Luận Văn Thạc sỹ - Cốt khí củ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỒNG VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYDATIN, RESVERATROL VÀ EMODIN TRONG CỐT KHÍ CỦ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỒNG VĂN THÀNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG POLYDATIN, RESVERATROL VÀ EMODIN TRONG CỐT KHÍ CỦ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Nơi thực đề tài: Viện Dược liệu Thời gian thực hiện: từ 08/2017 đến 04/2018 HÀ NỘI 2018 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Cốt khí củ (Reynoutria japonica Houtt.) 1.1.1 Tên khoa học 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Tác dụng theo Y học cổ truyền 1.1.6 Tác dụng dược lý 1.2 Tổng quan polydatin, resveratrol, emodin 1.2.1 Tính chất vật lý hóa học 1.2.2 Tác dụng dược lý 10 1.3 Phương pháp xác định POL, RES EM 15 1.3.1 Các nghiên cứu nước 15 1.3.2 Các nghiên cứu nước 16 1.3.3 Tiêu chuẩn dược liệu Cốt khí củ số Dược điển 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Chất chuẩn, hóa chất thiết bị 20 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời POL, RES, EM HPLC 21 2.3.2 Thẩm định phương pháp 22 2.3.3 Áp dụng phương pháp đánh giá chất lượng dược liệu Cốt khí củ 22 2.4 Phương pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 22 2.4.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 23 2.4.3 Quy trình xử lý mẫu 23 2.4.3 Đánh giá phương pháp phân tích 24 2.4.4 Áp dụng số mẫu dược liệu Cốt khí củ 27 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 27 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sắc ký 29 3.1.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại chất nghiên cứu 29 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 30 3.1.2.1 Lựa chọn pha tĩnh 30 3.1.2.2 Khảo sát thành phần pha động 30 3.1.2.3 Khảo sát thể tích tiêm mẫu 35 3.2 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu 36 3.2.1 Khảo sát phương pháp chiết mẫu 36 3.2.2 Khảo sát dung môi chiết 37 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ chiết 38 3.2.4 Khảo sát thời gian chiết 39 3.2.5 Khảo sát số lần chiết 40 3.3 Thẩm định phương pháp định lượng HPLC 43 3.3.1 Độ chọn lọc phương pháp 43 3.3.2 Độ thích hợp hệ thống 43 3.3.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 45 3.3.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 46 3.3.5 Độ lặp lại 48 3.3.6 Độ 49 3.4 Áp dụng phương pháp định lượng POL, RES EM mẫu Cốt khí củ 51 Chương BÀN LUẬN 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên tiếng Anh tên khoa học EM Emodin POL Polydatin RES Resveratrol DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography cao High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu chromatography photodiode array cao ghép nối detector detetion mảng iod LC- Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối MS/MS mass spectrometry phổ lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn HPLC HPLCPDA Tiếng Việt DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu nước định lượng POL, RES, EM Cốt khí củ Tr 15 Bảng 3.1 Khảo sát pha động ACN – nước Tr 31 Bảng 3.2 Khảo sát pha động MeOH – nước Tr 33 Bảng 3.3 Các thông số sắc ký ứng với chương trình gradient Tr 35 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp Tr 44 Bảng 3.5 Quan hệ tuyến tính nồng độ diện tích píc POL, RES EM Tr 45 Bảng 3.6 Kết xác định LOD LOQ phương pháp Tr 48 Bảng 3.7 Kết đánh giá độ lặp lại phương pháp Tr 49 Bảng 3.8 Kết thẩm định độ phương pháp Tr 50 Bảng 3.9 Kết hàm lượng POL, RES EM mẫu Cốt khí củ Tr 51 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Hình 1.2 Hình ảnh dược liệu Cốt khí củ Cơng thức số anthraquinon naphthoquinon rễ Cốt khí củ Tr.4 Tr.5 Hình 1.3 Công thức cấu tạo số stilben rễ Cốt khí củ Tr.7 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo polydatin Tr.8 Hình 1.5 Cơng thức cấu tạo resveratrol Tr.9 Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo emodin Tr.9 Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Cốt khí củ lưu trữ Viện Dược liệu Tr.20 Hình 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS POL, RES EM Tr.29 Hình 3.2 Chương trình gradient Tr.32 Hình 3.3 Chương trình gradient Tr.32 Hình 3.4 Chương trình gradient Tr.34 Hình 3.5 Chương trình gradient Tr.34 Hình 3.6 Kết khảo sát phương pháp chiết mẫu Tr.36 Hình 3.7 Kết khảo sát dung mơi chiết Tr.37 Hình 3.8 Kết khảo sát nhiệt độ chiết Tr.38 Hình 3.9 Kết khảo sát thời gian chiết Tr.39 Hình 3.10 Kết khảo sát số lần chiết Tr.40 Hình 3.11 Sắc ký đồ đánh giá tính chọn lọc phương pháp Tr.43 Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống phương pháp Tr.44 Hình 3.13 Đường chuẩn POL, RES EM Tr.46 Hình 3.14 Sắc ký đồ xác định LOD, LOQ Tr.47 ĐẶT VẤN ĐỀ Cốt khí củ vị thuốc cổ truyền sử dụng phổ biến nước châu Á Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản… Theo y học cổ truyền cốt khí củ có cơng dụng để chữa tê thấp, tổn thương đau đớn bị ngã, bị thương, vị thuốc thu liễm cầm máu Kết nghên cứu đại cho thấy tác dụng dược lý cốt khí củ hoạt chất có cốt khí củ phong phú, số tác dụng đầy tiềm chứng minh chống oxy hóa, điều hịa rối loạn lipid máu, bảo vệ gan, kháng viêm , kháng khuẩn, đặc biệt kháng tế bào ung thư… Hiện nay, nhu cầu sử dụng vị thuốc cổ truyền nhân dân ngày lớn, đòi hỏi chất lượng dược liệu phải đảm bảo, hàm lượng hoạt chất phải đạt yêu cầu Tuy nhiên, chuyên luận Cốt khí củ (DĐVN V), chưa có quy định tiêu định lượng hoạt chất chính, có tiêu định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng, so sánh với dược liệu đối chiếu Chỉ tiêu định lượng chất chiết phương pháp cân với độ xác khơng cao Vì vậy, chun luận cốt khí củ (DĐVN V) chưa đánh giá xác chất lượng dược liệu cốt khí củ Việt Nam Emodin, resveratrol, polydatin hoạt chất Cốt khí củ, chứng minh tác dụng dược lý Mặt khác, Dược điển Trung Quốc Dược điển Hồng kông đưa tiêu định lượng hoạt chất nhằm đảm bảo chất lượng dược liệu Cốt khí củ chưa thực định lượng đồng thời chúng Xuất phát từ thực tiễn đó, nhóm nghiên cứu đề xuất đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng polydatin, resveratrol emodin Cốt khí củ sắc ký lỏng hiệu cao” với mục tiêu: ... trans-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-6″-sulfat; Na, K trans-resveratrol-3O-β-D-glucopyranoside-4″-sulfat; Na, K trans-resveratrol-3-O-β-D- glucopyranoside-2″-sulfat; Na, K trans -resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside4′-sulfat;... -resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside4′-sulfat; Na, K trans -resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-5-sulfat; Na, K cisresveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-6″-sulfat, Na, K cis-resveratrol-3-O-β-Dglucopyranoside-4″-sulfat,... cis-resveratrol-3-O-β-Dglucopyranoside-4″-sulfat, Na, K cis-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-3″sulfat; Na, K cis-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-2″-sulfat, Na, K cisresveratrol-3-O-β-D-glucopyranoside-5-sulfat [58]