Nghiên cứu giới hạn phát hiện LOD biến đổi gen trong đậu tương và các sản phẩm chế biến từ đậu tương phục vụ công tác kiểm nghiệm

LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Lưu Minh Cúc PGS.TS Bùi Văn Thắng, ngƣời tận tình hƣớng dẫn em suốt trình thực tập viết khóa luận tốt nghiệp Em xin trân trọng cảm ơn quý Thầy, Cô Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam truyền đạt kiến thức năm em học tập Với vốn kiến thức đƣợc tiếp thu trình học khơng tảng cho q trình nghiên cứu khóa luận mà cịn hành trang q báu để em bƣớc vào dời cách vững tự tin Em chân thành cảm ơn anh, chị Phòng Giám định Sinh vật Sản phẩm biết đổi gen – Viện Di truyền Nông nghiệp giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trình em thực tập Cuối em kính chúc quý Thầy, Cô dồi sức khỏe thành công nghiệp nghề giáp cao quý Đồng kích chúc anh, chị Phịng Giám định Sinh vật Sản phẩm biến đổi gen – Viện Di truyền Nông nghiệp dồi sức khỏe, đạt dƣợc nhiều thành công công việc n in th n nă Sinh viên th c hi n Nguyễn Phúc Hưng i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v MỞ ĐẦU CHƢƠNG T NG QU N T I IỆU 1.1.Cây trồng biến đổi gen 1.1.1 Khái niệm Cây trồng biến đổi gen 1.1.2 Tình hình sản xuất thƣơng mại hóa trồng biến đổi gen 1.1.3 Những vấn đề bàn luận xung quanh sản phẩm trồng biến đổi gen 1.1.4 Một số kiện liên quan đến cay trồng biến đổi gen 1.1.5 Vấn đề dán nhãn sản phẩm biến đổi gen 1.2.Khái quát quy trình thí nghiệm phƣơng pháp xác định giới hạn LOD sản phẩm biến đổi gen 1.2.1 Quy trình thí nghiệm 1.2.2 Tổng quan phƣơng pháp tách chiết DNA dựa CTAB 10 1.2.3 Định lƣợng xác định độ tinh DNA 11 1.2.4 Khái quát giới hạn phát liện LOD (Limit of Detection) 12 1.2.5 Các phƣơng pháp điện di 13 1.2.6 Các phƣơng pháp PCR 13 CHƢƠNG 2.MỤC TI U, V T IỆU V PHƢƠNG PH P NGHI N CỨU 18 2.1 Mục tiêu 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu 18 2.4 Phƣơng pháp tách chiết DNA 18 2.4.1 Phƣơng pháp dựa CTAB 18 2.5 Định lƣợng kiểm tra độ tinh DNA máy NanoDrop2000 21 ii 2.6 Định lƣợng DN tách chiết phƣơng pháp điện di gel agarose21 2.6.1 Hóa chất 21 2.6.2 Cách tiến hành 21 2.7 Realtime PCR 22 2.7.1 Thành phần phản ứng 22 2.7.2 Biểu thị kết 24 2.8 Xác định giới hạn phát LOD 24 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Kết tách chiết DNA phƣơng pháp CT B 26 3.2 Kết điện di kiểm tra DNA gel agarose 0,8% 27 3.3 Kết Realtime PCR xác định giá trị LOD 28 3.3.1 Kết Realtime PCR xác định giá trị OD mẫu đậu tƣơng hạt 28 KẾT LU N V ĐỀ NGHỊ 41 KẾT LU N 41 ĐỀ NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO １ iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Bp Base pair CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate EDTA Ethylenediaminetetra Acetic Acid EtBr Ethidium Bromide Kb Kilo base GM Genetically Modified (Biến đổi gen) GMCs Genetically Modified Crops (Cây trồng biến đổi gen) GMOs Genetically Modified Organism(Sinh vật biến đổi gen) ISAAA Cơ quan dịch vụ quốc tế khuyến khích ứng dụng công nghệ sinh học nông nghiệp RNase Ribonucleasa PCR Polymerase Chain Reaction PVP Polyvinyl-pyrrovylidon TBE Tris-Boric acid-EDTA TCVN Tiêu chuẩn Quốc gia TE Tris-EDTA SDS Sodium decyl sulfate UV Ultraviolet iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các tính trạng chuyển gen đƣợc thƣơng mại hóa Bảng 2.1 : Trình tự mồi mẫu dò sử dụng 22 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng Realtime PCR 23 Bảng 2.3: Chƣơng trình thời gian nhiệt độ Realtime PCR 24 Bảng 3.1 : Kết đo nồng độ DNA máy NanoDrop2000 26 Bảng 3.2: Kết Realtime PCR kiện MON87705 nồng độ 0,01% 28 Bảng 3.3: Kết Realtime PCR kiện MON87708 nồng độ 0,01% 29 Bảng 3.4: Kết Realtime PCR kiện MON87701 nồng độ 0,01% 29 Bảng 3.5: Kết Realtime PCR kiện MON87705 điểm nồng độ 0.02% 30 Bảng 3.6: Kết Realtime PCR kiện MON87708 điểm nồng độ 0.02% 32 Bảng 3.7: Kết Realtime PCR kiện MON87701 33 Bảng 3.8: Kết Realtime PCR kiện MON87705 điểm nồng độ 0,04% 35 Bảng 3.9: Kết Realtime PCR kiện MON87708 điểm nồng độ 0,04% 36 Bảng 3.10: Kết Realtime PCR kiện MON87701 điểm nồng độ 0,04% 37 Bảng 3.11: Kết Realtime PCR kiện MON87705 điểm nồng độ 0.1% 38 Bảng 3.12: Kết Realtime PCR kiện MON87708 điểm nồng độ 0.1% 39 Bảng 3.13: Kết Realtime PCR kiện MON87701 điểm nồng độ 0.1% 40 v DANH MỤC HÌNH Hình 3.1: Kết điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 27 Hình 3.2 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87705 nồng độ 0,01% 28 Hình 3.3 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87708 nồng độ 0,01% 29 Hình 3.4 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87701 nồng độ 0,01% 30 Hình 3.5 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87705 nồng độ 0,02% 31 Hình 3.6 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87708 nồng độ 0,02% 32 Hình 3.7 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87701 nồng độ 0,02% 34 Hình 3.8 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87705 nồng độ 0,04% 35 Hình 3.9 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87708 nồng độ 0,04% 36 Hình 3.10 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87701 nồng độ 0,04% 37 Hình 3.11 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87705 nồng độ 0,1% 38 Hình 3.12 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87708 nồng độ 0,1% 39 Hình 3.13 Biểu đồ kết Realtime PCR kiện MON87701 nồng độ 0,1% 40 vi MỞ Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism – GMO) sinh vật mà vật liệu di truyền đƣợc thay đổi nhân tạo phịng thí nghiệm thông qua kỹ thuật di truyền (genetic engineering – GE) Sinh vật biến đổi gen (GMO) đƣợc tạo với mục đích sử dụng khác nhau, nhƣ tạo ta giống trồng chuyển gen kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ, v.v [6] Nhƣ vậy, mục đích tiêu chí cơng nghệ gen nhằm tạo sinh vật biến đổi gen đem lại lợi ích to lớn cho lồi ngƣời Tuy nhiên, hay nhiều, sinh vật biến đổi gen đem lại hồi nghi tính an tồn trình sử dụng ngƣời vật ni, chí số quan diểm cho GMO ảnh hƣởng đến cân sinh thái quần thể GMCs (Genetically Modified Crops - GMCs) gây tƣợng độc canh làm xáo trộn sinh cảnh hệ sinh thái, làm giảm đa dạng sinh học lồi sinh vật khác khơng thể thích nghi nhanh với việc sử dụng biến đổi gen làm thức ăn đƣợc [8] Đến nay, có 495 kiện chuyển gen đƣợc phê chuẩn, tập trung chủ yếu vào số trồng nhƣ ngơ (231 kiện); (59 kiện); khoai tây (47 kiện); cải dầu (40 kiện); đậu tƣơng (36 kiện) loại trồng khác Các nƣớc sử dụng sản phẩm biến đổi gen làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi tăng lên đến 40 nƣớc, có Cộng đồng châu Âu (EU), tính nƣớc [9] Việt Nam cấp phép 21 kiện ngô, đậu tƣơng biến đổi gen sử dụng làm thực phẩm thức ăn chăn nuôi Đây bƣớc tiến quan trọng khâu quản lý để đảm bảo an ninh lƣơng thực nƣớc quyền lợi ngƣời tiêu dùng thông tin sản phẩm trở nên minh bạch, công khai Các định quan quản lý việc có cấp phép hay không số hoạt động liên quan đến sinh vật biến đổi gen đƣợc dựa quy trình phân tích nguy nghiêm ngặt, tập trung vào chứng khoa học tƣ vấn sâu rộng chuyên gia [7] Các chứng khoa học giới chứng minh tính an tồn sản phẩm đƣợc tạo từ loại trồng biến đổi gen (ISAAA, 2016) Thực phẩm có nguồn gốc từ sinh vật sản phẩm biến đổi gen trải qua nhiều thử nghiệm thực phẩm lịch sử Đối với Việt Nam, việc phát biến đổi gen sản phẩm thực phẩm thực dán nhãn khơng liên quan đến an tồn thực phẩm mà để đảm bảo quyền lựa chọn ngƣời tiêu dùng Trong trình xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng biến đổi gen sản phẩm nông sản, thực phẩm, việc xác định giới hạn phát (Limit of detection - LOD), giới hạn định lƣợng (Limit of quantification - OQ) bƣớc quan trọng để khẳng định lực phịng thử nghiệm Chính vậy, để phần phục vụ tốt cho công tác giám định trồng sản phẩm biến đổi gen; thực đề tài: “Nghiên cứu giới hạn phát (LOD) biến đổi gen đậu tương sản phẩm chế biến từ đậu tương phục vụ cơng tác kiểm nghiệm”, qua khẳng định độ tin cậy, xác mặt kỹ thuật phịng thí nghiệm hoạt động theo tiêu chuẩn quốc tế ISO/IEC 17025 theo tiêu chí tồn cầu hóa “M t tiêu chuẩn - m t lần thử nghi m - chấp nhận nơi” CHƢƠNG NG N TÀI LIỆU 1.1 Cây trồng biến đổi gen 1.1.1 Khái niệm Cây trồng biến đổi gen Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) loại trồng đƣợc tạo cách sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học đại, hay cịn gọi kỹ thuật di truyền, cơng nghệ gene hay công nghệ DNA tái tổ hợp, để chuyển gene chọn lọc nhằm tạo trồng mang tính trạng mong muốn Đậu tƣơng biến đổi gen đƣợc tạo cách sử dụng kỹ thuật công nghệ sinh học chuyển gen có giá trị để tạo giống đậu tƣơng mang tính trạng mong mn nhƣ chống chịu tốt với điều kiện bất lợi môi trƣờng, hay chống chịu sâu bệnh, cho suất cao 1.1.2 Tình hình sản xuất thương mại hóa trồng biến đổi gen Theo số liệu báo cáo Trung tâm dịch vụ Quốc tế tiếp thu ứng dụng Công nghệ Sinh học Nông nghiệp (IS , 2015), đến nhà khoa học giới tập trung nghiên cứu, phát triển trồng biến đổi gen cho 24 loại trồng khác với 364 kiện (Event) chuyển gen đƣợc tạo ra, bao gồm nhóm lấy hạt, lấy dầu, lấy củ, lấy quả, lấy sợi hoa  Tình hình phát triển trồng biến đổi gen Theo báo cáo hàng năm IS , sau 19 năm phát triển (kể từ năm 1996), loại trồng chuyển gen đƣợc thƣơng mai hóa ngày tăng qua năm Tính riêng năm 2014, trồng biến đổi gen đƣợc trồng rộng rãi 28 nƣớc với tổng diện tích khoảng 181,5 triệu (số nƣớc trồng biến đổi gen tăng lần, diện tích tăng 100 lần so với năm 1996), tỷ lệ tăng trƣởng năm khoảng đến 4% Trong Hoa kỳ quốc gia đứng đầu diện tích trồng chuyển gen giới (73,1 triệu ha, chiếm 40%), tiếp đến Barazil (42,2 triệu ha), Argentina (24,3 triệu ha), Ấn Độ (11,6 triệu ha), Canada (11,6 triệu ha) Điều đáng ý số quốc gia phát triển đƣa trồng biến đổi gen vào canh tác ngày tăng nƣớc phát triển (đặc biệt nƣớc châu Âu) hạn chế mở rộng diện tích Khoảng 10 năm đầu, từ 19962006, nƣớc phát triển sử dụng trồng biến đổi gen canh tác cịn Tuy nhiên, khoảng cách dần thu hẹp năm sau Trong năm gần đây, diện tích trồng biến đổi gen nƣớc phát triển cao nƣớc phát triển (khoảng 100 triệu năm 2016 so với 81 triệu năm 2014) Điều cho thấy, trồng chuyển gen đóng góp tích cực cho phát triển nông nghiệp tăng trƣởng kinh tế đặc biệt nƣớc phát triển giảm đƣợc chi phí sản xuất, nâng cao suất Dựa vào kết 147 nghiên cứu đƣợc thực 20 năm cho thấy, việc trồng chuyển gen giảm 37% lƣợng phân bón hóa học, tăng 22% suất trồng, lợi nhuận ngƣời nông dân tăng 68% Ngoài ra, việc trồng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ, kháng sâu bệnh hại giảm đáng kể lƣợng thuốc trừ sâu sử dụng, góp phần hạn chế ô nhiễm môi trƣờng, cân sinh thái Mặc dù nhiều gen đƣợc ứng dụng chuyển vào nhƣng có nhóm tính trạng đƣợc phép thƣơng mại hóa (Bảng 1.1), bao gồm khả chống chịu stress phi sinh học, suất hạt, kháng côn trùng, kháng thuốc diệt cỏ, nâng cao chất lƣợng, kiểm sốt thụ phấn Trong nhóm trồng chuyển gen đƣợc canh tác chủ yếu gồm: kháng thuốc diệt cỏ (trên 100 triệu ha), đa tính trạng (khoảng 50 triệu ha), kháng trùng (khoảng 27 triệu ha) Đậu tƣơng, bông, ngô cải dầu trồng đƣợc canh tác rộng rãi Trong tổng số 111 triệu đậu tƣơng, giống chuyển gen chiếm 85% diện tích, bơng chiếm 68% tổng số 37 triệu ha, ngô chiếm 30% tổng số 184 triệu ha, cải dầu chiếm 25% 36 triệu Bảng 3.3: Kết Realtime CR kiện MON87708 nồng độ 0,01% Nền mẫu Giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) 10 lần lặp lại Kết định tính Đậu tƣơng hạt Khơng phát Không phát Bột đậu tƣơng Không phát Không phát Sữa đậu nành Không phát Không phát Thức ăn chăn nuôi Không phát Không phát Đậu hũ Không phát Không phát Hình 3.3 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87708 nồng độ 0,01% Bảng 3.4: Kết Realtime CR kiện MON87701 nồng độ 0,01% Nền mẫu Giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) 10 lần lặp lại Kết định tính Đậu tƣơng hạt Không phát Không phát Bột đậu tƣơng Không phát Không phát Sữa đậu nành Không phát Không phát Thức ăn chăn nuôi Không phát Không phát Đậu hũ Không phát Khơng phát 29 Hình 3.4 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87701 nồng độ 0,01% Kết khảo sát điểm nồng độ 0,01% DNA sản phẩm biến đổi gen với DNA mẫu Đậu tƣơng hạt, Bột đậu tƣơng, Sữa đậu nành, Thức ăn chăn nuôi, Đậu hũ - nồng độ thấp dãy phản ứng cho thấy, toàn phản ứng Realtime PCR tất kiện (MON87705, MON87708, MON87701) thể hình 3.2, 3.3 3.4 không phát đƣợc sản phẩm biến đổi gen Vì vậy, kết luận điểm nồng độ 0.01% DNA sản phẩm biến đổi gen giá trị LOD để xác định mẫu chuyển gen phƣơng pháp b Khảo sát điểm nồng độ 0.02% Bảng 3.5: Kết Realtime CR kiện MON87705 điểm nồng độ 0.02% Nền mẫu Bột đậu Sữa đậu Thức ăn hạt tƣơng nành chăn nuôi 37,07 37,72 37,64 38,65 37,98 37,13 37,89 K.Phát 38,23 38,65 37,10 38,05 38,14 38,52 38,31 STT ậu tƣơng 30 ậu hũ 37,22 37,93 38,46 37,98 K.Phát K.Phát 38,20 37,84 39,15 38,91 37,65 37,81 38,86 38,23 39,30 37,60 K.Phát 39,28 38,64 38,32 37,31 37,86 38,64 38,91 38,13 37,55 37,66 37,98 K.Phát 38,64 10 37,92 37,74 38,23 38,32 38,31 Hình 3.5 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87705 nồng độ 0,02% Tại điểm nồng độ 0,02 %, phát 45 phản ứng Realtime PCR với sản phẩm GMO mẫu phân tích, giá trị Ct trung bình nằm khoảng 37,07 đến 39,30 kết phản ứng Realtime PCR không xác định Nhƣ vậy, mẫu 10 lần lặp có giá trị Ct không xác định (Bảng 3.5 hình 3.5) Các giá trị phát Ct tƣơng đối cao, mẫu đƣợc xem âm tính với giá trị Ct>39 (các mẫu có giá trị Ct ≤ 39 đƣợc xem dƣơng tính, đƣợc khẳng định nồng độ 0,1% DNA mẫu biến đổi gen phƣơng Realtime PCR Phịng thí nghiệm Giám định Sinh vật Sản phẩm biết đổi gen – Viện Di 31 truyền Nông nghiệp ) chứng tỏ mức độ phát nồng độ 0.02% DNA sản phẩm biến đổi gen khơng cao (chƣa đảm bảo xác 100%) Bảng 3.6: Kết Realtime CR kiện MON87708 điểm nồng độ 0.02% Nền mẫu Bột đậu Sữa đậu Thức ăn hạt tƣơng nành chăn nuôi K.Phát 37.68 K.Phát 38.31 38.31 38,65 37,48 37,51 38,98 39,12 39,03 38,65 37,32 K.Phát 38,56 37,64 K.Phát 38,12 38,32 38,41 37,65 38,59 37,89 38,45 38,69 37,35 37,87 38,35 39,11 38,65 38,16 38,15 37,45 38,52 38,93 38,65 38,31 37,58 38,78 K.Phát 38,89 39,01 38,02 38,94 38,47 10 37,97 38,98 37,94 K.Phát 38,55 STT ậu tƣơng ậu hũ Hình 3.6 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87708 nồng độ 0,02% 32 Tại điểm nồng độ 0.02%, phát 44 phản ứng Realtime PCR với sản phẩm GMO mẫu phân tích, giá trị Ct trung bình khoảng 37.35 đến 39.12 kết không xác định đƣợc giá trị Ct (K Phát hiện) Nhƣ vậy, mẫu (Đậu tƣơng hạt, Bột đậu tƣơng, Sữa đậu nành, Đậu hũ) 10 lần lặp có giá trị Ct không xác định mẫu Thức ăn chăn ni 10 lần lặp có giá trị Ct khơng xác định (Bảng 3.6 hình 3.6) Các giá trị phát Ct tƣơng đối cao, mẫu đƣợc xem âm tính với giá trị Ct>39, chứng tỏ mức độ phát nồng độ 0.02% DNA sản phẩm biến đổi gen không cao (chƣa đảm bảo xác 100%) Bảng 3.7: Kết Realtime CR kiện MON87701 Nền mẫu Bột đậu Sữa đậu Thức ăn hạt tƣơng nành chăn nuôi 38,51 38,20 37,44 38,16 38,15 38,02 38,15 37,65 39,12 K.Phát 37,80 38,59 K.Phát 37,87 37,59 38,15 38,52 37,20 38,15 39,01 37,99 38,90 38,03 38,56 37,91 K.Phát 37,98 37,15 38,35 38,84 38,32 K.Phát 37,98 38,47 38,31 37,51 38,35 37,32 K.Phát 38,57 37,82 38,47 37,15 38,72 38,12 10 37,77 38,33 37,53 38,12 38,43 STT ậu tƣơng 33 ậu hũ Hình 3.7 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87701 nồng độ 0,02% Đối với kiện MON87701, điểm nồng độ DNA bổ sung 0.02%, phát 45 phản ứng Realtime PCR với sản phẩm GMO mẫu phân tích, giá trị Ct trung bình khoảng 37.15 đến 39.12 kết không xác định đƣợc giá trị Ct Nhƣ mẫu 10 lần lặp có giá trị Ct khơng xác định (Bảng 3.7 hình 3.7) mẫu phản ứng đƣợc xem âm tính với giá trị Ct>39, chứng tỏ mức độ phát nồng độ 0.02% DNA sản phẩm biến đổi gen không cao  Từ kết thu đƣợc cho thấy: Khảo sát nồng độ 0.02%, thực 150 phản ứng định tính mẫu kiện biến đổi gen (MON87705, MON87708, MON87701), phát tổng cộng 125 phản ứng dƣơng tính với sản phẩm GMO mẫu phân tích kiện (giá trị Ct  39) Trung bình mẫu kiện 10 lần lặp lại kiện có lần khơng phát đƣợc nồng độ 0,02% Vì vậy, giá trị nồng độ DNA mẫu chuyển gen 0.02% DNA sản phẩm khơng chuyển gen mức độ xác định phƣơng pháp khơng đảm bảo độ xác 100% nên không đƣợc chọn làm giới hạn phát phƣơng pháp 34 c Khảo sát điểm nồng độ 0,04% Bảng 3.8: Kết Realtime CR kiện MON87705 điểm nồng độ 0,04% Nền mẫu Giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) 10 lần lặp lại Kết định tính Đậu tƣơng hạt 35,97 Phát Bột đậu tƣơng 36,24 Phát Sữa đậu nành 35,76 Phát Thức ăn chăn nuôi 37,08 Phát Đậu hũ 37,25 Phát Hình 3.8 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87705 nồng độ 0,04% Đối với kiện MON87705, điểm nồng độ DNA 0,04% cho kết 10 lần lặp lại mẫu phát sản phẩm GMO, giá trị Ct trung bình từ 35,76 đến 37,25 Giá trị dƣơng tính giả âm tính giả khơng xảy (Bảng 3.8 hình 3.8) 35 Bảng 3.9: Kết Realtime CR kiện MON87708 điểm nồng độ 0,04% Nền mẫu Giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) 10 lần lặp lại Kết định tính Đậu tƣơng hạt 35,23 Phát Bột đậu tƣơng 35,78 Phát Sữa đậu nành 36,10 Phát Thức ăn chăn nuôi 37,12 Phát Đậu hũ 37,06 Phát Hình 3.9 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87708 nồng độ 0,04% Đối với kiện MON87708, điểm nồng độ DNA 0,04% cho kết 10 lần lặp lại mẫu nghiên cứu phát sản phẩm GMO, giá trị Ct trung bình từ 35,23 đến 37,12 Giá trị dƣơng tính giả âm tính giả khơng xảy (Bảng 3.9 hình 3.9) 36 Bảng 3.10: Kết Realtime CR kiện MON87701 điểm nồng độ 0,04% Nền mẫu Giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) 10 lần lặp lại Kết định tính Đậu tƣơng hạt 35,41 Phát Bột đậu tƣơng 35,92 Phát Sữa đậu nành 36,65 Phát Thức ăn chăn ni 36,97 Phát Đậu hũ 37,05 Phát Hình 3.10 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87701 nồng độ 0,04% Đối với kiện MON87701, điểm nồng độ DNA 0,04% cho kết 10 lần lặp lại mẫu nghiên cứu phát sản phẩm GMO, giá trị Ct trung bình từ 35,41 đến 37,05 Giá trị dƣơng tính giả âm tính giả khơng xảy (Bảng 3.10 hình 3.10) Từ kết thu đƣợc cho thấy: Ở nồng độ DNA 0,04% sản phẩm biến đổi gen, kết phân tích 10 lần lặp lại mẫu với kiện biến đổi gen (MON87705, MON87708, MON87701) phát sản phẩm GMO Tại điểm nổng độ này, giá trị dƣơng tính giả âm tính giả 37 tất phản ứng Chính vậy, điểm nồng độ DNA GMO 0,04% đƣợc xác định ngƣỡng giới hạn phát phƣơng pháp phân tích Realtime PCR với mẫu đậu tƣơng Phòng Giám định Sinh vật Sản phẩm biết đổi gen – Viện Di truyền Nông nghiệp d Khảo sát điểm nồng độ 0.1% Bảng 3.11: Kết Realtime CR kiện MON87705 điểm nồng độ 0.1% Nền mẫu Giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) 10 lần lặp lại Kết định tính Đậu tƣơng hạt 34,68 Phát Bột đậu tƣơng 34,84 Phát Sữa đậu nành 34,81 Phát Thức ăn chăn nuôi 35,69 Phát Đậu hũ 35,11 Phát Hình 3.11 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87705 nồng độ 0,1% Đối với kiện MON87705, điểm nồng độ DNA 0,1% cho kết 10 lần lặp lại mẫu nghiên cứu phát sản phẩm GMO, giá trị 38 Ct trung bình từ 34,68 đến 35,69 Giá trị dƣơng tính giả âm tính giả khơng xảy (Bảng 3.11 hình 3.11) Bảng 3.12: Kết Realtime CR kiện MON87708 điểm nồng độ 0.1% Nền mẫu Giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) 10 lần lặp lại Kết định tính Đậu tƣơng hạt 33,60 Phát Bột đậu tƣơng 35,02 Phát Sữa đậu nành 34,97 Phát Thức ăn chăn nuôi 35,12 Phát Đậu hũ 35,33 Phát Hình 3.12 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87708 nồng độ 0,1% Đối với kiện MON87708, điểm nồng độ DNA 0,1% cho kết 10 lần lặp lại mẫu nghiên cứu phát sản phẩm GMO, giá trị Ct trung bình từ 33,60 đến 35,33 Giá trị dƣơng tính giả âm tính giả khơng xảy (Bảng 3.12 hình 3.12) 39 Bảng 3.13: Kết Realtime CR kiện MON87701 điểm nồng độ 0.1% Đậu tƣơng hạt Giá trị chu kỳ ngƣỡng (Ct) 10 lần lặp lại 34,02 Bột đậu tƣơng 34,85 Phát Sữa đậu nành 34,57 Phát Thức ăn chăn nuôi 35,20 Phát Đậu hũ 35,18 Phát Nền mẫu Kết định tính Phát Hình 3.13 Biểu đồ kết Realtime CR kiện MON87701 nồng độ 0,1% Đối với kiện MON87701, điểm nồng độ DN 0,1% cho kết 10 lần lặp lại mẫu nghiên cứu phát sản phẩm GMO, giá trị Ct trung bình từ 34,02 đến 35,20 Giá trị dƣơng tính giả âm tính giả khơng xảy (Bảng 3.13 hình 3.13) Từ kết thu đƣợc cho thấy: Ở nồng độ DNA 0,1% sản phẩm biến đổi gen, kết phân tích 10 lần lặp lại mẫu với kiện biến đổi gen (MON87705, MON87708, MON87701) phát sản phẩm GMO (giá trị Ct trung bình từ