CƠ sở kĩ THUẬT sắc kí LỎNG CAO áp

Cơ sở kỹ thuật Sắc ký lỏng cao áp Lê Thanh Hải TramatCo Ltd Application Manager May 2016 Nội dung • Mở đầu • Các phương trình đại lượng HPLC • Các chế độ phân tích HPLC • Dung mơi dạng peak HPLC • Thiết bị HPLC • Chế độ chạy isocratic gradient • Các phương pháp định lượng sắc ký lỏng Lịch sử sắc ký (LC) Năm 1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919) thí nghiệm tách chất cột sắc ký lần Năm 1906… Ngày nay… M.S Tswett Ber Dtsch Bot Ges 24: 384-393 (1906) “Chromatography” kết hợp hai từ Chromo Graphy, tiếng Hy lạp có nghĩa mầu sắc ghi lại Tương tự ta có từ “Sắc ký” tiếng Việt HPLC HPLC =?  Horrible Performance Liquid Chromatography  High Performance Liquid Chromatography  Hyper Performance Liquid Chromatography (UHPLC = Ultra High Performance LC) Sơ đồ chung hệ HPLC Quá trình tách chất thực dịch chuyển khác cấu tử pha tĩnh pha động Pha tĩnh: pha cố định cột phân tích, ví dụ C18, Silica v.v… Pha động: dung mơi có tác dụng vận chuyển mẫu qua pha tĩnh bơm qua ct Thi So sánh dạng mẫu phân tích kỹ thuật HPLC GC Mu: bay HPLC Mẫu: Độ phân cực HPLC • Mẫu khơng cần bay • Mẫu cần hịa tan pha động GC • Mẫu bắt buộc phải dạng • Phân tích dạng phân cực khơng phân cực PAH tới ion vơ GC • Mẫu thường không phân cực, phân cực không mạnh Phân loại mẫu kỹ thuật phân tích tương ứng          Giới thiệu chung Các phương trình đại lượng HPLC Các chế độ phân tích kỹ thuật HPLC Các loại cột phân tích Hệ thống bơm dung môi HPLC Gradient isocratic Các kỹ thuật bơm mẫu Detector sử dụng HPLC Các phương pháp định lượng HPLC Các cố thường gặp HPLC CÁC ĐẠI LƯỢNG VÀ PHƯƠNG TRÌNH SẮC KÝ CƠ BẢN Thời gian lưu, thời gian không lưu giữ thời gian lưu hiệu chỉnh to - thời gian không lưu giữ tR- thời gian lưu t'R- thời gian lưu hiệu chỉnh tính theo: t'R = tR - to tR tR mAU Diện tích peak tỷ lệ với lượng chất phân tích to time Injection Thể tích lưu giữ VR Trong sắc ký lỏng, thay thời gian lưu, đơi nguời ta sử dụng khái niệm thể tích lưu VR Tương tự ta có khái niệm thể tích khơng lưu giữ Vo thể tích lưu hiệu chỉnh V’R Thể tích lưu thời gian lưu quan hệ theo hệ thức sau: VR = F tR Trong F lưu lượng dịng pha động qua cột tính ml/min, V tính ml cịn thời gian lưu tính phút Tương tự ta có: V’R = F t’R Vo = F to Ưu điểm việc sử dụng thể tích lưu đại lượng khơng phụ thuộc vào lưu lượng dòng pha động Vo thể tích rỗng cột 10 Hệ số dung lượng k’ hay hệ số lưu giữ k Dung lượng lưu giữ k định nghĩa tỷ số thời gian lưu hiệu chỉnh thời gian khơng lưu giữ Hay ta có k t ' R tR  tm V ' R VR  Vm  ;k '   to to Vo Vo •k tỷ lệ thời gian mẫu nằm pha tĩnh so với thời gian nằm pha động Hay nói cách khác, k tỷ lệ số mol chất tan pha tĩnh với số mol chất tan pha động Hệ số dung lượng k lớn thời gian phân tích lâu • Hệ số dung lượng k cấu tử biểu thị khả lưu giữ cột cấu tử • Những cấu tử có k= khơng bị lưu giữ pha tĩnh cột có thời gian lưu to •Những cấu tử tương tác khơng thuận nghịch với pha tĩnh (không nằm pha động) có giá trị k tiến tới ∞ khơng rửa giải khỏi cột phân tích • k = tương đương với thể tích rửa giải lần thể tích rỗng cột 11 Hệ số dung lượng k’ hay hệ số lưu giữ k HÖ sè dung lợng phụ thuộc mạnh vào thành phần pha động (khác với sắc ký khí, pha động đóng vai trũ chuyn) Ví dụ sắc ký RP, hàm lợng dung môi hữu pha động cao, hệ số lu giữ giảm (peak rửa giải sớm hơn) Tơng tự sắc ký ký có chế độ chạy chơng trình nhiệt độ, sắc ký lỏng, ta áp dụng chế độ chạy gradient dung môi với mẫu phức tạp k = 20: Tạm đợc; k = 10: tốt hơn; k = – 7: lý tưëng! 12 Hiệu tách cột, số đĩa lý thuyết N 13 Hiệu tách cột, số đĩa lý thuyết N (tiếp theo) 2  tR   tR   tR  N     16    5.54      Wb   Wh  14 Hiệu tách cột, số đĩa lý thuyết N (tiếp theo) • • • • Số đĩa lý thuyết N thể hiệu tách cột phân tích N có giá trị lớn, peak sắc ký hẹp nhọn N nhỏ cho peak tù thấp, khả tách Chiều cao đĩa lý thuyết H tỷ lệ nghịch với số đĩa lý thuyết N H L N Với L chiều dài cột phân tích (HETP = height equivalent theoretical plate) • Số đĩa lý thuyết N cột LC phụ thuộc vào: a) Kích thước hạt nhồi dp Hạt nhỏ, N lớn b) Độ nhớt pha động lớn, N nhỏ c) Nhiệt độ cột cao, N lớn (trong giới hạn) d) Thường N tăng tốc độ pha ng gim e) Với cột có hạt nhồi dới 2um, tốc độ tăng không làm giảm N đáng kể -> Giúp tăng tốc trình phân tích 15 Hiệu tách cột, số đĩa lý thuyết N Phương trình van Deemter Phương trình van Deemter H  A B  Cu u Với H : chiều cao đĩa lý thuyết A: Số hạng biểu thị chảy rối dịng dung mơi pha động B: Số hạng biểu thị khuyếch tán dọc theo cột C: Trở lực chuyển khối C = Cm +Cs u : Tốc độ dài pha động (cm/phút) 16 §ưêng cong Van Deemter với kích thước hạt khác 17 Sắc ký lỏng siêu hiệu với cột HPLC với kích thước hạt µm 18 Với tốc độ dịng gần giá trị optimum, số đĩa lý thuyết tính gần sau: Phương trình tương đương với : H = 2,8 *Dp 19 Sè ®Üa lý thuyết độ rộng peak 20 10 Phũng bnh chữa bệnh: biện pháp ngăn ngừa tượng tăng áp suất  Lọc kỹ pha động Dung môi + Đệm  Lắp thêm tiền cột (làm nhiệm vụ lọc) bơm mẫu cột – Sử dụng màng lọc đầu cột kích thước 2um cho cột 3um 0,5um cho cột 1,8 um  Lọc toàn mẫu chuẩn trước bơm  Với mẫu nhiều tạp, ta nên thông qua khâu làm mẫu LLE SPE  Rửa cột sau ngày làm việc – Sử dụng hỗn hợp nước+organic để rửa tồn hệ thống cho hết đệm (ít 20 lần thể tích cột) – Dùng dung mơi pha mẫu hoà tan pha động 115 Ngăn ngừa cố tăng áp suất: lắp lọc dòng pha động 116 58 Những điểm cần ghi nhớ  Hạt nhồi cột có kích thước nhỏ, màng lọc phải có kích thước nhỏ tương ứng 5μm - 2μm frit ; 3-3.5μm - 0.5μm-2um frit ; 1.8μm - 0.2μm frit  Lọc kỹ pha động làm tăng tuổi thọ chi tiết chuyển động : van chiều, piston seal, autosampler  Lọc kỹ mẫu làm giảm mài mòn thiết bị tránh làm tắc cột 117 SỰ CỐ VỀ DẠNG PEAK     Peak chẻ Peak kéo (tailing) Peak giỗng Hiệu tách (N thấp) Thường tượng dạng peak hay xảy Ví dụ peak bị hay kèm peak giỗng hiệu tách 118 59 Peak chẻ Peak chẻ nguyên nhân sau đây: – – – – Cột bị nhiễm Frit cột bị tắc phần Cột bị khoang rỗng Dung môi pha mẫu không phù hợp 119 Peak chẻ : nguyên nhân có thể:  Nếu mơi trường mẫu bẩn, cột phân tích nhiều loại mẫu khác nhau: khả lớn cột bị nhiễm frit bị tắc phần (chú ý cột bảo vệ)  Nếu pH pha động > 7, khả cột bị khoang rỗng (khi pH cao ta phải sử dụng cột đặc biệt, ví dụ Zorbax Extend C18 chịu pH = 11)  Nếu dung môi pha mẫu mạnh pha động, khả tạo peak chẻ peak giỗng Peak có k nhỏ dễ bị ảnh hưởng 120 60 Peak chẻ cột bị ô nhiễm: Rửa cột ACN làm peak hết chẻ Trường hợp cột bị nhiễm môi trường mẫu nhiều cấu tử bẩn 121 Peak chẻ cột bị rỗng Peak chẻ cột bị rỗng Do Frit đầu cột bị tắc phần Lắp cột chưa quy cách 122 61 Peak chẻ dung mơi pha mẫu khơng phù hợp : • Dung mơi pha mẫu ‘mạnh’ pha động gây chẻ peak giỗng peak • Các peak rửa giải sớm bị ảnh hưởng mạnh (k nhỏ) 123 Peak “đuôi”, peak giỗng, hiệu tách (N) thấp nguyên nhân sau đây: Phản ứng thứ cấp cột Cột có khoang rỗng Cột nhiễm Cột bị già Lượng bơm tải Hiệu ứng ngồi cột (thể tích trễ) 124 62 Peak tailing phản ứng thứ cấp cột • Peak “đi” loại trừ cách cho thêm TEA vào pH =7 125 Peak tailing phản ứng thứ cấp cột Giảm tượng kéo đuôi peak cách hạ pH pha động xuống pH = (làm giảm hoạt động nhóm SiOH) mà không cần phải cho thêm “phụ gia” TEA 126 63 Peak tailing cột ô nhiễm Giảm tượng kéo đuôi peak cách hạ pH pha động xuống pH = (làm giảm hoạt động nhóm SiOH) mà khơng cần phải cho thêm “phụ gia” TEA 127 Peak gioãng, “xấu” bị rỗng cột Trường hợp peak bị gioãng cột làm việc pH cao, gây hòa tan silica tạo khoang rỗng cột 128 64 Sử dụng tiền cột để ‘bão hịa’ silica với pha động có pH khu vực nguy hiểm Tiền cột loại bán sẵn, cột C18 cũ, có kích thước hạt lớn (5 – 10 um) chiều dài ngắn 129 Peak gioãng, xuất bất thường: từ lần phân tích trước Trường hợp peak bị gioãng với số đĩa lý thuyết thấp “đột biến” peak từ lần phân tích trước cịn tồn lại cột 130 65 Peak giỗng, tailing Injector Seal bị Không bảo dưỡng thiết bị định kỳ có nguy gây dạng peak 131 Peak giỗng, fronting thể tích bơm lớn  Dung môi pha mẫu không “mạnh” pha động thời điểm đầu  Thể tích bơm khơng lớn 10% thể tích cột  Dung môi pha mẫu mạnh (lượng hữu lớn), thể tích bơm phải nhỏ  Với dung mơi pha mẫu 100% hữu cơ, thể tích bơm mẫu nên nhỏ xấp xỉ 1% thể tích cột 132 66 Thể tích trễ thể tích ngồi cột (ECV) Thể tích trễ : thể tích từ điểm trộn dung môi (gradient) tới đầu cột Với loại bơm trộn áp suất thấp, thể tích trễ cịn cộng thêm thể tích đầu bơm Thể tích ngồi cột: thể tích trễ + thể tích detector dây nối tới detector 133 Ảnh hưởng thể tích ngồi cột (ECV) tới dạng peak 134 67 Ảnh hưởng thể tích cột (ECV) tới dạng peak 135 Ảnh hưởng thể tích ngồi cột (ECV) tới dạng peak 136 68 Định dạng nguyên nhân gây tượng peak tailing  Đánh giá ảnh hưởng pha động, thay đổi pH cho thêm chất phụ gia (ví dụ TEA)  Cân nhắc lựa chọn cột chủng loại Với điều kiện pH cao (hoặc thấp) phải tìm loại phù hợp  Giảm lượng mẫu bơm vào cột: pha loãng , bơm thể tích nhỏ  Làm giảm thiểu hiệu ứng cột (ECV) : ốc nối, mao quản, flowcell detector  Rửa cột dung mơi thích hợp 137 CÁC SỰ CỐ LIÊN QUAN TỚI THỜI GIAN LƯU  Thời gian lưu thay đổi  Hệ số lưu giữ thay đổi  Độ lựa chọn thay đổi 138 69 Cùng cột, thời gian lưu thay đổi theo thời gian Các nguyên nhân là: Cột già Cột bị nhiễm Cột chưa đạt cân Cột pha động khơng thích ứng Pha động bị thay đổi Tốc độ dòng bị thay đổi Nhiệt độ cột bị thay đổi Nguyên nhân từ phần khác thiết bị 139 Ảnh hưởng pha động làm thời gian lưu thay đổi: TFA dễ bay thoát khỏi pha động Cho thêm TFA vào, peak trở lại cũ (Đây mẫu phân tích protein dạng peak bên phải bình thường 140 70 Mức độ làm thay đổi thời gian lưu yếu tố khác     Tốc độ dòng Nhiệt độ % dung môi hữu pH +/- 1% +/- độ C +/- 1% +/- 0,01 +/+/+/+/- 1% tR đến % - 10 % tới 1% 141 Xác định nguyên nhân làm thay đổi độ lưu giữ cột  Xác định tR, k’ alpha peak nghi ngờ  Rửa cột (theo bước phần trên)  Kiểm tra cột Ghi lại số lô cột (lot No)  Xem lại trình cân cột  Chuẩn bị pha động chạy kiểm tra lại  Thực quy trình OQ/PV thiết bị 142 71 KẾT LUẬN Những cố thường xẩy với hệ HPLC thuộc ba dạng sau: Áp suất tăng cao Dạng peak không mong muốn Thay đổi độ lưu giữ / độ lựa chọn Những cố khơng hồn tồn gây cột phân tích mà đến từ vị trí thiết bị điều kiện chạy mẫu chưa hợp lý 143 THANK YOU 144 72 ... chế độ phân tích kỹ thuật HPLC S¾c ký láng pha thêng (NP) Sắc ký lỏng pha ngợc (RP) : phổ biến Sắc ký lỏng cặp đôI ion Sắc ký lỏng trao ®ỉi ion S¾c ký läc gel (GPC & GFC) Sắc ký HILIC 29 S¾c... 16 Sắc ký loại kích thước (SEC) Phân tách cấu tử dựa kích thớc phân tử Bao gồm loại: SEC dung dịch kỵ nớc: Sắc ký thấm gel (GPC) SEC dung dịch nớc : Sắc ký lọc gel (GFC) Không có tơng tác sắc. .. 21 Một vài dạng peak “xấu” điển hình 43 Dung môi sử dụng sắc ký lỏng (RP-HPLC) 44 22 Tính chất số dung mơi thường sử dụng sắc ký lỏng cao áp Dung môi Độ nhớt (cP, 20 oC) Độ phân cực (Snyder) Điểm