf = 0,74) Vùng vàng nâu (Rf =0,39) Vùng xanh tím (Rf = 0,19) Vùng vàng nâu (Rf =0,39)

Hương nhu trắng Hương nhu tía Chất đối chiếu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

3.2.4. Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài

3.2.4.1. Phân lập 4-terpineol và 1,8-cineol từ tinh dầu Tràm Úc

Tiến hành phân lập 4-terpineol và 1,8-cineol từ tinh dầu Tràm Úc bằng sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel, cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (Merck).

Tinh dầu Tràm Úc được pha loãng bằng dung môi n-hexan với tỉ lệ 1 : 3 (tt/tt), sau đó đưa lên cột.

Kiểm tra dịch rửa giải bằng SKLM với hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (9 : 1). Kết quả thu được hai phân đoạn, mỗi phân đoạn cho 1 vết trên sắc ký đồ.

Kiểm tra hai phân đoạn này bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ, với cột sắc ký DB-WAX, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 50:1, sử dụng khí mang Heli với tốc độ khí mang 1 ml/phút. Chương trình nhiệt độ như sau:

Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC)

Cột 0-5 50

5-31 50-180 31-36 180 Nhiệt độ hóa hơi 250

Kết quả thu được ở mỗi phân đoạn xuất hiện một pic chính trên hình ảnh sắc ký đồ (phụ lục 6 và 7), so sánh kết quả khối phổ của hai pic này với các thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor cho thấy hai chất phân lập được là 1,8-cineol và 4-terpineol.

Hai chất mới phân lập sẽ được sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài bằng SKLM.

3.2.4.2. Định tính tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài bằng SKLM

- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký:

Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài được pha loãng trong dung môi chloroform. Hai chất đối chiếu 1,8-cineol và 4-terpineol trong hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (99,5 : 0,5).

- Tiến hành:

+ Chất hấp phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 (Merck), hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ.

+ Chấm dịch chiết: Sử dụng máy CAMAG - Linomat 5, phần mềm winCATS. + Hệ dung môi khai triển: Sau khi lựa chọn và khảo sát với một số hệ dung môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (9 : 1) cho kết quả tách tốt nhất trên sắc ký đồ.

+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi rồi hiện màu bằng thuốc thử vanillin-acid sulfuric.

+ Chụp ảnh: sử dụng hệ thống CAMAG reprostar3 kết hợp với phần mềm winCATS.

Kết quả sắc ký lớp mỏng tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài với hai chất đối chiếu 1,8-cineol và 4-terpineol, hệ dung môi khai triển n-hexan : ethyl acetat (9 : 1) quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm được thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài quan sát dưới ánh sáng thường sau khi phun thuốc thử hiện màu

1. Tinh dầu Tràm lá dài 2. Tinh dầu Tràm Úc 3. 1,8-cineol

4. 4-terpineol