Nghiên cứu tính kháng carbapenem ở mức độ phân tử của acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn tại bệnh viện đa khoa thống nhất đồng nai

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN SĨ TUẤN NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG CARBAPENEM Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM KHUẨN TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THỐNG NHẤT ĐỒNG NAI LUẬN ÁN TIẾN SĨ TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN SĨ TUẤN NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG CARBAPENEM Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM KHUẨN TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THỐNG NHẤT ĐỒNG NAI Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số chuyên ngành: 60420201 Phản biện độc lập 1: PGS TS Cao Hữu Nghĩa Phản biện độc lập 2: PGS TS Nguyễn Tú Anh Phản biện 1: PGS TS BS Lý Văn Xuân Phản biện 2: PGS TS Ngô Thị Hoa Phản biện 3: PGS TS Phan Thị Phượng Trang NGƯỜI HƯỚNG DẪN PGS TS Nguyễn Thúy Hương TS BS Phạm Hùng Vân LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân tác giả Các kết nghiên cứu kết luận luận án trung thực không chép từ nguồn hình thức Việc tham khảo nguồn tài liệu (nếu có) thực trích dẫn ghi nguồn tài liệu tham khảo quy định Tác giả luận án, Chữ ký Nguyễn Sĩ Tuấn i TÓM TẮT LUẬN ÁN Acinetobacter baumannii tác nhân đa kháng thuốc hàng đầu sở y tế Việt Nam từ thập kỷ thứ kỷ 21 Các nghiên cứu từ tháng năm 2013 đến tháng 12 năm 2017 cho thấy 105 chủng A baumannii đa kháng thuốc gây nhiễm khuẩn bệnh viện Đa khoa Thống Nhất tỉnh Đồng Nai khơng cịn nhạy cảm (kháng 100%) với hầu hết kháng sinh chủ yếu để điều trị nhiễm khuẩn trực khuẩn Gram âm (các beta-lactam; fluoro-quinolon; beta-lactam kết hợp chất ức chế betalactamase; aminoglycoside – ngoại trừ amikacin nhạy cảm 10,4% tobramycin nhạy cảm 7,5%), kể nhóm kháng sinh xem lựa chọn cuối để điều trị nhiễm khuẩn A baumannii carbapenem (meropenem imipenem) A baumannii đa đề kháng nhạy cảm 100% với kháng sinh colistin 99,0% với kháng sinh tigecycline Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) meropenem A baumannii nghiên cứu cao, với 100% chủng có MIC ≥ 32µg/ml Trong hai kháng sinh cịn nhạy cảm cao với A baumannii đa kháng thuốc, 87% MIC colistin 1µg/ml có 0,9% MIC tigecycline > µg/ml Các kiểu phối hợp kháng sinh meropenem/colistin meropenem/rifampicin có tác dụng hiệp đồng cộng lực với tỷ lệ cao, 94,3% 81,9% lên chủng A baumannii Tuy nhiên, tổ hợp tigecycline/colistin cho tác dụng hiệp đồng cộng lực với tỷ lệ 36,2% Tác dụng colistin nồng độ từ µg/ml rifampicin nồng độ µg/ml MIC có khả chuyển chủng A baumannii từ không nhạy meropenem thành nhạy với meropenem với tỷ lệ cao Về nhóm gen liên quan đến tính kháng carbapenem, nghiên cứu cho thấy nhóm gen mã hóa carbapenemase lớp D gồm blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-58 phân bố A baumannii với tỷ lệ 97,1%; 79% 7,6% Trong đó, gen blaNDM-1 mã hóa carbapenemase lớp B phân bố A baumannii với tỷ lệ 13,3% chưa ghi nhận có gen blaKPC mã hóa carbapenemase lớp A A baumannii Trong nghiên cứu này, có 93,3% chủng A baumannii đa kháng thuốc có mang trình tự chèn Aba1 (ISAba1) Hơn nữa, A baumannii đa kháng thuốc đề kháng carbapenem có tích lũy nhiều gen kháng, với 80% chủng có mang đồng thời gen liên quan đến tính kháng carbapenem ii có 97,6% chủng có ISAba1 gen liên quan đến tính kháng carbapenem Để tìm hiểu sâu đặc điểm hệ gen, mối quan hệ phát sinh loài hệ gen so sánh chủng A baumannii nghiên cứu, chủng đặc trưng gen liên quan đến tính kháng carbapenem chọn để giải trình tự phân tích hệ gen (Chủng DMS06669 DMS06670) Lắp ráp trình tự tồn hệ gen chủng DMS06669 DMS06670 thu kích thước gen ước tính 4,2Mb 3,8Mb Bằng phương pháp này, việc xác định gen kháng thuốc tiềm tiến hành nghiên cứu cho thấy xác suất chủng DMS06669 DMS06670 mầm bệnh người 85,8% 85,3%, với tương ứng 632 622 họ protein gây bệnh Ngồi ra, việc phân tích nhóm tương đồng (COG) chuỗi protein chủng A baumannii DMS06669 DMS06670 so sánh với bốn hệ gen khác cho thấy cụm protein tương đồng chịu trách nhiệm cho nhiều thuốc tồn chủng kháng kháng sinh cao Phân tích phát sinh lồi cho thấy, dựa giá trị nhận dạng nucleotit trung bình, A baumannii DMS06670 nhóm họ hàng với hai chủng A baumannii LAC-4, BJAB0715 chủng A baumannii DMS06669 nhóm chủng A baumannii gồm ATCC_17978, D1279779, ZW85-1, ab031, SDF Cuối cùng, phân tích so sánh 23 hệ gen sẵn có chủng A baumannii cho thấy pan-genome gồm 15.883 gen Tiến hành phân lập in-vitro 19 gen kháng thuốc phương pháp PCR xác nhận lại 19 trình tự DNA gen kháng thuốc phương pháp Sanger cải tiến Như vậy, chủng A baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện đề kháng với hầu hết nhóm kháng sinh nhạy cảm cao với colistin, tigecyline, rifampicin Việc phối hợp in-vitro carbapenem meropenem với colistin, rifampicin tạo tác dụng hiệp đồng cộng lực để điều trị nhiễm khuẩn A baumannii đề kháng carbapenem Đa số đề kháng carbapenem A baumannii có tích lũy ba gen mã hóa enzyme carbapenemase Việc giải trình tự hệ gen hai chủng đặc trưng giúp hiểu rõ chế mức độ phân tử kháng thuốc kháng sinh A baumannii iii ABSTRACT Acinetobacter baumannii is the leading multidrug resistant agent in Vietnamese health care systems in the second decade of the 21st century Studies from January 2013 to December 2017 revealed that 105 strains of multidrug-resistant A baumannii, which cause infectious diseases in Dong Nai Genral Hospital, were not 100% sensitive to most antibiotics for the treatment of Gram-negative bacillii These antibiotics include beta-lactam; fluoroquinolones; beta-lactam/beta-lactamase inhibitors combinations; aminoglycosides, although they are remaining sensitive to amikacin (10,4%) and tobramycin (7,5%) These agents are resistant even with carbapenem (meropenem and imipenem) – the rescue strategy for the treatment of infections caused by A baumannii Acinetobacter baumannii was 100% sensitive to only one antibiotic, named colistin and 99.0% to tigecycline Meropenem/colistin and meropenem/rifampicin showed strong synergistic and additive effects on A baumannii, accounted for 94.3% and 81.9%, respectively However, the combination of tigecycline and colistin only showed synergistic and additive effects at just 36.2% Effects of colistin at concentrations of μg/ml or rifampicin at μg/ml under MIC are likely to transfer the A baumannii from meropenem insensitivity to meropenem in a high Considering group of gens related to carbapenem resistance, the study showed that gens encoding the class-D carbapenemase, namely blaOXA-51, blaOXA-23, blaOXA-58 were distributed in A baumannii with 97.1%; 79% and 7.6% respectively Meanwhile, the figure for blaNDM-1, genes encoding class B carbapenemase were about 13.3% and gene blaKPC encoding the A-type carbapenemase in A baumannii has not been reported In this study, 93.3% of multidrug-resistant A baumannii strains had an Aba1 insertion sequence (ISAba1) Furthermore, carbapenem resistant in multidrug-resistant A baumannii is due to the accumulation of resistant genes, with 80% of those containing three genes associated with carbapenem resistance simultaneously and 97.6% of which have ISAba1 in three genes To better understand the genomic characteristics and phylogentic relationships and comparative genomics of A baumannii strains in this study, the two most typical strains of carbapenem resistance genes were selected for sequencing and gentic iv analysis (Strain DMS06669 and strain DMS06670) Assembly of whole-genome shotgun sequences of strain DMS06669 and DMS06670 yielded an estimated genome size of 4.2Mb and 3.8 Mb In this manner, the identification of potential antibiotic resistance genes was conducted, and we predicted that the probability of A baumannii DMS06669 (our strain in previous study) and DMS06670 as a human pathogen is 85.8% and 85.3%, with 632 and 622 pathogenic families, respectively Additionally, the clusters of orthologous groups (COGs) analysis in protein sequence of A baumannii strain DMS06669 and DMS06670 was compared with the other four genomes showed that the orthologous protein clusters responsible for multi-drug exist inside highly antimicrobial resistant strains Phylogenetic analysis revealed that, based on the average nucleotide identity value, A baumannii DMS06670 is a sister group to the LAC-4 and BJAB0715 strains of A baumannii while A baumannii strain DMS06669 is a sister group to strains ATCC_17978, D1279779, ZW85-1, ab031, and SDF Lastly, comparative analysis of twenty-three available genomes of A baumanii strains revealed a pan-genome consisting of 15,883 genes Antibiotics resistance genes in-vitro (19 genes) were isolated by PCR and re-confirmed by improved Sanger method So, A baumannii strains causing infections in hospitals has been resistant to almost all antibiotic groups and is only highly susceptible to colistin, tigecline, rifampicin The combination of carbapenem such as meropenem with colistin or rifampicin can create synergistic and additive effects to treat infections of carbapenem-resistant A baumannii Most of the carbapenem resistance of A baumannii has accumulated three genes encoding for carbapenemase Next generation sequencing of the two specific strains provide insight into the molecular mechanisms leading to antibiotic resistance in A baumannii v LỜI CÁM ƠN Lời tơi muốn bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Cô, PGS TS Nguyễn Thúy Hương, Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh, người hướng dẫn khoa học, giúp đỡ, động viên tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy, Tiến sĩ – Bác sĩ Phạm Hùng Vân, Chủ tịch Hội Vi sinh Lâm sàng Thành phố Hồ Chí Minh, người ln đồng hành, giúp đỡ tơi, bảo truyền cảm hứng cho suốt trình học tập, thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ – Bác sĩ Phạm Văn Dũng, Giám đốc Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất tỉnh Đồng Nai, người dìu dắt tơi ngày đầu tơi công tác đây, người giúp đỡ, cố vấn tạo điều kiện tốt vật chất tinh thần để thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Nguyễn Cường, Trưởng phịng Tin sinh học – Viện Cơng nghệ Sinh học Việt Nam, người bảo giúp đỡ nhiều để tơi thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc, tập thể khoa Vi sinh - bệnh viện Đa khoa Thống Nhất tỉnh Đồng Nai Thầy Cô giáo Bộ môn Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Tp HCM bạn bè, đồng nghiệp hết lòng tạo điều kiện, giúp đỡ, hỗ trợ tơi suốt q trình thực hồn thành luận án Cuối cùng, tơi ln ghi nhớ cơng ơn tình u thương bố mẹ, cha mẹ dành cho ủng hộ, động viên, thương u, chăm sóc, khích lệ hết lịng vợ, hai anh chị gia đình, người bên tôi, hậu phương vững để tơi n tâm học tập hồn thành luận án này./ Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2019 NCS Nguyễn Sĩ Tuấn vi MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN vi MỤC LỤC vii DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xiii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xvi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chi Acinetobacter 1.1.1 Acinetobacter baumannii 1.1.2 Sinh bệnh học đề kháng kháng sinh 1.2 Các yếu tố độc lực Acinetobacter baumannii 1.3 Nhóm kháng sinh Carbapenem 13 1.4 1.5 1.3.1 Hóa học 13 1.3.2 Cơ chế tác động 13 1.3.3 Sự đề kháng 14 Carbapenemase 16 1.4.1 Carbapenemase Ambler lớp A 16 1.4.2 Carbapenemase Ambler lớp B – Metallo-beta-lactamase 17 1.4.3 Carbapenemase Ambler lớp D – Oxacillinase 19 1.4.4 Các trình tự chèn (IS) Acinetobacter 32 Sự đề kháng kháng sinh Acinetobacter baumannii 37 1.5.1 Tình hình đề kháng carbapenem Nam Đơng Nam Á 38 1.5.2 Nghiên cứu Acinetobacter baumannii kháng thuốc Việt Nam 42 1.6 Cơ chế tác động kháng sinh phối hợp 46 1.7 Giải trình tự hệ gen hệ (Next Genration Sequencing, NGS) 49 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 51 2.1 Địa điểm thời gian thực 51 2.2 Vật liệu 51 2.2.1 Hóa chất 51 2.2.2 Chủng vi khuẩn 51 2.3 Sơ đồ nghiên cứu luận án 53 2.4 Các phương pháp nghiên cứu 55 2.4.1 Các phương pháp vi sinh lâm sàng 55 2.4.1.1 Phương pháp cấy đàm 55 vii 2.4.1.2 Phương pháp định danh kháng sinh đồ hệ thống tự động 56 2.4.1.3 Phương pháp hiệp đồng bàn cờ 56 2.4.2 Các phương pháp sinh học phân tử 60 2.4.2.1 Phương pháp tách chiết DNA 60 2.4.2.2 Phương pháp PCR đa mồi 61 2.4.2.3 Phương pháp realtime PCR 63 2.4.2.4 Phương pháp cải tiến phương pháp Sanger 65 2.4.2.5 Phương pháp Illumina sequencing 67 2.4.2.6 Phương pháp điện di gel-agarose 70 2.4.3 Các phương pháp tin – sinh học 71 2.4.3.1 Phương pháp thiết kế mồi 71 2.4.3.2 Phương pháp đánh giá tiền xử lý liệu hệ gen 75 2.4.3.3 Phương pháp lắp ráp hệ gen 75 2.4.3.4 Phương pháp giải chức dự đoán hệ gen 75 2.4.3.5 Phương pháp so sánh toàn hệ gen phân tích phát sinh lồi 76 2.4.4 Các phương pháp thống kê 77 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .78 3.1 Đặc điểm kháng kháng sinh, tỷ lệ gen liên quan đến kháng carbapenem tác dụng diệt khuẩn in-vitro phối hợp kháng sinh lên Acinetobacter baumannii 78 3.1.1 Tỷ lệ đề kháng kháng sinh Acinetobacter baumannii 78 3.1.2 MIC colistin, meropenem, rifampicin tigecycline Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem 81 3.1.3 Tác dụng diệt khuẩn in-vitro phối hợp kháng sinh lên Acinetobacter baumannii đề kháng carbapenem 87 3.1.4 Tỷ lệ gen thường gặp có liên quan đến tính kháng carbapenem Acinetobacter baumannii mối liên quan với kiểu tác dụng phối hợp kháng sinh 105 3.2 Đặc điểm hệ gen, yếu tố độc lực gen đề kháng kháng sinh in-silico chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng phương pháp Tin – Sinh học 110 3.2.1 Đặc điểm chung chủng chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng 111 3.2.2 Phân tích phát sinh loài toàn hệ gen chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng 114 3.2.3 Phân tích gen liên quan đến độc lực kháng kháng sinh in-silico chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng 115 3.2.4 Phân tích gen ortholog chủng A baumannii đặc trưng 125 3.2.5 Phân tích pan-genome chủng A baumannii đặc trưng 127 3.3 Khuếch đại gen đề kháng kháng sinh từ kết in-silico chủng Acinetobacter baumannii đặc trưng phương pháp thực nghiệm Sinh học Phân tử 130 viii GTAGTTCAAAGTTTCAGCAAGTTGAACAAGACGTTAAGGCAATTGAAGT TTCTCTTTCTGCTCGTATAGGTGTTTCCGTTCTTGATACTCAAAATGGAG AATATTGGGATTACAATGGCAATCAGCGCTTCCCGTTAACAAGTACTTTT AAAACAATAGCTTGCGCTAAATTACTATATGATGCTGAGCAAGGAAAAG TTAATCCCAATAGTACAGTCGAGATTAAGAAAGCAGATCTTGTGACCTA TTCCCCTGTAATAGAAAAGCAAGTAGGGCAGGCAATCACACTCGATGAT GCGTGCTTCGCAACTATGACTACAAGTGATAATACTGCGGCAAATATCA TCCTAAGTGCTGTAGGTGGCCCCAAAGGCGTTACTGATTTTTTAAGACA AATTGGGGACAAAGAGACTCGTCTAGACCGTATTGAGCCTGATTTAAAT GAAGGTAAGCTCGGTGATTTGAGGGATACGACAACTCCTAAGGCAATA GCCAGTACTTTGAATAAATTTTTATTTGGTTCCGCGCTATCTGAAATGAA CCAGAAAAAATTAGAGTCTTGGATGGTGAACAATCAAGTCACTGGTAAT TTACTACGTTCAGTATTGCCGGCGGGATGGAACATTGCGGATCGCTCAG GTGCTGGCGGATTTGGTGCTCGGAGTATTACAGCAGTTGTGTGGAGTGA GCATCAAGCCCCAATTATTGTGAGCATCTATCTAGCTCAAACACAGGCT TCAATGGCAGAGCGAAATGATGCGATTGTTAAAATTGGTCATTCAATTT TTGACGTTTATACATCACAGTCGCGCTGA F19: 5'-atgcttttatataaaatgtgtgac-3' Length=24 A=8,0 G=4,0 T=10,0 C=2,0 CG=25,0% Linguistic complexity = 69% Primer's PCR efficiency = 47% dG = -24,2 kcal/mol dH = -178,6 kcal/mol dS = -523,1 cal/K mol Tm = 48,1°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 50,1°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 241000 L/(mol·cm) Molecular weight = 7381 g/mol OD260 = 1,000 µg = 30,627 nmol = 4,149 100µM = dissolve in 41,5 µl of MQ-water or TE buffer R19: 5'-tcagcgcgactgtgatg-3' Length=17 A=3,0 G=6,0 T=4,0 C=4,0 CG=58,8% Linguistic complexity = 83% Primer's PCR efficiency = 70% dG = -22,8 kcal/mol dH = -136,6 kcal/mol dS = -384,2 cal/K mol Tm = 54,3°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 54,9°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 160800 L/(mol·cm) Molecular weight = 5226 g/mol 230 OD260 = 1,000 µg = 32,500 nmol = 6,219 100µM = dissolve in 62,2 µl of MQ-water or TE buffer 22 DMS06670_scf_13_3 Gene dự đoán Gene kháng DMS06670_scf_13_3 sul1 Lớp kháng sinh Length (bp) Tình trạng bị kháng Sulphonamide 348 Complete ATGAAAGGCTGGCTTTTTCTTGTTATCGCAATAGTTGGCGAAGTAATCGC AACATCCGCATTAAAATCTAGCGAGGGCTTTACTAAGCTTGCCCCTTCC GCCGTTGTCATAATCGGTTATGGCATCGCATTTTATTTTCTTTCTCTGGTT CTGAAATCCATCCCTGTCGGTGTTGCTTATGCAGTCTGGTCGGGACTCGG CGTCGTCATAATTACAGCCATTGCCTGGTTGCTTCATGGGCAAAAGCTTG ATGCGTGGGGCTTTGTAGGTATGGGGCTCATAATTGCTGCCTTTTTGCTC GCCCGATCCCCATCGTGGAAGTCGCTGCGGAGGCCGACGCCATGGTGA F20: 5'-atgaaaggctggctttttcttg-3' Length=22 A=4,0 G=6,0 T=9,0 C=3,0 CG=40,9% Linguistic complexity = 72% Primer's PCR efficiency = 60% dG = -26,1 kcal/mol dH = -166,7 kcal/mol dS = -476,6 cal/K mol Tm = 54,0°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 54,7°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 204800 L/(mol·cm) Molecular weight = 6771 g/mol OD260 = 1,000 µg = 33,062 nmol = 4,883 100µM = dissolve in 48,8 µl of MQ-water or TE buffer R20: 5'-tcaccatggcgtcgg-3' Length=15 A=2,0 G=5,0 T=3,0 C=5,0 CG=66,7% Linguistic complexity = 87% Primer's PCR efficiency = 57% dG = -20,8 kcal/mol dH = -118,5 kcal/mol dS = -330,4 cal/K mol Tm = 52,9°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 54,0°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 138000 L/(mol·cm) Molecular weight = 4569 g/mol OD260 = 1,000 231 µg = 33,109 nmol = 7,246 100µM = dissolve in 72,5 µl of MQ-water or TE buffer 23 DMS06670_scf_13_4 Gene dự đoán Gene kháng DMS06670_scf_13_4 sul1 Lớp kháng sinh Length (bp) Tình trạng bị kháng Sulphonamide 840 Complete ATGGTGACGGTGTTCGGCATTCTGAATCTCACCGAGGACTCCTTCTTCGA TGAGAGCCGGCGGCTAGACCCCGCCGGCGCTGTCACCGCGGCGATCGA AATGCTGCGAGTCGGATCAGACGTCGTGGATGTCGGACCGGCCGCCAGC CATCCGGACGCGAGGCCTGTATCGCCGGCCGATGAGATCAGACGTATTG CGCCGCTCTTAGACGCCCTGTCCGATCAGATGCACCGTGTTTCAATCGAC AGCTTCCAACCGGAAACCCAGCGCTATGCGCTCAAGCGCGGCGTGGGCT ACCTGAACGATATCCAAGGATTTCCTGACCCTGCGCTCTATCCCGATATT GCTGAGGCGGACTGCAGGCTGGTGGTTATGCACTCAGCGCAGCGGGATG GCATCGCCACCCGCACCGGTCACCTTCGACCCGAAGACGCGCTCGACGA GATTGTGCGGTTCTTCGAGGCGCGGGTTTCCGCCTTGCGACGGAGCGGG GTCGCTGCCGACCGGCTCATCCTCGATCCGGGGATGGGATTTTTCTTGAG CCCCGCACCGGAAACATCGCTGCACGTGCTGTCGAACCTTCAAAAGCTG AAGTCGGCGTTGGGGCTTCCGCTATTGGTCTCGGTGTCGCGGAAATCCTT CTTGGGCGCCACCGTTGGCCTTCCTGTAAAGGATCTGGGTCCAGCGAGC CTTGCGGCGGAACTTCACGCGATCGGCAATGGCGCTGACTACGTCCGCA CCCACGCGCCTGGAGATCTGCGAAGCGCAATCACCTTCTCGGAAACCCT CGCGAAATTTCGCAGTCGCGACGCCAGAGACCGAGGGTTAGATCATGCC TAG F7: 5'-atggtgacggtgttcgg-3' Tm = 53,6°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 54,9°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) R21: 5'-ctaggcatgatctaaccctcg-3' Length=21 A=5,0 G=4,0 T=5,0 C=7,0 CG=52,4% Linguistic complexity = 92% Primer's PCR efficiency = 80% dG = -25,2 kcal/mol dH = -157,4 kcal/mol dS = -448,3 cal/K mol Tm = 53,9°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 58,2°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 196400 L/(mol·cm) Molecular weight = 6366 g/mol 232 OD260 = 1,000 µg = 32,413 nmol = 5,092 100µM = dissolve in 50,9 µl of MQ-water or TE buffer 24 DMS06670_ctg_47:1138-1998 Gene dự đoán DMS06670_ctg_47: 1138-1998 Gene kháng Lớp kháng sinh Length (bp) Tình trạng bị kháng aac(3)-IId Aminoglycoside 861 N/A CTAACCTGAAGGCTCGCAAGAGCGCTCGACGGCCTCGTGCGGAGGCAC GATCGGAGTGGTTCCGAAATGCTTCTCAAGATAGGTGACGCCGAACGTC ACGATGTCCTGCGCGTCGAACAGGTAGCACTGAGCAAAGCCCACGACA CCTTCTCGATGGCGACCGAGCTTCACGTAAGCATTTGCTATAGTTTCAAC CGCATCCGGCTTTCCTTCGATAGCAAAGCAATCGAGAATGCCGTTTGAA TCGTAATCCGATGCCGTTTTCCAGGCGACTTCACCGTCTCTTCCAAGCAT CGGCATCTCATACGTCACCCACCGTTTGTTGGGGATATCGGCAACCGCC TCGGCGTAGTGCAATGCGGTAACGGAGTTTAGCGGCGCACCCAACAGCA GGGCCTTCCCGCCAAGGCGAACGAACCGCTCGACGGGCGATCCTTCCCC CAAGGCGTGACCGAGTTCGTGAGGCTCCGTCAGCGTTTCAGCCAGCGGA CCAACCGCGACCATCGATGCATCGGGGTGCGCGCTGCGCCGCGCGCCGG GGGCTTGAACCAGAAATTGATTCAGCAGGCCGAACCCACGGTAAGTCCC GGCTGTTGCGGGATCGAACGGCAGCCAGGTACGGCGGGCTTCGTCATCC AGCCGAGCGCCATTCAGAGTCTCCTCGTAGGGTGATCGGTCCCACGACG CGTATCCCATCACAGTGCCAGTCGGCCCAACCGCGGAGCGTAACGCGGC AACGACCGTCTCCGCTCCTCCTTCGACCGGACCAATCGCTTTAAGTGAG GCATGCACCATCAAGAGGTCACCGGTTTGGACTCCGAGTTTTTGAAGCG CCTCCGTTATTGCCTTCCGCGTATGCAT F: 5'-ctaacctgaaggctcgca-3' Length=18 A=5.0 G=4.0 T=3.0 C=6.0 CG=55.6% Linguistic complexity = 92% Primer's PCR efficiency = 87% dG = -23.0 kcal/mol dH = -139.2 kcal/mol dS = -393.4 cal/K mol Tm = 53.3°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 55.3°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 170300 L/(mol·cm) Molecular weight = 5469 g/mol OD260 = 1.000 µg = 32.114 nmol = 5.872 233 100µM = dissolve in 58.7 µl of MQ-water or TE buffer R: 5'-atgcatacgcggaaggc-3' Length=17 A=5.0 G=6.0 T=2.0 C=4.0 CG=58.8% Linguistic complexity = 86% Primer's PCR efficiency = 70% dG = -23.0 kcal/mol dH = -134.8 kcal/mol dS = -378.2 cal/K mol Tm = 54.7°C (Allawi's thermodynamics parameters (Biochemistry,1997, 36:1058110594) Tm = 54.9°C (Tm = 77.1 + 11.7Log[K+] + (41(G + C) - 528)/L) Extinction coefficient = 169800 L/(mol·cm) Molecular weight = 5244 g/mol OD260 = 1.000 µg = 30.883 nmol = 5.889 100µM = dissolve in 58.9 µl of MQ-water or TE buffer 234 Phụ lục Danh sách bệnh nhân tham gia nghiên cứu CODE HỌ TÊN BỆNH NHÂN NĂM SINH GIỚI KHOA CHẨN ĐOÁN A001 LE CHI N 1983 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A002 PHAM VAN T 1986 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A003 TRINH VAN P 1970 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A004 NGUYEN THI N 1951 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A005 HOANG NGOC T 1942 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A006 NGUYEN XUAN U 1950 Nam Nội TH Không viêm phổi A007 NGUYEN THI Q 1927 Nữ Nội TH Viêm phổi A008 PHAM M 1945 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A009 TRAN THI L 1942 Nữ Nội TH Viêm phổi A012 TRAN THI K 1935 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A013 CHUONG A S 1938 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A014 DO VAN N 1929 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A015 PHAM VAN P 1922 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A016 HUYNH VAN O 1921 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A018 PHAM VAN P 1922 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A020 VO DANH N 1921 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A022 PHAM THI M 1949 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A028 LE THI T 1939 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A029 LIEU KIM H 1957 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A030 CAO THI N 1959 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A031 NGUYEN VAN M 1927 Nam CTCH-Bỏng Không viêm phổi A034 NGUYEN KIM C 1948 Nam Nội TH Viêm phổi A036 NGUYEN THI C 1937 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A038 LE VAN D 1997 Nam CTCH-Bỏng Không viêm phổi A051 TRAN VAN D 1935 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A053 VU VAN D 1956 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A057 VUONG CON H 1954 Nam Nội TM Không viêm phổi A065 NGUYEN XUAN N 1950 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi 235 A066 NGUYEN THI KIM N 1969 Nữ CTCH-Bỏng Không viêm phổi A067 CU THI T 1935 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A081 NGUYEN VU P 1940 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A088 NGUYEN VAN T 1954 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A091 KHONG MINH H 1930 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A101 HOA K 1936 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A102 NGUYEN DUC N 1957 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A105 BUI DUY Q 1948 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A106 CHU THI T 1943 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A107 TRAN DINH K 1927 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A108 VU THI N 1930 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A109 LE THI L 1937 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A111 NGUYEN XUAN U (lần 1) 1950 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A112 NGUYEN SY B 1947 Nam Nội TH Viêm phổi A113 DINH VAN L 1925 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A114 NGUYEN VAN C 1932 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A115 TCHENG A P 1945 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A116 NGUYEN VAN T 1954 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A117 DO VAN T 1938 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A119 PHAM THI G 1952 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A120 NGUYEN THI MY H 1952 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A121 TRUONG THI C 1932 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A123 NGUYEN DUC T 1960 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A126 NGUYEN DUY C 1925 Nam Nội TH Viêm phổi A127 PHAM LE N (Lần 1) 1996 Nữ Nội TH Viêm phổi A128 LE ANH K 1952 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A129 PHAM THI D 1936 Nữ Nội TH Viêm phổi A130 TRAN THI SA M 1969 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A132 TRAN THI T 1925 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A134 NGUYEN THI HOAI T 1976 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A135 VU THI N 1924 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi 236 A136 LE VAN T 1960 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A137 PHAM THI N 1941 Nữ Nội TH Viêm phổi A138 PHAM LE N (Lần 2) 1996 Nữ Nội TH Viêm phổi A139 NGUYEN THI H 1930 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A140 DINH VIET S 1937 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A142 VU VAN T 1936 Nam Nội TH Viêm phổi A144 VU VAN L 1938 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A146 NGUYEN THI THANH T 1990 Nữ CTCH-Bỏng Không viêm phổi A147 PHAM THI R 1941 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A148 THAI VAN L 1924 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A150 NGUYEN DUC N 1957 Nam Nội TH Viêm phổi A151 NGUYEN MINH T 1989 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A152 NGUYEN VAN L 1982 Nam CTCH-Bỏng Viêm phổi A156 DUONG HONG P 1957 Nam Nội TH Không viêm phổi A157 NGUYEN XUAN U (lần 2) 1950 Nam Nội TH Viêm phổi A158 DONG THI NHU O 1926 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A159 HUYNH VAN H 1950 Nam CTCH-Bỏng Không viêm phổi A162 PHAM VAN T 1930 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A163 NGUYEN K 1924 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A164 DANG VAN C 1948 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A165 NGUYEN THI L 1937 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A166 DAO DUC T 1955 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A167 HO DA C 1957 Nam Nội TH Viêm phổi A168 PHAM THI L 1935 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A169 LY VAN C 1958 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A170 TO THI L 1930 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A172 DANG THI H 1941 Nữ Nội TH Không viêm phổi A174 DANG T 1944 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A175 DO VAN N 1955 Nam HSTC-CĐ Không viêm phổi A176 NGUYEN THI V 1942 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A177 HO DUC T 1942 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi 237 A180 TRAN MINH T 1949 Nam CTCH-Bỏng Không viêm phổi A182 NGUYEN DANH H 1971 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A183 VU THI M 1934 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A184 TRAN VIET H 1951 Nam Nội TM Không viêm phổi A185 LE MINH H 1984 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A186 TRAN THI L 1936 Nữ HSTC-CĐ Không viêm phổi A187 HOANG VAN P 1955 Nam Nội TH Viêm phổi A201 PHAM VAN N 1937 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A204 DO THI T (Lần phân lập 1) 1928 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A205 VU VAN T 1950 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A207 DO THI T (Lần phân lập 2) 1928 Nữ HSTC-CĐ Viêm phổi A208 NGUYEN THI Y 1939 Nữ Nội TM Không viêm phổi A209 TRAN LUU Q 1942 Nam HSTC-CĐ Viêm phổi A224 BUI THI N 1938 Nữ Nội TH Viêm phổi A225 TRAN THI T 1931 Nữ Nội TH Viêm phổi 238 Phụ lục Các trình tự mồi sử dụng nghiên cứu khuếch đại in vitro gen in-silico hình 3.13 Gen dự đốn Lớp kháng sinh bị kháng Trình tự mồi blaOXA-64 blaADC-25 aadB blaVEB-7 aadA16 dfrA27 sul1 tet(39) mph(E) msr(E) ARR-3 floR rmtB cmlA1 blaOXA-10 aadA1 blaADC-25 blaOXA-68 mph(E) msr(E) blaCARB-2 F1: 5'-atgaacattaaagcactc-3' R1: 5'-ctataaaatacctaattgttc-3' F2: 5'-atgcgatttaaaaaaatttcttgtc-3' Beta-lactam R2: 5'-ttatttctttattgcattcagcac-3' F3: 5'-atggacacaacgcaggtc-3' Aminoglycoside R3: 5'-ttaggccgcatatcgcg-3' F4: 5'-atgaaaatcgtaaaaagg-3' Beta-lactam R4: 5'-ttatttattcaaatagtaattccacg-3' F5: 5'-atgagcaacgcagtgcccg-3' Aminoglycoside R5: 5'-ttaagctgcgccgcgaagc-3' F6: 5'-cgccattttatgcgc-3' Trimethoprim R6: 5'-ttaacccctttgccag-3' F7: 5'-atggtgacggtgttcgg-3' Sulphonamide R7: 5'-ctaggcatgatctaaccctc-3' F8: 5'-gtgaagaaatcattgagcgtg-3' Tetracycline R8: 5'-ttatggaactccagaatatttattcagg-3' F9: 5'-atgacaattcaagatattcaatcac-3' Macrolide R9: 5'-ttatataactcccaactgagc-3' Macrolide, Lincosamide F10: 5'-atgagtttaattattaaagcgag-3' R10: 5'-ttaacaatctctctcaaaagtc-3' Streptogramin B F11: 5'-atggtaaaagattggattccc-3' Rifampicin R11: 5'-ctagtcttcaatgacgtg-3' F12: 5'-atgaccaccacacgc-3' Phenicol R12: 5'-ttagacgactggcgac-3' F13: 5'-atgaacatcaacgatgc-3' Aminoglycoside R13: 5'-ttatccattcttttttatcaag-3' F14: 5'-gtgcgctcaaaaaactttagttgg-3' Phenicol R14: 5'-tcaacgattgggatttgatgtactttcc-3' F15: 5'-atgaaaacatttgccgc-3' Beta-lactam R15: 5'-ttagccaccaatgatgcc-3' F16: 5'-gtggctaaaacaaagttaaacatcatg-3' Aminoglycoside R16: 5'-ttatttgccgactaccttggtg-3' F2: 5'-atgcgatttaaaaaaatttcttgtc-3' Beta-lactam R17: 5'-ttatttttttattgcatttaaaactgc-3' F1: 5'-atgaacattaaagcactc-3' Beta-lactam R18: 5'-ctataaaatacctaattgttctaagc-3' F9: 5'-atgacaattcaagatattcaatcac-3' Macrolide R9: 5'-ttatataactcccaactgagc-3' Macrolide, Lincosamide F10: 5'-atgagtttaattattaaagcgag-3' R10: 5'-ttaacaatctctctcaaaagtc-3' Streptogramin B F19: 5'-atgcttttatataaaatgtgtgac-3' Beta-lactam R19: 5'-tcagcgcgactgtgatg-3' Beta-lactam Alternate name; PSE-1, blaP1b 239 sul1 Sulphonamide sul1 Sulphonamide aac(3)-IId Aminoglycoside F20: 5'-atgaaaggctggctttttcttg-3' R20: 5'-tcaccatggcgtcgg-3' F7: 5'-atggtgacggtgttcgg-3' R21: 5'-ctaggcatgatctaaccctcg-3' F: 5'-ctaacctgaaggctcgca-3' R: 5'-atgcatacgcggaaggc-3' 240 Phụ lục Kết điện di mẫu nghiên cứu sau PCR đa mồi để phát gen blaOXA thường gặp A baumannii kháng carbapenem 241 242 243 244 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA NGUYỄN SĨ TUẤN NGHIÊN CỨU TÍNH KHÁNG CARBAPENEM Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ CỦA ACINETOBACTER BAUMANNII GÂY NHIỄM KHUẨN TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA THỐNG NHẤT ĐỒNG NAI Chuyên ngành: Công... sinh học phân tử Tóm lại, việc thực luận án: ? ?Nghiên cứu mức độ phân tử đặc điểm kháng thuốc Acinetobacter baumannii kháng carbapenem gây nhiễm khuẩn bệnh viện đa khoa Thống Nhất Đồng Nai? ?? nhằm... baumannii đa kháng thuốc gây nhiễm khuẩn bệnh viện Đa khoa Thống Nhất tỉnh Đồng Nai khơng cịn nhạy cảm (kháng 100%) với hầu hết kháng sinh chủ yếu để điều trị nhiễm khuẩn trực khuẩn Gram âm (các beta-lactam;