Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu về đa hình của gene thụ thể khứu giác cOR52H9 và mối tương quan với khả năng phát hiện ngửi mùi của chó Berger (Canis lupus familiaris). Mẫu máu của 28 các thể chó nghiệp vụ của Cục quản lý, huấn luyện và sử dụng động vật nghiệp vụ, Bộ Công An đã được thu để phân lập gene và phân tích tương quan kiểu hìnhkiểu gene.
TAP HOC 2017, quan 39(1):di102-107 Phân tích đaCHI hình SINH đánh giá tương truyền DOI: 10.15625/0866-7160/v39n1.7130 PHÂN TÍCH ĐA HÌNH VÀ ĐÁNH GIÁ TƯƠNG QUAN DI TRUYỀN GENE THỤ THỂ KHỨU GIÁC cOR52H9 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN MÙI CỦA CHĨ NGHIỆP VỤ Đỗ Văn Thu1, Đồn Việt Bình1*, Nguyễn Trọng Chí2, Lê Xn Phong2, Nguyễn Ngọc Hưng2, Lê Thị Huệ1, Trần Xuân Khôi1, Võ Thị Ninh1 Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam Cục Cảnh sát Quản lý, Huấn luyện Sử dụng động vật nghiệp vụ, Bộ Công An TÓM TẮT: Cho đến nay, việc tuyển chọn huấn luyện chó nghiệp vụ thường dựa ngoại hình chó Trong số chó chọn để huấn luyện phát ma túy, thuốc nổ, có khoảng 30% đạt yêu cầu sau huấn luyện COR52H9 gene nằm nhiễm sắc thể 21 chó, mã hóa cho thụ thể khứu giác nằm bề mặt biểu mô thần kinh hốc mũi, có vai trò quan trọng việc nhận biết mùi Trong báo này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu đa hình gene thụ thể khứu giác cOR52H9 mối tương quan với khả phát ngửi mùi chó Berger (Canis lupus familiaris) Mẫu máu 28 thể chó nghiệp vụ Cục quản lý, huấn luyện sử dụng động vật nghiệp vụ, Bộ Công An thu để phân lập gene phân tích tương quan kiểu hìnhkiểu gene Gene phân lập có độ tương đồng 99% với trình tự gene cOR52H9 đăng ký ngân hàng gene Gene cOR52H9 có điểm có đa hình đơn nucleotid (SNP) vị trí: T87A, G370A, T414G, G450A G814T Đã xác định có mối tương quan mức độ vừa kiểu gene khả phát ma túy chó T414G G450A (p=0,002, r=0,554), G814T (p=0,007, r=0,498) Kết hợp sử dụng SNPs: T414G, G450A G814T tuyển chọn chó có khả phát mùi tốt cho lớp huấn luyện chó phát ma túy Từ khóa: Chó nghiệp vụ, cOR52H9, đa hình đơn nucleotit, gene thụ thể khứu giác, khả phát mùi, phát ma túy, tuyển chọn chó MỞ ĐẦU Việc tạo đàn chó có chất lượng cao nhiệm cần thiết nhằm phục vụ cho cơng tác đấu tranh phòng, chống tội phạm Việc huấn luyện chó nghiệp vụ đòi hỏi nhiều thời gian kinh phí Trong đó, việc tuyển chọn chó để đưa vào huấn luyện thường chủ yếu dựa đặc điểm ngoại hình chó, chưa chọn chó tốt cho mục đích định Trong số chó chọn để huấn luyện phát ma túy, thuốc nổ, có khoảng 30% đạt yêu cầu sau huấn luyện (Maejiima et al., 2007) Vì vậy, cần phải có phương pháp có hiệu tốt Gần đây, có số cơng trình nghiên cứu thị phân tử để chọn chó có khả phát mùi tốt cho khóa huấn luyện (Lesniak et al., 2008) Cơ quan khứu giác chó có khả phân biệt nhiều chất có mùi khác nhau, nồng độ khác nhau, có cấu trúc khác Các chất có mùi hoạt hóa thụ thể khứu giác (OR) bề mặt tế bào biểu mô thần kinh, 102 tạo thành tín hiệu thần kinh truyền lên não Có khoảng 1300 gene mã hóa cho OR lồi chó xác định (Olender et al., 2004) Mỗi gene OR có cấu tạo gồm exon mã hóa đơn lẻ khoảng 1kb (Quignon et al., 2003) Nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy nhiều gene OR chó có đa hình đơn nucleotide (SNPs) (Tacher et al., 2005) Trong số SNPs phát có đến 47% làm thay đổi axít amin OR, 25% tìm thấy giống chó (Robin et al., 2009) Sự thay đổi a xit amin làm thay đổi mức độ kết hợp với phân tử mùi, thay đổi khả nhận biết mùi tạo nên khác biệt khả khứu giác cá thể (Mainland et al., 2014) Vì vậy, có cơng trình nghiên cứu chứng minh dùng SNPs gene OR làm thị phân tử để tuyển chọn chó dùng phát mùi (Lesniak et al., 2008) Gene cOR52H9 gene có nhiều SNPs thuộc phân họ cOR52H COR52H9 nằm nhiễm sắc thể 21 chó, Do Van Thu et al cấu trúc bao gồm exon, có trình tự đăng ngân hàng gene XM_005633593.1 Gene cOR52H9 mã hóa cho thụ thể khứu giác cấu tạo 389 axit amin Trong báo này, trình bày kết nghiên cứu đa hình gene thụ thể khứu giác cOR52H9 mối tương quan với khả ngửi mùi chó Berger với mục đích sử dụng gene làm thị phân tử phục vụ cho cơng tác tuyển chọn chó để huấn luyện phát ma túy, thuốc nổ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu bao gồm mẫu máu 28 chó nghiệp vụ Berger (Canis lupus familiaris) Cục quản lý, huấn luyện sử dụng động vật nghiệp vụ, Bộ Cơng An Mỗi chó sau huấn luyện, chuyên gia đánh giá độc lập cho điểm khả phát ma túy theo thang điểm chuẩn quy trình huấn luyện Tách chiết DNA Tách chiết DNA hệ gene từ máu Kit PurelinkTM Genomic DNA minikit K182001(Invitrogen-USA) Đánh giá mẫu DNA tổng số tách chiết điện di gel agarose 1% đo quang phổ hấp thụ bước sóng 260/280nm máy NanoDrop lite (hãng Thermo scientific) Phản ứng PCR Phân lập gene cOR52H9 cặp mồi Fn (ATCGCTAATGTGTCCTCAGG) Rn (AACT TCTCCTTCAGTGACTCTCC) Ft (GATCC CAGACTGAGGAGACC) Rt (TCAGTGAC TCTCCCCCACTC) Phản ứng PCR thực máy chu trình nhiệt Veriti (hãng Applied Biosystems) tích 25µl chứa thành phần sau: Mastermix (hãng Thermo Fisher scientific) 12,5 µl, nước 8,5 µl, mồi xi F µl, mồi ngược R µl DNA µl Phản ứng PCR chạy làm hai vòng, vòng dùng cặp mồi Fn Rn, vòng Ft Rt Chu trình nhiệt phản ứng sau: Biến tính 95oC phút Tiếp theo 35 chu kỳ nối tiếp nhau: 95oC/30 giây, 58oC/30 giây, 72oC/1 phút 20 giây Kết thúc phản ứng 72oC phút Chu trình nhiệt cho vòng tương tự chu trình nhiệt vòng nhiệt độ bắt cặp giảm xuống 56oC Sản phẩm PCR kiểm tra gel garose 1%, đệm TAE 1X, DNA Maker 1kb (hãng Fermentas) Sau phân lập gene, gel sản phẩm PCR đọc trình tự máy 3730XL DNA Analyser (Macrogen, Hàn Quốc) Xác định cấu trúc liên kết (topology) thụ thể khứu giác theo phương pháp Krogh et al (2001) Phân tích số liệu So sánh trình tự gene cOR52H9 cá thể chó với trình tự đăng ký ngân hàng gene dịch từ trình tự nucleotide sang cấu tạo axit amin thụ thể khứu giác phần mềm BioEdit Điểm đánh giá khả phát ma túy chó kết nối với kết phân tích kiểu gene để phân tích mối tương quan di truyền kiểu hình- kiểu gene theo phương pháp ANOVA nhân tố xác định hệ số tương quan Pearson phần mềm Minitab 15.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN DNA mẫu máu sau tách chiết có tỷ số OD 260/280 nằm khoảng 1,72,0 đo máy quang phổ hấp thụ, đảm bảo độ tinh cho bước phân tích Sản phẩm PCR phân lập gene cOR52H9 từ DNA hệ gene có kích thước khoảng 1.000 bp, tương đương với lý thuyết (hình 1) Sau so sánh với trình tự gene cOR52H9 đăng ngân hàng gene XM_005633593.1, sản phẩm PCR đạt độ tương đồng 99% với vùng mã hóa gene Hình Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gene cOR52H9 M: Thang DNA chuẩn; số 1-9 thứ tự mẫu máu chó 103 Phân tích đa hình đánh giá tương quan di truyền Kết so sánh trình tự gene cOR52H9 28 cá thể chó Berger phát điểm SNPs bao gồm vị trí: T87A, G370A, T414G, G450A G814T (bảng 1) Trong đó, vị trí G370A dẫn đến thay đổi axit amin valine thành isoleucine thụ thể khứu giác chó, G814T làm thay đổi valine thành leucine Tại vị trí lại khơng có thay đổi axit amin OR hợp tử Tại vị trí G370A, có hai kiểu gene phát hiện, kiểu gene đồng hợp tử GG có tỷ lệ cao hẳn (71,43%) so với kiểu gene dị hợp tử GA (28,57%) Tại tất vị trí SNPs, tất kiểu gene đồng hợp tử khơng có nucleotide bị thay thế, tạm gọi kiểu gene gốc, có điểm phát ma túy cao Đó kiểu gene TT SNPs T87A T414G, hay kiểu gene GG G370A, G450A G814T Những kiểu gene lại kiểu gene dị hợp tử đồng hợp tử có nucleotide bị thay có điểm phát ma túy thấp (bảng 1) Tại vị trí T87A, T414G, G450A G814T, kiểu gene dị hợp tử có tỷ lệ phần trăm cao so với kiểu gene đồng Bảng 1: Các SNPs, kiểu gene mối tương quan kiểu gene với điểm phát ma túy chó nghiệp vụ SNP T87A G370A T414G G450A G814T Kiểu gene TT TA AA GG GA TT TG GG GG GA AA GG GT TT Số lượng N 13 20 8 11 11 16 % 32,14 46,43 21,43 71,43 28,57 28,57 39,29 32,14 28,57 39,29 32,14 17,86 57,14 25,00 Điểm phát ma túy Phân tích ANOVA Hệ số tương quan r p f p 2,27 0,124 2,03 0,166 5,75 0,09 0,554 0,002 5,75 0,09 0,554 0,002 4,13 0,028 0,498 0,007 a 67,22 ± 1,79 62,69 ± 2,33 60,00a ± 2,45 64,75±1,46 60,63±3,10 68,13b ± 1,90 64,54 ± 2,18 58,33b ± 1,98 68,13c ± 1,90 64,54 ± 2,18 58,33c ± 1,98 68,57d± 0,99 63,13± 2,05 58,00d± 1,37 Các trị số có chữ giống biểu khác biệt có ý nghĩa thống kê theo cặp, a (p