Nghiên cứu phương pháp vi ghép trong nhân giống cây có múi luận văn thạc sĩ nông nghiệp

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM DƢƠNG THỊ HẢI YẾN NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP VI GHÉP TRONG NHÂN GIỐNG CÂY CÓ MÚI Ngành: Khoa học trồng Mã số: 8620110 Người hướng dẫn khoa học: TS Đoàn Thu Thủy NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực, khách quan chƣa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án đƣợc cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận án đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hải Yến i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc học viện, Ban chủ nhiệm khoa Nông học, đặc biệt thầy, cô giáo truyền đạt cho kiến thức bổ ích q trình học tập rèn luyện Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc chân thành tới TS.Đồn Thu Thủy, Bộ mơn Di truyền & Chọn tạo Giống trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, ngƣời dành nhiều thời gian tâm huyết tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực luận văn tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Hà Viết Cƣờng- Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây, thầy cô môn Di truyền Chọn giống trồng giúp đỡ tơi q trình thực tập hồn thành luận văn tốt nghiệp Cuối xin bày tỏ biết ơn, tình cảm thân thƣơng gửi đến gia đình, ngƣời thân, bạn bè, ngƣời ln bên cạnh động viên, khích lệ tơi q trình học tập hoàn thành luận văn Một lần xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận văn Dƣơng Thị Hải Yến ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu 1.3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Cơ sở khoa học đề tài 2.2 Nguồn gốc, phân loại có múi 2.2.1 Nguồn gốc 2.2.2 Phân loại 2.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi nƣớc giới 2.3.1 Tình hình sản xuất, tiêu thụ có múi giới 2.3.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ có múi việt nam 2.4 Nghiên cứu phƣơng pháp nhân giống có múi 2.4.1 Kỹ thuật nhân giống cách nuôi cấy mô 2.4.2 Quy trình nhân giống in vitro iii 2.4.3 Ảnh hƣởng chất điều hịa sinh trƣởng ni cấy mơ tế bào thực vật 11 2.5 Khái niệm vi ghép 12 2.5.1 Quá trình hình thành vết ghép 12 2.5.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi ghép 14 2.6 Một số thành tựu nhân giống có múi 19 2.6.1 Nghiên cứu vi ghép thực vật giới 19 2.6.2 Nghiên cứu vi ghép thực vật nƣớc 24 Phần Vật liệu phƣơng pháp nghiên cứu 27 3.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 27 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 27 3.1.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 3.2 Nội dung nghiên cứu 27 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 Phần Kết nghiên cứu thảo luận 35 4.1 Nghiên cứu công thức khử trùng loại hạt bƣởi hạt quất dung dịch khử trùng 35 4.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng ga3 đến tỷ lệ hạt nảy mầm 38 4.3 Nghiên cứu phƣơng pháp khử trùng phù hợp đoạn cành giâm chuẩn bị chồi ghép 43 4.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng đến tỷ lệ bật mầm chồi ghép 45 4.5 Nghiên cứu ảnh hƣởng tuổi gốc ghép đến tỷ lệ sống vi ghép 49 4.6 Nghiên cứu ảnh hƣởng kích thƣớc đỉnh sinh trƣởng đến tỷ lệ sống vi ghép 51 4.7 Nghiên cứu ảnh hƣởng phƣơng pháp ghép đến tỷ lệ nảy mầm mắt ghép 53 4.8 Nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng đến tỷ lệ rễ vi ghép 57 4.9 Kết kiểm tra bệnh vi ghép 59 Phần Kết luận kiến nghị 61 5.1 Kết luận 61 5.2 Kiến nghị 62 Tài liệu tham khảo 63 Phụ lục 69 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt BAP Cs ĐC GA3 IAA MS NAA Nghĩa tiếng Việt 6-Benzyl Amino Purin Cộng Đối chứng Gibberellin Indoly Acetic Acid Murashige - Skoog (1962) α - Napthalen Acetic Acid v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các loài cam quýt thực có ý nghĩa thực tiễn sản xuất Bảng 2.2 Sản lƣợng số ăn có múi giới châu lục Bảng 2.3 Diện tích, suất, sản lƣợng có múi nƣớc ta năm 2005-2013 Bảng 4.1 Ảnh hƣởng công thức khử trùng đến tỉ lệ vô trùng hạt quất 35 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng công thức khử trùng đến tỷ lệ vô trùng hạt bƣởi 37 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng GA3 đến tỷ lệ nảy mầm hạt quất 39 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng GA3 đến tỉ lệ nảy mầm hạt bƣởi 41 Bảng 4.5 Ảnh hƣởng dung dịch khử trùng đến tỉ lệ vô trùng đoạn cành giâm giống cam Vân Du 43 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng dung dịch khử trùng đến tỷ lệ vô trùng đoạn cành giâm giống cam Sunkit 44 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng dung dịch khử trùng đến tỉ lệ vô trùng đoạn cành giâm giống cam V2 44 Bảng 4.8 Ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả chồi cành cam Vân Du (sau 50 ngày nuôi cấy) 46 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả chồi cành cam Sunkit (sau 50 ngày nuôi cấy) 47 Bảng 4.10 Ảnh hƣởng môi trƣờng đến khả chồi cành cam V2 (sau 50 ngày nuôi cấy) 48 Bảng 4.11 Ảnh hƣởng tuổi gốc ghép bƣởi đến tỷ lệ sống vi ghép 49 Bảng 4.12 Ảnh hƣởng tuổi gốc ghép quất đến tỷ lệ sống vi ghép 50 Bảng 4.13 Ảnh hƣởng kích thƣớc đỉnh sinh trƣởng cam đến tỷ lệ sống vi ghép 52 Bảng 4.14 Ảnh hƣởng phƣơng pháp ghép với phát triển gốc ghép bƣởi 53 Bảng 4.15 Ảnh hƣởng phƣơng pháp ghép với phát triển gốc ghép quất 54 Bảng 4.16 Ảnh hƣởng môi trƣờng đến tỷ lệ rễ vi ghép giống cam Vân Du 57 Bảng 4.17 Ảnh hƣởng môi trƣờng đến tỷ lệ rễ vi ghép giống cam Sunkit 58 Bảng 4.18 Ảnh hƣởng môi trƣờng đến tỷ lệ rễ vi ghép giống cam V2 58 Bảng 4.19 Kết kiểm tra phát vi khuẩn Ca Liberibacter asiaticus (bệnh Huanglongbing = Greening) cam vi ghép 60 vi DANH MỤC HÌNH Hình 4.1 Ảnh hƣởng cơng thức khử trùng đến nảy mầm hạt quất 36 Hình 4.2 Ảnh hƣởng cơng thức khử trùng đến nảy mầm hạt bƣởi 38 Hình 4.3 Ảnh hƣởng nông độ GA3 đến khả nẩy mầm hạt quất 39 Hình 4.4 Hạt quất nảy mầm sau tuần môi trƣờng có nồng độ GA3 khác 40 Hình 4.5 Ảnh hƣởng nồng độ GA3 đến khả nẩy mầm hạt bƣởi 41 Hình 4.6 Cành giâm sử dụng BAP nồng độ 1,5 mg/l (sau 50 ngày ni cấy) 42 Hình 4.7 Mẫu (bên trái) mẫu nhiễm bệnh (bên phải) sau khử trùng đoạn cành giâm 45 Hình 4.8 Cành giâm môi trƣờng MS bổ sung BAP nồng độ mg/ l cam V2 (trái) 1,5 mg/l cam Vân Du (sau 50 ngày nuôi cấy) 49 Hình 4.9 Vi ghép cam V2 gốc quất theo phƣơng pháp ghép hàm ếch sau 10 ngày (bên trái), sau nảy mầm đƣợc 20 ngày (phải) 55 Hình 4.10 Vi ghép cam Vân Du gốc quất theo phƣơng pháp ghép nêm sau 10 ngày (bên trái), sau nảy mầm đƣợc 20 ngày (phải) 55 Hình 4.11 Vi ghép cam Vân Du gốc bƣởi theo phƣơng pháp ghép nêm sau 10 ngày (bên trái), sau nảy mầm đƣợc 20 ngày (phải) 56 Hình 4.12 Vi ghép cam V2 gốc bƣởi theo phƣơng pháp ghép hàm ếch ghép sau 10 ngày ghép (trái), sau 20 ngày bật mầm (phải) 56 Hình 4.13 Ghép chữ chữ T ngƣợc (cam Sunkit) 56 Hình 4.14 Kết kiểm tra bệnh sau vi ghép 60 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Dƣơng Thị Hải Yến Tên luận án: Nghiên cứu phƣơng pháp vi ghép nhân giống có múi Chuyên ngành: Khoa học trồng Mã số: 8620110 Tên sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu - Xác định đƣợc quy trình kỹ thuật vi ghép nhằm tạo có múi in vitro bệnh Phƣơng pháp nghiên cứu  Nghiên cứu gốc ghép vi ghép - Tiến hành khử trùng hạt quất hạt bƣởi bốn loại hóa chất, gồm: Cồn, Javen, Presept HgCl2 Từ đánh giá tỷ lệ vô trùng vào mẫu nhƣ khả nảy mầm loại hạt sau khử trùng - Hạt quất hạt bƣởi đƣợc cấy môi trƣờng MS bổ sung nồng độ GA3 khác để từ xác định mức GA3 tốt cho nảy mầm hạt  Nghiên cứu chồi ghép vi ghép -Khử trùng loại cành giâm loại hóa chất khử trùng khác nhau, gồm Javen, Presept, HgCl2 từ xác định phƣơng pháp khử trùng tốt cho phát triển cành giâm - Cành giâm giống cam đƣợc cấy vào môi trƣờng chứa BAP với nồng độ khác nhau, nhằm xác định nồng độ BAP thích hợp cho bật chồi phát triển cành giâm  Nghiên cứu phƣơng pháp vi ghép - Gốc ghép bƣởi quất qua tuần tuổi từ 2-5 tuần đem ghép với loại cành cam nhằm tìm tuổi gốc ghép thích hợp với vi ghép - Cắt đỉnh sinh trƣởng giống cam với kích thƣớc khác đem ghép,từ xác định kích thƣớc đỉnh phù hợp vi ghép - Chồi ghép giống cam đem ghép lần lƣợt với gốc ghép bƣởi quất, theo phƣơng pháp: Nêm, Chữ T, hàm ếch Từ tìm phƣơng pháp có hiệu gốc ghép bƣởi quất - Cây sau vi ghép đƣợc chuyển sang môi trƣờng chứa nồng độ α-NAA khác để xác định nồng độ thích hợp cho rễ vi ghép sau 1-4 tuần viii Kết kết luận Khi tăng thời gian xử lí cồn 700 từ đến phút tỉ lệ mẫu nhiễm giảm xuống Tỷ lệ nảy mầm hạt bƣởi đạt cao khử trùng cồn 700 phút hạt quất đạt 36,8% Bên cạnh đó, tỷ lệ mẫu nhiễm hạt bƣởi nhỏ hạt quất hạt quất có lớp màng nhầy bên ngồi khó bóc tách Với ba dung dịch khử trùng lại chƣa đạt đƣợc hiệu cao sử dụng Để phá ngủ rút ngắn thời gian nảy mầm hạt gốc ghép cần bổ sung 80mg/l GA3 vào môi trƣờng MS, từ 35 ngày xuống 22 ngày hạt quất; từ 30 ngày xuống 22 ngày hạt bƣởi Đối với việc khử trùng đoạn cành giâm cho thấy Presept cho thấy hiệu việc khử trùng ba đối tƣợng cành giâm Xử lý HgCl2 0,1% 15 phút cho hiệu khử trùng tốt việc khử trùng giống cam Vân Du Sunkit, Javen 5% 15 phút lại tỏ hiệu với giống cam V2 Khi bổ sung vào môi trƣờng MS 1mg/l BAP cam Sunkit cam V2; bổ sung 1,5 mg/l BAP cam Vân Du, cho thấy tác dụng tích cực bật mầm chất lƣợng chồi, giúp phát triển to, khỏe, xanh đậm Nếu sử dụng gốc ghép non (2 tuần tuổi) già (5 tuần tuổi) cho tỷ lệ vi ghép sống thấp so với gốc ghép từ 3-4 tuần tuổi Ngồi ra, kích thƣớc đỉnh sinh trƣởng có ảnh hƣởng đến hiệu trình vi ghép Vi ghép với đỉnh sinh trƣởng 1mm nhỏ, vi ghép tái sinh chồi bị chết Khi tiến hành vi ghép đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 3mm cho thấy hiệu tốt nhất, ba giống cam nghiên cứu Phƣơng pháp ghép hàm ếch cho hiệu ghép cao nhất, hai phƣơng pháp ghép nêm ghép chữ T cho hiệu Giữa giống cam giống V2 cho hiệu ghép tốt nhất, tiếp sau giống cam Sunkit giống cam Vân Du Môi trƣờng rễ cho kết tốt với giống cam thí nghiệm bổ sung 1ml α -NAA/l vào môi trƣờng nuôi vi ghép Kết cho thấy thành công vi ghép 100% mẫu vi ghép đem test cho kết âm tính với bệnh Greening, bệnh, sinh trƣởng tốt ix 4.8 NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG ĐẾN TỶ LỆ RA RỄ CỦA CÂY VI GHÉP Theo Farooq et al (2008), auxin có vai trị việc tạo rễ môi trƣờng tạo rễ in vitro, thơng qua ảnh hƣởng đến phân chia tế bào hình thành rễ NAA chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm auxin, đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sinh trƣởng dãn nở tế bào, tăng cƣờng trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ Dựa đặc tính NAA, tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng NAA đến phát sinh rễ vi ghép Thí nghiệm đƣợc tiến hành cơng thức có bổ sung α-NAA nồng độ khác Cây sau vi ghép, bật chồi đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MS chứa nồng độ NAA khác nhƣ công thức sau Theo dõi sau tuần cấy chuyển thu đƣợc kết nhƣ bảng dƣới đây: Bảng 4.16 Ảnh hƣởng môi trƣờng đến tỷ ệ rễ vi ghép giống ca Vân Du CT Hà ƣợng NAA (mg/l) Tỷ ệ ẫu rễ (%) Số rễ TB/chồi Chiều dài rễ Chất ƣợng rễ 0 0 0,5 11,3 0,5 0,4 + 16,7 0,9 0,9 ++ 1,5 14,5 0,5 0,5 + (+) Rễ ngắn, nhỏ, có phần bị hóa nâu / (++) Rễ dài, trắng, có lơng hút Kết cho thấy, α-NAA kích thích việc hình thành rễ cam nuôi cấy in vitro So với công thức đối chứng, ba cơng thức có bổ sung α-NAA cho số theo dõi cao hơn, cơng thức bổ sung mg/l NAA có tỷ lệ rễ thành công cao 16,7 %, số rễ trung bình/chồi đạt 0,91 chiều dài rễ đạt cao với 0,9 cm tuần thứ Cam Vân Du có tỷ lệ mẫu tạo rễ số rễ/mẫu tăng dần phạm vi từ 0,5 -1 mg/l NAA, tăng nồng độ lên 1,5 mg/l NAA tỷ lệ mẫu tạo rễ giảm xuống 14,5% số rễ trung bình cịn 0,5 cm Ngun nhân tăng nồng độ α-NAA vƣợt kích thích hình thành mơ sẹo, ức chế việc hình thành rễ Nhƣ bổ sung α-NAA nồng độ 1mg/l cho tỷ lệ mẫu cam Vân Du hình thành rễ cao nhất, số rễ trung bình/mẫu cao nhất, rễ dài, khỏe có lơng hút 57 Bảng 4.17 Ảnh hƣởng ôi trƣờng đến tỷ ệ rễ vi ghép giống ca Sunkit CT Hà ƣợng NAA (mg/l) Tỷ ệ ẫu rễ (%) Số rễ TB/chồi Chiều dài rễ Chất ƣợng rễ 0 0 0,5 8,3 0,6 0,6 + 17,7 1,1 0,8 ++ 1,5 13,4 0,9 0,9 + (+) Rễ ngắn, nhỏ, có phần bị hóa nâu / (++) Rễ dài, trắng, có lơng hút Tƣơng tự cam Vân Du, số mẫu hình thành rễ số rễ/mẫu tăng dần bổ sung NAA giống cam Sunkit khoảng từ 0,5-1 mg/l Tăng đến mức 1,5 mg/l tỷ lệ mẫu hình thành rễ giảm cịn 13,4%, số rễ TB/ mẫu giảm 0,88 chất lƣợng rễ khơng tốt, rễ ngắn, nhỏ, có phần bị hóa nâu Theo nhiều tác giả, nồng độ NAA cao, rễ có tƣợng sùi to mà khơng phát triển chiều dài, có nhiều chỗ bị hóa nâu, phần gốc chồi bị sùi tỏa làm ảnh hƣởng đến khả sống đƣa vƣờn ƣơm Nguyên nhân chất lƣợng rễ không tốt nên khả hút chất dinh dƣỡng giảm xuống làm chồi phát triển hơn, chiều cao chồi giảm Bảng 4.18 Ảnh hƣởng ôi trƣờng đến tỷ ệ rễ vi ghép giống cam V2 Hà ƣợng NAA Tỷ ệ ẫu Số rễ chiều dài Chất CT (mg/l) rễ (%) TB/chồi rễ ƣợng rễ 0 0 0,5 14,7 1,3 + 22,3 1,4 1,8 ++ 1,5 20,6 0,9 2,1 + (+) Rễ ngắn, nhỏ, có phần bị hóa nâu / (++) Rễ dài, trắng, có nhiều lơng hút 58 Tƣơng tự nhƣ cam Vân Du cam Sunkit, α-NAA đƣợc bổ sung nồng độ 0,5 ; 1,5 mg/l cam V2 cho thấy tiêu theo dõi rễ hiệu so với công thức đối chứng số rễ đạt tốt mức mg/l α-NAA sau tuần theo dõi Đối với tiêu chiều dài rễ, qua theo dõi cho thấy chiều dài rễ đạt cao với 2,1cm, nhiên rễ mảnh, nhỏ, ngắn, không dài có nhiều lơng hút nhƣ mức bổ sung 1mg/l α-NAA Số rễ TB/chồi mức 1,5mg/l đạt 0,9 thâp nhiều so với mức 1mg/l (đạt tới 1,4 rễ TB/chồi) Từ bảng số liệu cho thấy, Giống cam V2 cho thấy hiệu NAA trình rễ tốt nhất, với tỷ lệ mẫu rễ lên tới 22,3%, rễ dài có lơng hút, khỏe, số rễ trung bình/chồi lên tới 1,4 Trong giống cam Vân Du Sunkit cho hiệu rễ hơn, nhƣng không thấy khác biệt rõ rệt Nhƣ vậy, với giống cam Vân Du, Sunkit V2 làm thí nghiệm, nồng độ α-NAA tăng lên từ 1-1,5mg/l tỷ lệ rễ tăng lên, dao động từ 13,4%-22,3% Điều phù hợp với nghiên cứu trƣớc tác giả Nguyễn Thanh Nhàn (2004): Khi nồng độ α-NAA cao kích thích hình thành rễ Với nồng độ 1mg/l α-NAA bổ sung vào môi trƣờng MS nồng độ phù hợp cho hình thành, phát sinh phát triển rễ đồng thời chất lƣợng vi ghép đạt tốt So sánh với kết nghiên cứu tác giả Lã Thị Nguyệt (2008), nhận thấy có tƣơng tự : sau tuần nuôi cấy, bổ sung 1mg/l α-NAA nồng độ thích hợp cho phát triển, hình thành rễ in vitro chồi bƣởi Diền cam Xã Đoài, đồng thời chất lƣợng điều kiện đạt tốt 4.9 KẾT QUẢ KIỂM TRA BỆNH CỦA CÁC CÂY VI GHÉP Để đánh giá tính bệnh Greening cam vi ghép, tiến hành giám định qua phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi A2/J5 Mẫu đƣợc cắt từ cam vi ghép, bảo quản lạnh nghiền mẫu để tách chiết ADN sử dụng cho PCR Kết kiểm tra cho thấy tất mẫu cho kết âm tính, chứng tỏ bệnh Greening vi ghép 59 Bảng 4.19 Kết kiể tra phát vi khuẩn Ca Liberibacter asiaticus (bệnh Huang ongbing = Greening) ca vi ghép PCR STT Mẫu Cặp mồi A2 J5 Cam 1- Vân Du - Cam 2- Sunkit - Cam 3- V2 - Cam – V2 - Cam 5- V2 - Đ/c dƣơng + Hình 4.14 Kết kiể tra bệnh sau vi ghép Dựa vào thang chuẩn dung dịch marker mẫu đối chứng để kiểm tra kết cho thấy: M thang DNA kb (GenRuler kb, Thermo Scientific) với băng tham khảo 750 bp Các giếng mẫu từ đến 5, tất cho vạch màu tối, chứng tỏ âm tính với vi khuẩn Ca Liberibacter asiaticus, công thức đối chứng cho vạch màu sáng, dƣơng tính với tác nhân gây bệnh 60 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau trình tiến hành thí nghiệm chúng tơi rút đƣợc số kết luận nhƣ sau: Khi tăng thời gian xử lí cồn 700 từ đến phút tỉ lệ mẫu nhiễm giảm xuống Tỷ lệ nảy mầm hạt bƣởi đạt cao khỉ trùng cồn 700 phút hạt quất đạt 36,8% Bên cạnh đó, tỷ lệ mẫu nhiễm hạt bƣởi nhỏ hạt quất hạt quất có lớp màng nhầy bên ngồi khó bóc tách Với ba dung dịch khử trùng cịn lại chƣa đạt đƣợc hiệu cao sử dụng Để phá ngủ rút ngắn thời gian nảy mầm hạt gốc ghép cần bổ sung 80mg/l GA3 vào môi trƣờng MS, từ 35 ngày xuống 22 ngày hạt quất; từ 30 ngày xuống 22 ngày hạt bƣởi Đối với việc khử trùng đoạn cành giâm cho thấy Presept cho thấy hiệu việc khử trùng ba đối tƣợng cành giâm Xử lý HgCl2 0,1% 15 phút cho hiệu khử trùng tốt việc khử trùng giống cam Vân Du Sunkit, Javen 5% 15 phút lại tỏ hiệu với giống cam V2 Khi bổ sung vào môi trƣờng MS 1mg/l BAP cam Sunkit cam V2; bổ sung 1,5 mg/l BAP cam Vân Du, cho thấy tác dụng tích cực bật mầm chất lƣợng chồi, giúp phát triển to, khỏe, xanh đậm Nếu sử dụng gốc ghép non (2 tuần tuổi) già (5 tuần tuổi) cho tỷ lệ vi ghép sống thấp so với gốc ghép từ 3-4 tuần tuổi Ngoài ra, kích thƣớc đỉnh sinh trƣởng có ảnh hƣởng đến hiệu trình vi ghép Vi ghép với đỉnh sinh trƣởng 1mm nhỏ, vi ghép tái sinh chồi bị chết Khi tiến hành vi ghép đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 3mm cho thấy hiệu tốt nhất, ba giống cam nghiên cứu Phƣơng pháp ghép hàm ếch cho hiệu ghép cao nhất, hai phƣơng pháp ghép nêm ghép chữ T cho hiệu Giữa giống cam giống V2 cho hiệu ghép tốt nhất, tiếp sau giống cam Sunkit giống cam Vân Du Môi trƣờng rễ cho kết tốt với giống cam thí nghiệm bổ sung 1ml α -NAA/l vào mơi trƣờng nuôi vi ghép Kết cho thấy thành công vi ghép 100% mẫu vi ghép đem test cho kết âm tính với bệnh Greening, bệnh, sinh trƣởng tốt 61 5.2 KIẾN NGHỊ Ứng dụng kết nghiên cứu nhân nhanh invitro từ hạt bƣởi hạt quất nhằm tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác giống 2.Tiếp tục nghiên cứu tạo cụm chồi cho giống có múi khác để tìm quy trình nhân nhanh hồn chỉnh cho chi Citrus nói chung Tiếp tục nghiên cứu phƣơng pháp vi ghép nhân giống có múi nhằm mục tiêu tạo giống có múi bệnh, phục vụ sản xuất 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bùi Huy Đáp (1960) Cây ăn nhiệt đới tập I, cam quýt, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Đào Thanh Vân Ngơ Xn Bình (2003) Giáo trình ăn (dành cho cao học), Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Đình Ca Lê Cơng Thanh (2006) Ảnh hƣởng GA3 đến suất, phẩm chất cam Xã Đoài, Báo cáo kết thực đề tài, Viện Nghiên cứu Rau Đỗ Năng Vịnh (2008) Công nghệ sinh học chọn tạo giống ăn có múi Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Chi Mai, Đặng Hòa Hiếu, Lê Văn Sơn, Chu Hồng Hà Lê Trần Bình (2007) Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi trực tiếp từ thân mầm cam sành (Citrus nobilis loureiro) phục vụ chuyển gen Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, tr 363- 370 Đỗ Văn Nam, Nguyễn Thị Bích Hồng, Phạm Thị Ngọc, Nguyễn Văn Hoan Nguyễn Thị Phƣơng Thảo (2013) Nhân giống vơ tính invitro đu đủ Carica papapaya L Tạp chí Khoa học Phát triển 11 (6).Tr 833-839 Đƣờng Hồng Dật (2003) Cam, chanh, quýt, bƣởi kỹ thuật trồng, Nhà xuất Lao động xã hội, Hà Nội Dƣơng Tấn Nhựt (2011) Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu ứng dụng Tập Nhà xuất Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh Hà Minh Trung, Ngơ Vĩnh Viễn, Lê Mai Nhất, Mai Thị Liên Nguyễn Thị Bích Ngọc (2008) Hồn thiện ứng dụng cơng nghệ sản xuất có múi đ c sản (cam, quýt, bƣởi) bệnh greening bệnh virus khác tỉnh phía Bắc Tuyển tập cơng trình nghiên cứu chuyển giao khoa học công nghệ Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 10 Hà Thanh Võ (2005) Nghiên cứu kĩ thuật vi ghép Bƣởi Khóa luận tốt nghiệp Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 11 Hà Thị Thúy Đỗ Năng Vịnh (2004) Nghiên cứu tạo mơ sẹo phơi hóa phơi vơ tính từ ni cấy nỗn số giống ăn có múi, Tạp chí Di truyền Ứng dụng, tr.13-19 63 12 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch Vũ Quang Sáng (2008) Giáo trình Sinh lí thực vật Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà Nội 13 Hồng Ngọc Thuận (1994) Một số kết nghiên cứu gốc ghép nhân vơtính cho cam qt vung đồng Sơng Hồng, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nôi, tr 54 – 57 14 Hoàng Thị Thủy (2015) Nghiên cứu đặc điểm sinh học số biện pháp kỹ thuật nguồn thực liệu tạo không hạt có múi Luận án tiến sĩ nơng nghiệp Đại học Thái Nguyên 15 Hoàng Thị Xuân (2017) Nghiên cứu nhân giống bƣởi Diễn kĩ thuật nuôi cấy invitro Luận văn thạc sỹ sinh học, Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên 16 Hoàng Trung Kỳ (2011) Nghiên cứu biện pháp làm tăng tỷ lệ thành công vi ghép đỉnh sinh trƣởng mục đích làm bệnh vàng Greening Cam Canh Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội tr 46-60 17 Lã Thị Nguyệt (2008) Nghiên cứu tạo dịng bƣởi Diễn cam Xã Đồi đa bội xử lý colchicine điều kiện invitro Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tr 31-52 18 Lê Mai Nhất (2014) Nghiên cứu bệnh vàng greening hại ăn có múi số tỉnh phía Bắc Việt Nam đề xuất biện pháp phòng chống Luận án tiến sĩ, Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam 19 Lê Thị Thu Hồng (2000) Nghiên cứu số biện pháp Bảo vệ thực vật sản xuất giống có múi đồng song Cửu Long Luận án tiến sĩ, Viện Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam 20 Lê Thị Thu Hồng Hà Minh Trung (1996) Tổng kết nhận xét kỹ thuật 21 Lê Trần Bình (1993) Ứng dụng kỹ thuật vi ghép nhân giống cam chanh Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, (Nguyễn Văn Uyển) Nhà xuất Nông nghiệp Huế, tr 125 – 129 22 Mai Xn Lƣơng (2009) Giáo trình Cơng nghệ sinh học thực vật Đại học Đà Lạt 23 Ngũ Thị Yến (2016) Đánh giá phƣơng pháp ghép mắt nhỏ có gỗ phƣơng pháp vi ghép số giống cam quýt địa phƣơng Khóa luận tốt nghiệp Học viện Nơng nghiệp Việt Nam, Hà Nội 24 Nguyễn Đức Thành (2000) Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 64 25 Nguyễn Đức Thành, Đặng Thị Minh Lụa Quách Thị Liên (2014) Tạo thơng nƣớc hồn chỉnh từ chồi nhân invitro Tạp chí sinh học 2014 34 (2) tr.228-234 26 Nguyễn Quang Thạch Nguyễn Thị Lý Anh (2007) Công nghệ sinh học nông nghiệp Nhà xuất Đại học Sƣ phạm, Hà Nội 27 Nguyễn Thanh Nhàn (2004) Kêt nghiên cứu khoa học công nghệ ăn 2000- 2001, Vien nghiên cứu ăn miên Nam 28 Nguyễn Thị Thanh Thúy (2004) Nghiên cứu ảnh hƣởng gốc ghép bƣởi chua đến sinh trƣởng số giống bƣởi miền nam tuổi gốc ghép lên giống bƣởi đƣờng cam Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ nông học, Đại học Nông Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, tr 56-71 29 Nguyễn Văn Nhân (2004) Khảo sát yếu tố môi trƣờng nuôi cấy lên khả nhân giống bƣởi (citrus grandis), nha đam (Aleo vera), huyết dụ (Hippeastrumsp) Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ nông học, Đại học Nông Lâm, TP Hồ Chí Minh, tr 32-46 30 Nguyễn Văn Uyển Đồn Thị Ái Thuyền (1999) Những thành tựu cơng nghệ tế bào thực vật Việt Nam NXB Nông nghiệp Huế, Huế tr 625 - 629 31 Phạm Thị Thu Ly (2014) Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển giống lan Dendrobium mini lai điều kiện nuôi cấy in vitro.Luận văn thạc sĩ Đại học Sƣ phạm Thành phố Hồ Chí Minh 32 Phan Hữu Tơn, Tống Văn Hải, Đoàn Văn Lƣ, Phạm Thị Dung Nguyễn Xuân Viết (2014) Nuôi cấy in vitro trụ mầm giống cam (Citrus sinensis), quýt (Citrus reticulata) Tạp chí Khoa học Phát triển 12 (5) tr 641-649 33 Trần Thế Tục (1998) Giáo trình Cây ăn quả, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 34 Vũ Công Hậu (1999).Trồng ăn Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 35 Vũ Đình Phú, Ngơ Vĩnh Viễn, Mai Thị Liên Lê Mai Nhất (2008) Ứng dụng phát triển công nghệ vi ghép đỉnh sinh trƣởng giám định bệnh kĩ thuật PCR, ELISA để sản xuất giống có múi bệnh greening bệnh virus khác tỉnh phía Bắc Viện Bảo vệ thực vật 36 Vũ Quang Sáng, Phạm Văn Cƣờng, Nguyễn Văn Phú, Nguyễn Thị Nhẫn, Mai Thị Tân Nguyễn Thị Kim Thanh (2015) Giáo trình sinh lí thực vật ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội 65 37 Vũ Văn Hiếu (2016) Đánh giá trạng suy thoái cam sành trồng Bắc Quang, Hà Giang số giải pháp khắc phục Luận văn thạc sĩ Học viện nông nghiệp Việt Nam II Tài liệu tiếng Anh: 38 A Starrantino A Caruso (2003) The shoot – tip grafting technique applied in citriculture International Society Of Citriculture Proceedings 39 Ahmet ONAY, Vedat PIRINC, Filiz ADIYAMAN, Cigdem ISIKALAN, Engin TILKAT, and Davut BASARAN (2002) In Vivo and in Vitro Micrografting of Pistachio,Pistacia veraL cv “Siirt” Department of Biology, Faculty of Science and Literature, University Dicle, Diyarbakir – TURKEY Turl J Biol 27 (2003) pp 95- 100 40 Almeida Weliton, Filho Mourao and Mendes (2003) Agrobacterium-mediated transformation of Citrus sinensis and Citrus limonia epicotyl segments” Scientia Agricola pp 23-29 41 Anna K P., P Jacek, and S Ewa (2015) In vitro Regeneration induced in leaf explants of Citrus limon L Burm cv „Primofiore‟, Maria Curie-Skłodowska University in Lublin 42 Chen Q and C J Xu (2005) Effect of artificial pollination on fruit development and quality in storage of Yongjiazaoxiangyou pomelo, China Journal of Fruit Science 43 Ehsan E and D Ali (2015) In vitro plant regeneration from mature tissues of Thomson navel sweet orange (Citrus sinensis L Osbeck), Rumani 44 Emmarold, E Mneney, Sinclair and H Mantell (2001) In vitro micrografting of cashew Department of agriculture and Horticulture, Wye College, University of London, Wye, Ashfor, TN25 5AH, UK Plant cell tissure and culture 66 pp 49- 58 45 Evandro H S and A Fernando (2011) In vitro organogenesis in some citrus species 46 F Begum, M.N Amin, S Islam, M.A.K Azad and M.M Rehman(2003) In vitro Plant Regeneration from Cotyledon-derived Callus of Three Varieties 62 Pummelo (Citrus grandis Osb.) Department of Botany, University of Rajshahi, Rajshahi-6205, Bangladesh Online Journal of Biological Sciences (8).pp 751-759 47 Freeman T and P J Robbertse (2003) Internal quality of Valencia ‟orange fruit as influenced by tree fruit position and winter girdling 66 48 Ha Minh Trung, Ngo Vinh Vien and Ngo Dinh Phu (1998) Management of diseases-free citrus seedling in Northern Vietnam Managing banana and citrus diseases (A B Molina, V N Roa, J Bay-Petersen, A T Carpio, and J E.A.Joven).Da vao city, Philippines 49 Hocquellet, A., P Toorawa, J.M Bové and M Garniner (1999) Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the operon Molecular and Cellular Probes 13: 373-379 50 Hussain, G., M S Wani, M A Mir, Z A Rather and K M Bhat (2014) Micrografting for fruit crop improverment, academicjournal 51 J Dobránszki, K Magyar – Tábori, and J Lazányi (2000) Special micrografting method for apple Cost 843, Developmental biology of regeneration, 1st Meeting, Geisenheim, Germany 52 Jonard, R., J Hugard and J–J (1983) In vtro micrografting and its application to fruit scicence Scientia Horticulturae., 20: pp 147 – 159 53 Komal G., R Shanma, P K singh and Govind singh (2013) In vitro propagation produces seedless lime (Citrus limon L cv Kaghzi Kalan) and genetic evaluation of the plant, Plant physiology pp 131-145 54 Kumar Raj, M.K Kaul, S.N Saxena, S Bhargava and S Singh (2012) Protocol standardization for micropropagation of Citrus jambhiri Lush Using nodal segments of nucellar seedlings Progressive Horticulture, 44(1): 101- 109 55 Krueger, Rober, Balance and Polly (2003) Shoot – tip micrografting for rescue or therapy of field – grown citrus germplasm accessions International Society Of Citriculture Proceedings 56 Le Thi Thu Hong (1998) Management of diseases-free citrus seedling in Southern Vietnam Managing banana and citrus diseases (A B Molina, V N Roa, J Bay- Petersen, A T Carpio, and J E A Joven) Davao city, Philippines 57 Laskar M A., M Hynniewta and C S Rao (2008) “In vitro propagation of citrus indica Tanaka - An endangered progenitor species”, Indian Journal Biotechchnology 58 Micropropagation for production of quality banana planting material in asiapacific Asia-Pacific Association of Agricultural Research Institutions (APAARI) 67 59 Mourão Filho, Mendes Beatriz and Almeida Weliton (2002) In vitro organogenesis optimization and plantlet regeneration in Citrus sinensis and C.limonia Scientia Agricola, Print version ISSN 0103-9016 60 Mukhtar r, Mumtaz khan, Ramzan rafiq, Adnan shahid and Farooq ahmad khan (2005) In vitro Regeneration and Somatic Embryogenesis in (Citrus aurantifolia and Citrus sinensis), International journal of agriculture & biology, pp 518-520 61 Murashige T., W.P Bitters, T.S Rangan, E.M Nauer, C.N.Roistacher, and P.B Holliday (1972) A technique of shoot apex grafting and its utilization towards recovering virus-free Citrus clones Scientia Horticulturae 7: pp.118-119 62 Rakesh Sanabam, Pratap J Handique and Sunitibala Huidrom (2015) Microshoot tip grafting as tool for production of disease free foundation block of citrus reticulate blanco 'khasi' mandarin.ISHS Acta Horticulturae 1065: XII International Citrus Congress - International Society of Citriculture 63 Rezadost M and S Hosein (2013) In vitro regeneration of sour orange (Citrus aurantium L.) via direct organogenesis, 55 (3) pp.137-164 64 Rosely P., A B Weliton and d S Elma (2008) In vitro organogenesis from adult tissue of „Bahia‟ sweet orange (Citrus sinensis L Osbeck), Brasil, pp 367-371 65 Saini HK., MS Gil and M I S Gill (2010) Direct shoot oganogenenis and plant regeneration in rough lemon (Citrus Jambhiri Lush) Indian journal Biotechnology, 9: 419-423 66 Shahid A K (2011) Regeneration in vitro from non-pollinated flowers of sweet citrus (Citrus sinensis L Osbeck), African Journal of Biotechnologyp 15.130-15.134 67 Starrantino, A and A Caruso (1998) The shoot - tip grafting technique applied in citriculture International Society Of Citriculture Proceedings 68 Turnbull CG., JP Booker and HM Leyser (2002) Micrografting techniques for testing long – distance signalling in Arabidopsis Plant J., 32 (2): 255 – 262 69 Volk GM1., R Bonnart, R Krueger and R Lee (2012) Cryopreservation of citrus shoot tips using micro grafting for recovery 70 Wang, H., M Qi and A J Cutler (1993) A simple method of preparing plant samples for PCR Nucleic acids research, 21(17), 4153 68 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình Khử trùng hạt bƣởi cồn (bên trái) Javen (bên phải) Hình Cấy mẫu hạt quất (bên trái) mẫu hạt bƣởi (bên phải) 69 Hình Cấy mẫu cành giâm từ giống cam Hình Chồi cam mọc từ cành giâm sau cấy 70 Hình Gốc ghép bƣởi sau 1,5 tháng Hình Chồi ghép phát triển sau vi ghép 71 ... ngƣời nông dân sử dụng phƣơng pháp chiết cành ghép cành để nhân giống có múi Ngày nay, với phát triển khoa học công nghệ, vi? ??c nhân giống có múi phƣơng pháp vi ghép ngày trở nên phổ biến, ghép. .. Thị Hải Yến Tên luận án: Nghiên cứu phƣơng pháp vi ghép nhân giống có múi Chuyên ngành: Khoa học trồng Mã số: 8620110 Tên sở đào tạo: Học Vi? ??n Nơng Nghiệp Vi? ??t Nam Mục đích nghiên cứu - Xác định... hình sản xuất tiêu thụ có múi vi? ??t nam 2.4 Nghiên cứu phƣơng pháp nhân giống có múi 2.4.1 Kỹ thuật nhân giống cách nuôi cấy mô 2.4.2 Quy trình nhân giống in vitro iii