Nghiên cứu được tiến hành để đánh giá khả năng phát hiện của que thử VNUA-BQT trong chẩn đoán có thai sớm ở bò sữa. Giải nồng độ progesteron 2,0 ng/ml, 2,5 ng/ml, 3 ng/ml củng cố trong mẫu trắng được chuẩn bị để đánh giá ngưỡng phát hiện, độ đặc hiệu, độ chọn lọc và độ xác thực của kít.
CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC Nguyễn Ngọc Hải, Chế Minh Tùng, Nguyễn Kiên Cường Phí Như Liễu (2017) Khả sinh sản nghiên cứu ứng dụng giải pháp hormone để khắc phục bệnh chậm sinh bị Brahman nhập nội, Tạp chí KHCN Chăn ni, 76: 84-90 Nguyễn Văn Hớn Nguyễn Thị Hồng Nhân (2017) Tình hình chăn ni bị huyện Tân Hồng, tỉnh Đồng Tháp Tạp chí KHKT Chăn ni, 216: 73-77 Nguyễn Ni Lê, Đinh Văn Dũng, Đỗ Võ Anh Khoa, Lâm Phước Thành Nguyễn Thị Hồng Nhân (2017) Đánh giá kỹ thuật chăn ni suất đàn bị thịt tỉnh An Giang Tạp chí KHKT Chăn ni, 216: 33-38 Phạm Văn Quyến (2018) Nghiên cứu xây dựng mơ hình lai tạo ni dưỡng bị lai hướng thịt huyện Trà Cú, tỉnh Trà Vinh Báo cáo tổng kết đề tài, Sở Khoa học & Công nghệ Trà Vinh Sở Nông nghiệp & PTNT Trà Vinh (2019) Báo cáo tổng kết thực kế hoạch phát triển nông nghiệp nông thôn năm 2019 triển khai kế hoạch năm 2020 Số 52/BC-SNN, ngày 31/01/2020: 10 Nguyễn Bình Trường Nguyễn Văn Thu (2018) Hiện trạng chăn ni bị thịt An Giang: Sinh sản sinh trưởng Tạp chí KHKT Chăn ni, 229: 74-79 11 Hồng Văn Trường Nguyễn Tiến Vởn (2008) Kết nghiên cứu khả thích nghi với điều kiện chăn ni nơng hộ Bình Định bị thịt Brahman (nhập từ Cu Ba), Tạp chí Nơng nghiệp PTNT, 2: 33-37 12 Đinh Văn Tuyền, Nguyễn Quốc Đạt, Nguyễn Văn Hùng Nguyễn Thanh Bình (2008) Một số tiêu sinh sản bò Brahman Droughtmaster ngoại nhập lứa đầu ni TP Hồ Chí Minh khả sinh trưởng bê sinh từ chúng, Tạp chí KHCN Chăn ni, 5: 16-23 KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA QUE THỬ NHANH VNUA-BQT ĐỂ CHẨN ĐỐN CĨ THAI SỚM Ở BỊ SỮA Nguyễn Thị Hải1, Nguyễn Hồng Thịnh2, Bùi Huy Doanh2, Phạm Thị Kim Anh3 Phạm Kim Đăng2* Ngày nhận báo: 30/03/2021 - Ngày nhận phản biện: 12/04/2021 Ngày báo chấp nhận đăng: 24/04/2021 TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành để đánh giá khả phát que thử VNUA-BQT chẩn đoán có thai sớm bị sữa Giải nồng độ progesteron 2,0 ng/ml, 2,5 ng/ml, ng/ml củng cố mẫu trắng chuẩn bị để đánh giá ngưỡng phát hiện, độ đặc hiệu, độ chọn lọc độ xác thực kít Tổng số 60 bị sữa lấy mẫu thời điểm 22, 24, 26 ngày sau phối giống để đánh giá tiêu thực địa Kết nghiên cứu cho thấy que thử VNUA-BQT có khả phát tối thiểu nồng độ 2,5 ng/ml Kết nghiên cứu phịng thí nghiệm thử nghiệm mẫu thực cho thấy que thử VNUA-BQT đạt yêu cầu test nhanh định tính với độ xác thực 97,5%, độ đặc hiệu 100%, độ nhạy 95%, khơng có độ lệch dương độ lệch âm cao 4,8% Nếu sử dụng mẫu máu thời điểm phát xác từ ngày thứ 26 tính từ ngày phối giống Từ khóa: Que thử thai nhanh, VNUA-BQT, máu, sữa, bò ABSTRACT Preliminary evaluation the detectability of the VNUA-BQT test for early of pregnancy diagnosis in dairy cattle The study was conducted to evaluate the detection ability of the VNUA-BQT test in early pregnancy diagnosis in dairy cattle A standard solution of 2.0 ng/ml; 2.5 ng/ml; 3.0 ng/ml progesterone spiked in blank samples was prepared to assess the detection threshold, specificity, selectivity and authenticity of the kit A total of 60 cows were sampled at 22, 24 and 26 days after insemination to assess the field indicators Research results show that the VNUA-BQT test strip has the Limit of detection (LOD) at a concentration of 2.5 ng/ml Research results in the laboratory and NCS, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam Trung tâm dịch vụ nông nghiệp Thuận Thành, Bắc Ninh * Tác giả liên hệ: PGS.TS Phạm Kim Đăng, Trưởng Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Điện thoại: 0987432772; Email: pkdang@vnua.edu.vn 58 KHKT Chăn nuôi số 265 - tháng năm 2021 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC real samples showed that the VNUA-BQT test strip passed a qualitative fast test with an accuracy of 97.5%, a specificity of 100%, a sensitivity of 95 %, there is no positive deviation and the highest negative deviation is 4.8% The most accurate time of detection is from the 26th day from the date of insemination for the blood sample Keywords: Pregnancy Rapid Test Cassette, VNUA-BQT, blood, milk, cow ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành chăn nuôi phát triển qui mơ tính chun hóa đáp ứng nhu cầu thực phẩm cho tiêu dùng nội địa lại xuất cân đối bất hợp lý cấu sản xuất tiêu thụ thịt Việt Nam (thịt lợn chiếm tới 77,5% lượng thịt tiêu thụ, thịt gia cầm chiếm 15,7% thịt gia súc ăn cỏ (trâu, bò) chiếm 6,6%) Trong đó, sữa sản xuất nước đáp ứng gần 30% nhu cầu thịt bò phải nhập tiêu tốn khơng ngoại tệ đất nước Trước sức ép nhu cầu thịt bò, với nhu cầu sữa ngày cao, đặc biệt bối cảnh dịch tả lợn Châu Phi, Bộ Nông nghiệp PTNT có chiến lược định hướng phát triển đàn bị (Cục Chăn ni, 2020) Một giải pháp tăng đàn nhanh thông qua đường nhân giống sinh sản Tuy nhiên, điều kiện khí hậu Việt Nam, với trình độ chăn ni cịn hạn chế, chế độ chăm sóc, ni dưỡng, quản lý, thú y… chưa tốt nên sức sản xuất nói chung khả sinh sản bị thấp Hiện tượng bất thường, rối loạn sinh sản xảy phổ biến, đặc biệt đàn bị sữa Đặc biệt, mang thai khơng phát kịp thời sau phối giống, kéo dài khoảng cách lứa đẻ, giảm tỷ lệ nhân giống, ảnh hưởng đến suất hiệu chăn nuôi Nếu bò mang thai phát giai đoạn sớm, khơng những chăm sóc ni dưỡng cẩn thận quản lý theo chế độ mang thai, mà còn làm tăng tỷ lệ thành cơng mang thai Bị khơng mang thai kịp thời phới giớng, rút ngắn khoảng cách lứa đẻ giảm chi phí thức ăn từ cải thiện tỷ lệ truyền giớng lợi ích kinh tế tăng lên Vì vậy, chẩn đoán thai sớm quan trọng phát triển ngành chăn ni bị KHKT Chăn nuôi số 265 - tháng năm 2021 Trong chăn ni nói chung chăn ni bị nói riêng, nhiều nghiên cứu chứng minh hàm lượng progesterone sữa huyết tương có mối liên hệ biến động theo giai đoạn sinh lý sinh dục (động dục, rụng trứng, có thai) với bị chậm sinh sản vô sinh u nang buồng trứng, u thể vàng tồn lưu thể vàng (Nguyễn Thị Hải ctv, 2020) Chính vậy, phương pháp đo phóng xạ miễn dịch (RIA), ELISA, sắc ký lỏng nghiên cứu định lượng, bán định lượng progesteron để chẩn đốn có thai chẩn đốn trường hợp bất thường sinh sản bò (Heap ctv, 1973; Shemesh ctv, 1978; Holdsworth ctv, 1979; Nakao ctv, 1983; Pennington ctv, 1985; Roelofs ctv, 2006) Tuy nhiên, triển khai thực tế gặp nhiều khó khăn nên que thử nhanh (quick-stick) chế tạo từ kháng thể đơn dòng nhằm phân tích định lượng định tính hormone sinh sản phương pháp dễ thực điều kiện sản xuất thực tế Mặc dù giới, phát triển kit-ELISA, que thử nhanh để định lượng phát hormone sinh sản sản xuất ứng dụng rộng rãi nghiên cứu sản xuất Tuy nhiên, Việt Nam phải nhập nên giá cao Đặc biệt, điều kiện thực tế việc vận chuyển, bảo quản ảnh hưởng lớn đến chất lượng phân tích nên việc sử dụng hạn chế, đa số dùng nghiên cứu Để chủ động nghiên cứu sản xuất, làm chủ công nghệ sản xuất sản phẩm ứng dụng với giá thành hợp lý nhằm mục đích nâng cao khả sản xuất vật ni nói chung bị nói riêng có ý nghĩa khoa học, thực tiễn lớn Trong khuôn khổ đề tài Bộ Nông nghiệp&PTNT Khoa Chăn nuôi – Học viện Nơng nghiệp Việt Nam chủ trì nghiên cứu chế tạo que thử nhanh VNUA-BQT để phát sớm có thai bị 59 CHĂN NI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC lần thực Việt Nam Để có sở cho việc triển khai ứng dụng que thử sản xuất, cần tiếp tục đánh giá tiêu kỹ thuật que thử sở phân tích thăm dị mẫu trắng củng cố nồng độ lớn nồng độ giới hạn phát (LOD) theo thiết kế que thử 2,5 ng/ml Giải nồng độ thăm dò nghiên cứu 2,0; 2,5 3,5 ng/ml VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đánh giá tham số kỹ thuật khả Nghiên cứu tiến hành mẫu máu phát que thử mẫu thí nghiệm mẫu sữa bị sữa ni trang trại chuẩn bị sau: mẫu máu mẫu sữa nông hộ Hà Nội Mộc Châu, từ tháng đối chứng âm (không chứa progestron), mẫu 9/2019 đến tháng 5/2020 đối chứng dương (mẫu trắng củng cố 2.1 Xác định ngưỡng phát hiện, độ đặc hiệu, chất chuẩn nồng độ ≥ ngưỡng phát hiện), nồng độ progesteron chuẩn pha độ chọn lọc độ xác thực que thử mẫu máu mẫu sữa Mẫu Tiêu chí kỹ thuật đánh giá thơng dương tính thật mẫu trắng củng cố qua tiêu chí qui định Quyết định chất chuẩn nồng độ ≥ ngưỡng phát 657/2002/EC (EC, 2002) quy định phép phương pháp Phân tích lặp lại tối thiểu 20 thử sàng lọc mẫu trắng 20 mẫu củng cố chất chuẩn Ngưỡng phát que xác định thể bảng Bảng Thông tin công thức xác định tham số phương pháp Kết test Dương tính Âm tính Mẫu thực dương tính (N+) (mẫu củng cố) PA (Dương tính theo qui định) FN (Âm tính giả) Độ xác thực (%) = với N = N+ + NĐộ nhạy (%) = Độ đặc hiệu (%) = N tổng số mẫu phân tích = N+ + NN+ số mẫu thực dương tính (mẫu củng cố) N- số mẫu thực âm tính (mẫu trắng) PA số mẫu dương tính theo kết phân tích số N+ mẫu FN là số mẫu âm tính theo kết phân tích số N+ mẫu FP số mẫu dương tính theo kết phân tích số N- mẫu NA số mẫu âm tính theo kết phân tích số N- mẫu 2.2 So sánh tiêu chí kỹ thuật với que thử thương mại phịng thí nghiệm Để khẳng định chất lượng khả ứng dụng thực tiễn, nghiên cứu 60 Mẫu thực âm tính (N-) (mẫu trắng) FP (Dương tính giả) NA (Âm tính theo qui định) so sánh với que thử thương mại thị trường Nghiên cứu sử dụng mẫu sữa mẫu máu âm tính (mẫu lấy từ bị chưa phối giống) để củng cố nồng độ xác định để so sánh khả phát que thử đề tài với que thử có thị trường (Que thử Catte Pregnancy Rapid Test Cassette, Lot:20190422) (que thương mại) Mỗi loại que thử phân tích loại mẫu 20 mẫu âm tính thật 20 mẫu dương tính thật (củng cố progesteron nồng độ 3,5 ng/ml) 2.3 Đánh giá que thử thông qua thử nghiệm mẫu thực Từ kết theo dõi, chu kỳ tính bị có biến động giao động 17-25 ngày, để đảm bảo phát có thai cần phải khả sát thời điểm tối ưu cho kết chắn Nghiên cứu tiến hành khảo sát ngẫu nhiên 60 bò phối giống (khu vực Hà Nội 30 con, Mộc Châu 30 con) Tất bò sau phối kiểm tra mẫu máu thời điểm 22, 24 26 ngày tính từ thời điểm phối giống Sau theo dõi mang thai KHKT Chăn ni số 265 - tháng năm 2021 CHĂN NI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC phương pháp thông thường áp dụng sở thời điểm 3,5 đến tháng tính từ thời điểm thụ tinh KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết xác định ngưỡng phát hiện, độ đặc hiệu, độ chọn lọc độ xác thực que thử Ngưỡng phát que thử xác định sở phân tích thăm dị mẫu trắng củng cố nồng độ lớn nồng độ giới hạn phát (LOD) theo thiết kế que thử 2,5 ng/ml Dải nồng độ thăm dò nghiên cứu 2,0; 2,5 3,5 ng/ml Kết phân tích cho thấy que thử VNUABQT có khả phát ổn định mức 2,5 3,5 ng/ml Nghiên cứu tiến hành phân tích 20 mẫu trắng củng cố progesteron ba mức nồng độ 2,0; 2,5 3,5 ng/ml hai loại mẫu (mẫu máu mẫu sữa) Kết cho thấy que thử VNUA-BQT có khả phát 100% (20/20 mẫu) số mẫu củng cố nồng độ 3,5 ng/ml 95% (19/20 mẫu) mẫu củng cố nồng độ 2,5 ng/ml Trong đó, mẫu củng cố 2,0 ng/ml mẫu phát 12/20 mẫu (đối với mẫu máu) 8/20 mẫu (đối với mẫu sữa) Theo nghiên cứu Rajamahendran ctv (1990) tiến hành phân tích nồng độ progesteron phương pháp ELISA cho thấy với nồng độ >2 ng/ ml khả phát đạt 94% Kết nghiên cứu cho thấy giới hạn phát mẫu que thử VNUA-BQT bé 2,5 ng/ml đáp ứng mong đợi nghiên cứu tương đương với nghiên cứu Rajamahendran ctv (1990) Theo thiết kế thí nghiệm, để đánh giá độ tin cậy que thử, mẫu (máu, sữa) tiến hành phân tích 20 mẫu trắng (được xem mẫu âm tính thật) 20 mẫu trắng củng cố nồng độ 3,5 ng/ml (được xem dương tính thật) Kết phân tích cho thấy 1/20 mẫu âm tính giả khơng có mẫu dương tính giả (Bảng 2) Kết phân tích cho thấy mẫu sữa, que thử VNUA-BQT có khả phát với độ xác thực 97,5%, độ đặc hiệu KHKT Chăn nuôi số 265 - tháng năm 2021 100%, độ nhạy 95%, khơng có độ lệch dương độ lệch âm 4,8% (Bảng 3) Bảng Kết phân tích mẫu trắng mẫu củng cố nồng độ 3,5 ng/ml Nền mẫu Sữa Máu Kết test Mẫu thực dương tính (N+) Mẫu thực âm tính (N-) (mẫu củng cố, n=20) (mẫu trắng, n=20) Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính 19 20 20 0 20 Đối với mẫu máu, que thử VNUA-BQT có khả phát với độ xác thực 100%, độ đặc hiệu 100%, độ nhạy 100%, khơng có độ lệch dương độ lệch âm (Bảng 3) Bảng Kết đánh giá tham số phương pháp mẫu khác (%) Tham số Độ xác thực Độ đặc hiệu Độ nhạy Độ lệch dương Độ lệch âm Mẫu sữa Mẫu máu Qui định 657/2002/EC 97,5 100,0 95,0 100 100 100 ≥90 ≥90 ≥90 ≤10 4,8 ≤10 Đối chiếu qui định Ủy ban Châu Âu, tham số que thử VNUA-BQT đạt yêu cầu phân tích sàng lọc chất hóa học mẫu sản phẩm, chế phẩm sinh học động vật 3.2 Kết so sánh tiêu chí kỹ thuật với que thử thương mại phịng thí nghiệm Để khẳng định chất lượng khả ứng dụng thực tiễn, nghiên cứu so sánh với que thử thương mại thị trường thực Nghiên cứu sử dụng mẫu trắng (không chứa progesterone) mẫu củng cố nồng độ 3,5 ng/ml để so sánh khả phát que thử VNUA-BQT với que thử thương mại Kết cho thấy, khả phát que thử VNUA BQT có ưu điểm so với quen thương mại Que thương mại có tỷ lệ dương tính giả cao so với VNUA BQT đặc biệt vượt q 5% âm tính giả hay nói cách khác độ xác thực độ nhạy 95% 61 CHĂN NUÔI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC Bảng So sánh khả phát que thử phân tích mẫu trắng mẫu củng cố nồng độ 3,5 ng/ml Nền mẫu Sữa Máu Kết test Mẫu thực dương tính (N+) Mẫu thực âm tính (N-) (mẫu củng cố, n=20) VNUA-BQT Que thương mại (mẫu trắng, n=20) VNUA-BQT Que thương mại Dương tính Âm tính Dương tính Âm tính 19 17 0 20 19 20 20 20 3.3 Kết thử nghiệm mẫu thực Qua khảo sát thấy chu kỳ tính bị có biến động dao động 17-25 ngày, vậy, để đảm bảo phát có thai cần phải khảo sát thời điểm tối ưu cho kết chắn Nghiên cứu tiến hành khảo sát ngẫu nhiên mẫu máu 60 bò phối giống Tất bò sau phối kiểm tra thời điểm 22, 24 26 ngày tính từ thời điểm phối giống Sau đó, theo dõi mang thai phương pháp thơng thường áp dụng sở thời điểm 3,5-4 tháng tính từ thời điểm thụ tinh phân tích kết xét nghiệm Bảng Kết kiểm tra theo thời gian sau phối Ngày sau phối 22 24 26 Chỉ tiêu Kết que thử thời điểm thử Kết sau tháng Dương tính 46 48 55 Âm tính 14 12 Có chửa Khơng chửa Que thử phát bị khơng chửa 52 Kết cho thấy bị khơng có chửa, thể vàng tồn lưu, cho kết âm tính kể trường hợp rối loạn khác Đối với bị khơng có chửa thể vàng tồn lưu cho kết dương tính Trong số 52 bị có chửa khẳng định sau tháng theo dõi có tới 12 bị khơng phát 22 ngày 10 bò 24 ngày tính từ ngày phối giống Đến ngày thứ 26 100% bị có chửa cho kết dương tính Đối với trường hợp thử cho kết dương tính lần thứ khơng có chửa sau kiểm tra tồn lưu thể vàng (3 bò) Theo nghiên cứu Shemesh ctv (1978) sử dụng phương 62 20 pháp miễn dịch phóng xạ để đánh giá nồng độ progesteron thời điểm sau phối giống cho thấy vào ngày 24 phát bị có chửa đạt 93%, khơng có chửa đạt 100% Như vậy, kết cho thấy ngày thứ 26 sau phối giống sử dụng kit VNUA BQT có độ tin cậy cao Từ kết khuyến cáo sử dụng que thử tốt vào ngày thứ 26 tính từ thời điểm thụ tinh Như vậy, kết âm tính khẳng định khơng có chửa (chính xác 100%), kết dương tính cần xem xét thêm trường hợp thể vàng tồn lưu KẾT LUẬN Que thử VNUA-BQT có khả phát tối thiểu nồng độ 2,5 ng/ml Kết nghiên cứu phịng thí nghiệm thử nghiệm mẫu thực cho thấy que thử VNUA-BQT đạt yêu cầu test nhanh định tính với độ xác thực 97,5%, độ đặc hiệu 100%, độ nhạy 95%, khơng có độ lệch dương độ lệch âm cao 4,8% Thời điểm phát xác từ ngày thứ 26 tính từ ngày phối giống LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu thực từ nguồn kinh phí đề tài “Nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone để chế tạo que thử nhanh (Quick Sticks) chẩn đốn có thai sớm bị” thuộc chương trình CNSH nơng nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Cục Chăn nuôi (2020) Báo cáo kết thực chiến lược phát triển chăn nuôi giai đoạn 2008-19 EC (2002) Quyết định Ủy ban Châu Âu số 657/2002/EC Nguyễn Thị Hải, Nguyễn Hoàng Thịnh, Phạm Kim Đăng Nguyễn Văn Tình (2020) Hàm lượng progesterone máu sữa bị sữa Holstein KHKT Chăn ni số 265 - tháng năm 2021 ... cố nồng độ 3,5 ng/ml để so sánh khả phát que thử VNUA-BQT với que thử thương mại Kết cho thấy, khả phát que thử VNUA BQT có ưu điểm so với quen thương mại Que thương mại có tỷ lệ dương tính giả... trì nghiên cứu chế tạo que thử nhanh VNUA-BQT để phát sớm có thai bị 59 CHĂN NI ĐỘNG VẬT VÀ CÁC VẤN ĐỀ KHÁC lần thực Việt Nam Để có sở cho việc triển khai ứng dụng que thử sản xuất, cần tiếp... sánh với que thử thương mại thị trường Nghiên cứu sử dụng mẫu sữa mẫu máu âm tính (mẫu lấy từ bị chưa phối giống) để củng cố nồng độ xác định để so sánh khả phát que thử đề tài với que thử có thị