Đang tải... (xem toàn văn)
Với mục đích giúp cho công tác chọn lọc giống cá rô phi, góp phần cải tạo chất lượng giống; bài viết sử dụng chỉ thị phân tử mt-RFLP để nhận dạng các dòng các rô phi đang nuôi tại Việt Nam.
31(2): 73-78 Tạp chí Sinh học 6-2009 PhâN tích đa hình RFLP-mt DNA số DòNG Cá Rô PHI nuôi Việt Nam Nguyễn Thị Thanh Bình, Đinh Thị Ngọc Thúy, Quyền Đình Thi Viện Công nghệ sinh học Phạm Anh Tuấn Viện Nghiên cứu v Nuôi trồng Thủy sản I Rô phi l loi cá có giá trị kinh tế cao, đợc nuôi nhiều nớc giới, đặc biệt nớc thuộc vïng khÝ hËu nhiƯt ®íi cËn nhiƯt ®íi [1, 7] Việt Nam, dòng cá rô phi đợc nu«i làm gièng cã nguån gèc thêi gian nhËp nội khác Cho đến nay, việc đánh giá, nhận dạng dòng cá rô phi dựa vo đặc điểm hình thái nên nhiều hạn chế, để phân biệt dòng ngời ta phải gọi tên theo suất sứ nh vằn Đài Loan, vằn Trung Quốc, hay xanh Trung Quốc, xanh Irael theo ngoại hình chúng đợc phân thành loại vằn Oreochromis Niloticus loại xanh Oreochromis Areus Trong mét thêi gian dài, viƯc l−u gi÷ v phát triển dòng cá rô phi cha đợc ý nên nhiều dòng bị lẫn tạp giao hay lai cận huyết, chất lợng cá giống bị ảnh hởng Việc chọn lọc nhằm nâng cao chất lợng giống cá thực theo phơng pháp truyền thống nên hiệu đạt đợc cha cao Những năm gần đây, với thnh tựu bật công nghệ sinh học, nhiều hạn chế chọn lọc giống cá rô phi đ đợc khắc phục Ngời ta đ sử dụng thnh công số thị ph©n tư nh− allozyme, RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), RFLP (Restrition Fragment Length Polymorphism DNA), AFLP (Amplified Fragment Polymorphism DNA), SSR [(Simple Sequence Repeats hay microsatellite - tiĨu vƯ tinh] v thị khác để đánh giá đa dạng di truyền, nhận dạng dòng giống, xác định độ trình dòng [3, 5, 8, 9, 11, 12] Đặc biệt thị DNA ty thể (mitochondrial DNA sử dụng phơng pháp PCR-RFLP: mt DNA-RFLP) vùng điều khiển D-loop v microsatellite đợc áp dụng rộng r i v hiệu nghiên cứu đánh giá hóa dòng cá rô phi, cá chép [1, 2, 4, 5, 9] loài khác nh tằm dâu [6, 9] Các marker phân tử ny tập trung vo vùng gien có tính đa dạng cao [8] nên đợc ý nghiên cứu Ngoi ra, marker mt-RFLP cho phép xác định biến dị di truyền phục vụ chọn tạo giống v nhận dạng đợc đến loi phụ cá rô phi Oreochromis Niloticus v cá chép [11, 12], nghiên cứu tính đa hình để chọn dòng rô phi lớn nhanh, có khả chống chịu stress, bệnh tật v khí hậu [1] Với mục đích trợ giúp cho công tác chọn lọc giống cá rô phi, góp phần cải tạo chất lợng giống đ tiến hành nghiên cứu sử dụng thị phân tử mt-RFLP để nhận dạng dòng cá rô phi nuôi Việt Nam I PHơNG PHáP nghiên cứu Nguyên liệu l 189 mẫu vây cá dòng cá rô phi khác (bảng 1) Viện Nghiên cứu v Nuôi trồng Thủy sản I (Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh) cung cấp, mẫu đợc ngâm cồn 70oC v bảo quản 4oC tách DNA tổng số Các mồi sử dơng theo tài liƯu cđa Bernatchez & Danzmann [2] có trình tự, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ muối trình by bảng Hóa chất dùng cho tách chiết DNA, thnh phần khuếch đại gen v lo¹i enzim h¹n chÕ mua cđa h ng Fermentas, agarose cđa h ng Promega, Taq polymerase cđa ViƯn C«ng nghƯ sinh häc - ViƯn Khoa häc C«ng nghƯ ViƯt Nam 73 Bảng Tên mẫu số cá thể dòng cá rô phi Tên mẫu Ký hiệu O niloticus Th¸i Lan R1 O areus Phi-lÝp-pin R2 O areus Trung Quèc R3 O areus Israel R4 O niloticus Israel R5 O niloticus Trung Quèc R6 O niloticus §ài Loan R7 STT Sè c¸ thĨ 09 30 30 30 30 30 30 Bảng 2+ Trình tự nucleotid, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ muối Mg mt RFLP Trình tự đọan mồi (5-3) Nhiệt độ gắn mồi Nồng độ Mg 2+ CAA ACT GGG ATT AGA TCA CCC ACT AT 55oC 2,5 mM Tªn måi 12S AGG GTG ACG GGC GGT GTG GT GTG CAA AGG TAG CAT AAT CA TGT CCT GAT CCA ACA TCA AG ACC ACT AGC ACC CAA AGC TA GTG TTA TGC TTT AGT TAA GC 16S D-loop Phơng pháp tách chiết DNA tổng số từ vây cá rô phi theo Đo Thị Tuyết [3] Độ tinh v nồng độ DNA đợc kiểm tra máy đo quang phổ kết hợp với điện di agarose 0,8% so với DNA chuẩn PCR-mtRFLP đợc thực thể tích 20 àl hỗn hợp chứa đệm PCR 10x, MgCl2 2,5 mM, dNTP mM, primer 2,5 mM, Taq polymerase u/1àl, 20ng DNA khuôn Thực khuếch đại gen máy PCR-Thermal Cycler theo chế độ: biến tính DNA phút 94oC-95oC, sau lặp lại 35 chu kỳ 94oC 40 giây đến phút, 55oC 45 giây đến phút, 72oC phút 30 giây, cuối 72oC đến 10 phút v lu giữ 4oC [2] Sản phẩm PCR-mt RFLP đợc điện di phân tích gel agarose 1,2%, nhuộm 22 23 24 25 27 28 10 55oC 2,5 mM 55oC 2,5 mM ethidium bromide, soi v chụp ảnh máy Gen Doc v máy ảnh kỹ thuật số Số liƯu xư lý theo thèng kª sinh häc II KÕT QUả Và THảO LUậN Tách chiết DNA tổng số Mẫu vây 189 cá thể thuộc dòng cá rô phi đợc dùng để tách chiết DNA tổng số theo phơng pháp nh Đo Thị Tuyết [3] đ mô tả Chỉ mẫu DNA có kết kiểm tra đo quang phổ v điện di agarose 0,8% đủ chất lợng đợc dùng phân tích Phân tích phân đoạn 12S rRNA 16S rRNA dòng cá rô phi M1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 M2 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 M3 Hình ảnh điện di sản phẩm 12S rRNA cắt với hai enzim hạn chế Đối chứng; 2-28 mẫu dòng cắt với HinfI; M1,M2 Marker 100bp; M3 Marker 1kb; 29-39 mẫu dòng cắt với TaqI 74 Phân đoạn 12S rRNA 16S rRNA dòng cá rô phi đ đợc khuếch đại v cắt với enzim hạn chế AluI, HinfI, HindIII, PstI, TaqI, BamHI, ClaI, EcoRI, MboI, MspI, RsaI, SacI Trong sè 12 enzim sử dụng để cắt 12S rRNA, có TaqI cắt băng đơn hình tất mẫu, enzim khác không cắt (hình 1) Còn phân đoạn 16S rRNA không cắt enzim Kết nghiên cứu phù hợp với công bố Shekhar cộng [11], theo phân đoạn 12S rRNA cắt đơn hình với vài enzim không cắt mẫu cá rô phi Nh vậy, RFLP 12S rRNA 16S rRNA không cho đa hình Phân tích phân đoạn D-loop dòng cá rô phi Các enzim hạn chế AluI, HinfI, MspI, TaqI, AvaII v EcoRI đợc sử dụng để cắt phân đoạn D-loop dòng cá rô phi Trong số đó, EcoRI không cắt mẫu no, AluI cắt hai băng đơn hình tất dòng Các enzim khác cho kiểu allen khác v biểu diễn bảng Kết bảng cho thấy, dòng rô phi phân tích có mời kiểu allen đợc ký hiệu a, b, c, d, e, g, h, i, k, n Trong ®ã c¾t b»ng AvaII cho hai kiĨu allen, kiĨu a không cắt với kích thớc phân đoạn khoảng 1000 bp, kiểu b có hai phân đoạn 550 bp v 450 bp C¾t b»ng HinfI cho kiĨu allen, kiĨu c có hai phân đoạn 820 bp v 180 bp, kiểu d gồm hai phân đoạn 660bp v 340bp, kiểu e cho ba phân đoạn 440bp, 320bp, 240bp, kiểu g hiển thị hai phân đoạn 680bp v 320bp Cắt MspI cho hai kiểu allen, kiểu h cho hai phân đoạn 820bp v 180bp, kiểu i có ba phân đoạn 520bp, 300bp 180bp C¾t b»ng TaqI cho hai kiĨu allen, kiểu k cho hai phân đoạn 520bp v 480bp, kiểu n có hai phân đoạn 700bp v 300bp Các phân tích lặp lại kết Agnese cộng [1] phân tích di truyền quần đn cá rô phi, theo D-loop cắt với AvaII cho hai kiĨu allen A B, t−¬ng tù kiÓu a b, MspI cã hai kiÓu allen A v B tơng đơng với h v i, TaqI cho hai kiÓu allen A B gièng nh− k v n Riêng với HinfI họ nhận đợc ba kiểu allen l A, B, C, nhận đợc kiĨu c, d, e, g, ®ã kiĨu allen A gồm hai phân đoạn 660 bp v 320bp gần giống với c có hai phân đoạn 660 bp v 340 bp, khả mẫu cha cắt hoàn toàn kết đọc dựa vo marker cha sát, theo khả kiểu allen A tơng tự nh kiểu c, kiểu C giống nh kiểu e Riêng hai kiểu c v g xuất phân tích cđa chóng t«i nh−ng kh«ng thÊy c«ng bè cđa hä kiÓu allen B gåm 400 bp 290 bp không quan sát thấy mẫu cá rô phi nuôi Việt Nam Liệu có phải l khác biệt dòng cá rô phi nuôi vùng địa lý khác nhau? Cần tiếp tục tìm hiểu để khai thác sử dụng Bảng Enzim Kiểu allen Tổng hợp kiểu gene mt-RFLP dòng cá rô phi AvaII HinfI MspI e i b c d g h A C B B A B D A 440 520 A 550 820 660 680 820 300 320 1000 320 180 450 180 340 240 180 Các dòng cá rô phi có đặc tính sinh học kinh tế khác nhau, việc tìm kiếm thị để nhận dạng dòng có ý nghĩa quan trọng chọn giống Phân tích tần số xuất kiểu allen dòng cá rô phi nuôi Việt Nam trình by bảng v hình 3, 4, 5, có thĨ thÊy, mét sè kiĨu allen xt hiƯn víi tÇn xt cao nhÊt nh− kiĨu allen a ë dßng R3, R4 (hình 2A), kiểu allen b dòng R1, R7 (hình 2B), kiểu allen i dòng R1, R5, R7 TaqI k A 520 480 n B 700 300 (h×nh 3A), kiểu allen e h dòng R3 (hình 3B), kiểu allen h n dòng R4 (hình 4A) R3 (hình 4B), kiểu allen d, k, i dòng R5 (hình 5) Từ hình quan sát thấy enzim hạn chế AvaII dùng để nhận dạng dòng R3 tất cá thể dòng không cắt - hình 2A, v dòng R5 cắt đơn hình 100% cá thể hình 2B Ngoài ra, kiểu allen i dòng R2 xuất với tần suất 0,17, kiểu allen h hiển thị với tần suất cao 0,83 75 dòng R1 toàn cá thể cho kiểu allen i (hình 3) Nh kiểu allen suất với tần suất tuyệt đối 100% dòng cá rô phi sử dụng để nhận dạng phân loại chúng Tổng thể quan sát thấy ba dòng R3, R4, R5 phân biệt rõ ràng với bốn dòng lại kiểu allen xuất dòng ny đạt tần suất 100% Trên góc độ khác, thấy số kiểu allen không hiển số dòng cá rô phi sử dụng để phân biệt với dòng khác nh− kiĨu allen a kh«ng cã ë R1, R5, R7, kiểu allen b, i v k không quan sát thấy R3, R4, kiểu allen c không tồn R3, R4, R5, R6, kiĨu allen d kh«ng cã ë dòng R2, R3, R4, R6, R7, kiểu allen e n kh«ng thÊy ë R1 R5, kiĨu allen g không phát đợc R1 đến R5, kiểu allen h không xuát R1, R3, R5, R7 Bảng Tần số xuất kiểu allen dòng cá rô phi Enzime AvaII HinfI MspI TaqI Các dòng Kiểu allen a b c d e g h i k n A B A B C D A B A B n R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 90,0 100 26,0 33,0 99,0 35,0 83,0 77,0 94,0 96,0 1,0 0,67 0,33 1,0 1,0 - 0,87 0,13 0,13 0,87 0,83 0,17 0,17 0,83 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 - 0,13 0,87 0,3 0,7 0,93 0,07 0,67 0,33 1,0 0,52 0,03 0,45 1,0 0,97 0,03 M1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M 24 25 26 27 28 29 30 31 M1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M1 24 25 26 27 28 29 30 31 B A Hình ảnh điện di sản phẩm D-loop cắt với enzim hạn chế AvaII A: 1-30 dòng R3; 31 §èi chøng; M1, M2 Marker 100bp; B: 1-30 dòng R7; 31 Đối chứng M1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 10 11 M112 13 14 15 16 1718 19 20 21 22 23 21 22 23 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M131 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 24 25 26 27 28 2930 31 M132 33 3435 36 37 38 39 40 41 42 43 444546 A B Hình ảnh điện di sản phẩm D-loop cắt với enzim hạn chế MspI HinfI A Cắt với Msp I: 1-9 dòng R1; 10-39 dòng R2; 40-41 Đối chứng; M1, M2 Marker 100bp; B: 1-30 dòng R3 cắt với HinfI; 31-46 dòng R3 cắt với Msp I; 32 §èi chøng 76 B M1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 10 M1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 25 26 27 28 29 30 M1 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 24 25 26 27 28 29 30 31 M1 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 4445 A H×nh ảnh điện di sản phẩm D-loop cắt với enzim hạn chế MspI, TaqI B A A: 1-30 dòng R4 cắt với Msp I; 31-45 dòng R4 cắt với TaqI; 40-41 Đối chứng; M1,M2 Marker 100bp; B: 1-30 dòng R3 cắt với TaqI; 32-45 dòng R3 cắt với Msp I; 31 §èi chøng M1 10 11 12 13 14 15 16 M1 10 11 M 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 M1 3132 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 17 18 19 20 21 22 23 24 25 M1 26 27 28 29 30 31 32 33 A Hình ảnh điện di sản phẩm D-loop dòng R5 cắt với số enzim hạn chế A: 1-30 dòng R5 cắt với HinfI; 31-33 Đối chứng; M1,M2 Marker 100bp; B: 1-30 dòng R5 cắt với TaqI; 31-45 dòng R5 cắt với Msp I; 46 Đối chứng III KếT LUậN dòng cá rô phi có nguồn gốc v đặc tính sinh học khác đ đợc phân tích thị mt-RFLP Với phân đoạn 12S rRNA 16S rRNA không cho đa hình tất dòng Với D-loop xác định đợc 10 kiểu allen kiểu allen a, e, h, n nhận dạng dòng R3, R4, kiĨu allen b, i - nhËn biÕt dßng R1, R5, R7, kiểu allen d nhận dạng dòng R5, kiểu allen k nhËn biÕt dßng R1 R5 chóng xt với tần suất 100% Cần phát triển hớng nghiên cøu ®Ĩ øng dơng vào chän läc gièng Lêi cảm ơn: Công trình thực với kinh phí đề ti cấp Bộ Nông nghiệp v Phát triển Nông thôn 2008-2010 thuộc chơng trình phát triển v ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực thủy sản TàI LIƯU THAM KH¶O Agnese J F., Adepo-Gourene B., Abban E K., Fermon Y., 1997: Heredity 79(1): 88-96 Bernatchez L., Danzmann R G., 1993: Charr Mol Biol Evol., 10: 1002 -1014 Đo Thị Tuyết, Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bảy, Phạm Anh Tuấn, 2003: Đánh giá tính đa hình quần đn cá tra nuôi (Pangasius hypophthalmus) Việt Nam phơng pháp RAPD: 616 - 620 Hội nghị Công nghệ Sinh học ton quốc Nxb Khoa häc vµ Kü thuËt, Hµ Néi McAndrew B J et al., 1988: Genetica, 76: 127-137 Ezaz M T et al., 2004: Mar Biotechnol, 6: 435-445 Edward K N., Keiko KO., 2005: J of Insect Biotechnology and Sericology, 74: 5-13 Lee B-Y., Hulata G., Kocher T D., 2004: Heredity, 92: 543-549 Lee B-Y et al., 2005: Genetics, 170: 237244 Kocher T D et al., 1998: Genetica, 148: 1225-1232 10 Hara W., 1996: Bull Natl Inst Seric Entomol Sci., 16: 21-30 77 11 Shekhar M S et al., 2005: Asian Fisheries Science, 18: 39-48 12 Seyoum S., Kornfield Aquaculture, 102: 29-42 I., 1992: POLYMORPHISM OF THE TILAPIA’S POPULATIONS USING RESTRICTION ENDONUCLEASE ANALYSIS OF MITOCHONDRIAL DNA Nguyen Thi Thanh Binh, Dinh Thi Ngoc Thuy, Quyen Dinh Thi, Pham Anh Tuan SUMMARY We analyzed the genetic differentiation among seven populations of the tilapia reared in Vietnam by using restriction fragment length polymorphism (RFLP) of mitochondrial DNA (mtDNA) The PCR products of 12S rRNA from all the above samples were digested with AluI, HinfI, HindIII, PstI, TaqI, BamHI, ClaI, EcoRI, MboI, MspI, RsaI, SacI restriction enzymes The result showed that eleven enzymes did not cleave and TaqI had identical mono-banded phenotypes In all samples of populations 16S rRNA, PCR product did not show any restriction sites with twelve above restriction enzymes The PCR amplification of D-loop gene was digested with AluI, HinfI, MspI, TaqI, AvaII and EcoRI The enzyme EcoRI did not digested and AluI gave homomorphism In another enzymes, ten different haplotypes was found, among them the genes types a, e, n could identify the populations R3, R4; the types b, i - to define populations R1, R5, R7; the types d - to determine populations R5; the types k - to specify R1, R5 This field can be developed for practical purpose Key words: Tilapia, 12S rRNA, 16S rRNA, D-loop, PCR, population identification, mt DNA Ngày nhËn bµi: 14-1-2009 78 ... cắt mẫu cá rô phi Nh vậy, RFLP 12S rRNA 16S rRNA không cho đa hình Phân tích phân đoạn D-loop dòng cá rô phi Các enzim hạn chế AluI, HinfI, MspI, TaqI, AvaII v EcoRI đợc sử dụng để cắt phân đoạn... c v g xuất phân tích chúng t«i nh−ng kh«ng thÊy c«ng bè cđa hä kiĨu allen B gåm 400 bp 290 bp kh«ng quan sát thấy mẫu cá rô phi nuôi Việt Nam Liệu có phải l khác biệt dòng cá rô phi nuôi vùng... D-loop dòng cá rô phi Trong số đó, EcoRI không cắt mẫu no, AluI cắt hai băng đơn hình tất dòng Các enzim khác cho kiểu allen khác biĨu diƠn ë b¶ng KÕt qu¶ b¶ng cho thấy, dòng rô phi phân tích có