Phân tích đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR trẻ tự kỷ

Bài viết này được nghiên cứu với mục tiêu nhằm phân tích hai đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR ở trẻ tự kỷ. Đối tượng và phương pháp: 20 trẻ tự kỷ được chẩn đoán theo tiêu chuẩn DSM - IV. Sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để phân tích gen MTHFR từ ADN chiết tách trong máu ngoại vi.

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 PHÂN TÍCH ĐA HÌNH C677T VÀ A1298C CỦA GEN MTHFR TRẺ TỰ KỶ Lương Thị Lan Anh*; Nguyễn Thị Trang* Trần Đức Ph n*; Trần Sơn Hải* TĨM TẮT Mục tiêu: phân tích hai đa hình C677T A1298C gen MTHFR trẻ tự kỷ Đối tượng phương pháp: 20 trẻ tự kỷ chẩn đoán theo tiêu chuẩn DSM - IV Sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để phân tích gen MTHFR từ ADN chiết tách máu ngoại vi Kết quả: 80% trẻ có đa hình C677T A1298C, 40% C677T kiểu gen dị hợp tử, A1298C chiếm 60%, 50% kiểu gen dị hợp tử 10% kiểu gen đồng hợp tử Dị hợp tử kép 677CT/1298AC: 15% Các đa hình phát trẻ tự kỷ cao so với nghiên cứu đối chứng Việt Nam giới Kết luận: mở rộng phân tích đa hình C677T A1298C gen MTHFR đa hình liên quan đến chuyển hóa folate/homocysteine trẻ Việt Nam tự kỷ * Từ khóa: Tự kỷ; Đa hình C677T A1298C; Gen MTHFR Analysis MTHFR Gene C677T and A1298C Polymorphism in Autism Spectrum Disorders Summary Objectives: To analyze the C677T and A1298C polymorphism of MTHFR gene in autistic children Subjects and methods: 20 children were diagnosed with autism according to DSM-IV criteria by using ARMS-PCR technique to analyze MTHR gene Results: C677T and A1298C polymorphisms: 80% of children with C677T and A1298C polymorphisms, 40% of C677T were heterozygote, 60% of A1298C, of which, 50% were heterozygote and 10% were homozygous Both 677CT/1298AC compound occupied 15% Polymorphic findings in autism children are higher than in the control studies in Vietnam and in the world Conclusion: We extended the polymorphism analysis of C677T and A1298C of MTHFR gene and folate/homocysteine-related polymorphisms gene in autism Vietnamese children * Keywords: Autism; C677T and A1298C polymorphisms; MTHFR gene ĐẶT VẤN ĐỀ Tự kỷ hội chứng thần kinh hành vi sinh bất thường chức hệ thần kinh gây nên rối loạn phát triển Trẻ biểu điển hình lĩnh vực, bao gồm khiếm khuyết khả quan hệ xã hội, khả ngôn ngữ giao tiếp sinh hành vi mối quan tâm bất thường [1] Tỷ lệ trẻ tự kỷ tăng lên nhanh chóng hầu hết quốc gia giới * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Lương Thị Lan Anh (luongthilananh@hmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 31/08/2017 Ngày báo đăng: 05/09/2017 317 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUN ĐỀ-2017 Theo Trung tâm Kiểm sốt phòng bệnh Mỹ (2016 - CDC), tỷ lệ trẻ tự kỷ nhóm trẻ tuổi từ 1/150 năm 2000 lên 1/68 năm 2012, tỷ lệ nam/nữ mắc bệnh khoảng 4,5/1 [2] Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu tỷ lệ trẻ tự kỷ toàn quốc Tuy nhiên, tỷ lệ trẻ tự kỷ có xu hướng gia tăng Theo nghiên cứu Khoa Phục hồi Chức năng, Bệnh viện Nhi trung ương cho thấy xu mắc tự kỷ tăng nhanh từ 122% đến 268% giai đoạn năm 2004 - 2007 so với năm 2000, số trẻ tự kỷ đến khám vào năm 2007 tăng tới 50 lần [3] Tự kỷ bệnh di truyền đa nhân tố với yếu tố gen di truyền đóng vai trò quan trọng Nhiều tác giả số gen liên quan đến tự kỷ, gen MTHFR nghiên cứu gần Gen MTHFR mã hóa cho protein có hoạt tính enzym xúc tác cho phản ứng tạo 5methyltetrahydrofolate, hợp chất đóng vai trò quan trọng chuyển hóa axít folic, chất cho methyl để chuyển homocystein thành methionin Khi có đột biến, gen MTHFR làm giảm hoạt động enzym, dẫn đến tăng nồng độ homocystein máu trẻ tự kỷ Các nghiên cứu tính đa hình đơn nucleotid (snp) gen MTHFR yếu tố nguy trẻ tự kỷ thông qua tần suất kiểu gen đồng hợp tử, dị hợp tử alen đột biến, đặc biệt tần số alen C677T hay A1298C so sánh bệnh - chứng Tuy nhiên, vấn đề SNP gen MTHFR có thực yếu tố nguy trẻ tự kỷ hay không, nhiều nghiên cứu chưa thật thống [4 318 Trên giới có nhiều nghiên cứu đột biến gen MTHFR bệnh tự kỷ, Việt Nam chưa có nghiên cứu vấn đề Hơn nữa, việc phân tích đột biến gen bệnh tự kỷ thực tồn mối liên quan với bệnh, mở hướng công tác tư vấn trước sinh, dự phòng hạn chế tự kỷ Nghiên cứu thực với mục tiêu: Phân tích hai đa hình C677T A1298C gen MTHFR trẻ tự kỷ ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - 20 trẻ bác sỹ chuyên khoa chẩn đoán xác định tự kỷ - Chẩn đoán xác định trẻ tự kỷ theo tiêu chuẩn DSM - IV, trẻ có dấu hiệu, đó: dấu hiệu biểu khiếm khuyết chất lượng quan hệ xã hội; dấu hiệu biểu khiếm khuyết chất lượng giao tiếp; dấu hiệu có hành vi bất thường * Thời gian địa điểm nghiên cứu: - Từ tháng - 2016 đến - 2017 - Nghiên cứu Bộ môn Y Sinh học Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang * Quy trình: lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi trẻ tự kỷ (máu chống đông EDTA) tách chiết ADN Kiểm tra độ tinh hàm lượng AND máy đo quang phổ Nano-Drop 2000 (với độ tinh tỷ số OD260nm/280nm= 1,8 - 2) Ứng dụng kỹ thuật ARMS - PCR phân tích đa hình C677T A1298C TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Thành phần phản ứng ARM-PCR: Bảng 1: Thành phần mẫu phản ứng PCR Thành phần Master mix Số lƣợng Dung dịch đệm 17,5 µl Mồi: alen thường (C677 A1298)hoặc alen đột biến (T677 C1298) 2,5 µl Taq polymerase 0,2 µl ADN tổng số µl Tổng (Master mix + ADN) 25 µl * Chu trình ln nhiệt: 94oC/1 phút; [94oC/10s; 66oC/20s; 72oC/20s] x 35; 72oC/1 phút; 10oC/10 phút - Điện di phân tích kết quả: sản phẩm PCR điện di agarose gel 3%, hiển thị máy chụp gel UVP Bảng 2: Xác định kiểu gen theo kết điện di Chứng âm Chứng dƣơng Đồng hợp t b nh thƣờng Dị hợp t đ t biến Mồi thường - + + + - Mồi đột biến - + - + + Mồi Đồng hợp t đ t biến (-): không quan sát thấy vạch màu điện di; (+): phát vạch màu điện di) - Các số liệu tổng hợp tính tốn Word Excel 2010 * Đạo đức nghiên cứu: Có cam kết, thỏa thuận với BN, BN kí vào chấp thuận nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu thông báo rõ mục đích nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu giữ kín bí mật cung cấp thơng tin phản hồi kết nghiên cứu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU T lệ đa h nh gen MTHFR * Tỷ lệ đa hình C677T A1298C gen MTHFR: Trong 20 trẻ nghiên cứu, 16 trẻ (80%) mang gen đột biến Đa hình gen MTHFR, cao so với trẻ (20%) không mang gen đột biến Bảng 3: Tỷ lệ đa hình C677T A1298C gen MTHFR Đa h nh C677T Đa h nh A1298C Có Khơng Tổng Có Khơng Tổng Số lượng 12 20 12 20 Tỷ lệ (%) 40 60 100 60 40 100 319 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 T lệ kiểu gen đa h nh C677T A1298C gen MTHFR Bảng 4: Tỷ lệ kiểu gen đa hình C677T A1298C gen MTHFR Đ t biến Kiểu gen Số lƣợng T lệ (%) CC (đồng hợp tử bình thường) 12 60 CT (dị hợp tử đột biến) 40 TT (đồng hợp tử đột biến) 0 Tổng 20 100 AA (đồng hợp tử bình thường) 40 AC (dị hợp tử đột biến) 10 50 CC (đồng hợp tử đột biến) 10 Tổng 20 100 C677T A1298C Tất trẻ mang gen đột biến C677T mang kiểu gen CT (dị hợp tử đột biến), chiếm 40% tổng số trẻ tự kỷ khơng có trẻ mang kiểu gen TT (đồng hợp tử đột biến) Còn lại, 12 trẻ mang kiểu gen CC (đồng hợp tử bình thường), chiếm 60% Trong 12 trẻ mang gen đột biến A1298C, 10 trẻ mang kiểu gen AC (dị hợp tử đột biến), chiếm 50% số trẻ tự kỷ nghiên cứu Trong số trẻ mang kiểu gen CC (đồng hợp tử đột biến) thấp hơn, trẻ chiếm 10% số trẻ tự kỷ nghiên cứu Còn lại, trẻ mang kiểu gen AA (đồng hợp tử bình thường) chiếm 40% Ph n bố t lệ phối hợp kiểu gen t i vị trí 677 1298 t lệ số alen đ t biến gen MTHFR Bảng 5: Phân bố tỷ lệ phối hợp kiểu gen hai vị trí 677 1298 tỷ lệ số alen đột biến gen MTHFR Phối hợp kiểu gen Vị trí 677 Vị trí 1298 T lệ phối hợp kiểu gen Số alen đ t biến T lệ số alen đ t biến CC AA (20%) (20%) CT AA (20%) CC AC (35%) 11 (55%) CC CC (5%) TT AA (20%) CT AC (15%) CT CC (5%) TT AC (5%) TT CC 20 (100%) Tổng 20 (100%) Tổng (CC: Đồng hợp tử bình thường; CT: Dị hợp tử đột biến C677T; TT: Đồng hợp tử đột biến C677T; AA: Đồng hợp tử bình thường; AC: Dị hợp tử đột biến A1298C; CC: Đồng hợp tử đột biến A1298C) 320 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Phối hợp kiểu gen gặp nhiều đồng hợp tử 677CC dị hợp tử 1298AC (35%) Không gặp trường hợp phối hợp kiểu gen khác với đồng hợp tử đột biến 677TT Chúng ghi nhận trường hợp dị hợp tử kép 677CT/1298AC đột biến (15%), trường hợp có kết hợp kiểu gen dị hợp tử đột biến C677T với đồng hợp tử đột biến A1298C (5%) khơng có trường hợp đồng hợp tử hai đột biến Phân bố theo số lượng alen đột biến, chủ yếu gặp BN mang alen đột biến alen T677 alen C1298 (11 trẻ = 55%) Số trẻ không mang alen đột biến mang alen đột biến trẻ (20%) Chúng không ghi nhận trường hợp mang alen đột biến nhóm nghiên cứu Tần số alen đ t biến C677T A1298C gen MTHFR Bảng 6: Tần số alen đột biến C677T A1298C gen MTHFR Đột biến Alen Tỷ lệ (%) C 80 T 20 A 65 C677T A1298C Tần số alen T đột biến C677T (20%) thấp tần số alen C (80%) tần số alen C đột biến A1298C (35%) thấp tần số alen A (65%) BÀN LUẬN Sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR để phát đột biến C677T A1298C gen MTHFR, bước đầu ghi nhận xử lý số liệu hai đa hình trẻ tự kỷ Mặc dù hạn chế cỡ mẫu, làmở đầu cho nghiên cứu chi tiết đa hình trẻ tự kỷ sau Về đa h nh C677T Trên giới có nhiều nghiên cứu đa hình C677T gen MTHFR trẻ tự kỷ, phân tích thống kê tổng hợp nghiên cứu C677T nhiên, kết chưa thực thống [6] Tỷ lệ đa hình C677T gen MTHFR trẻ tự kỷ 40% Nghiên cứu Divyakolu CS (2013) với cỡ mẫu 50 cho tỷ lệ 46% Tỷ lệ kiểu gen có kết tương đồng hai nghiên cứu, tần số alen đột biến T677 nghiên cứu Divyakolu (24%) cao (20%) Nghiên cứu không phát trường hợp mang đồng hợp tử đột biến TT, nghiên cứu Divyakolu phát trường hợp (2%)[7] Shawky (2014) có cỡ mẫu (20 trẻ tự kỷ) độ tuổi với trẻ nghiên cứu, kết có khác biệt Cụ thể, tỷ lệ đột biến (65%), tỷ lệ kiểu gen dị hợp tử (50%) đồng hợp tử đột biến (15%), tần số alen đột biến T677 (40%) cao Tỷ lệ kiểu gen CC 35%, thấp so với tỷ lệ 60% chúng tơi Sự khác biệt sử dụng kỹ thuật khác nhau, liên quan tới vấn đề chủng tộc [7] Nghiên cứu Mohammas CS (2009) 138 trẻ tự kỷ thấy tỷ lệ đột biến C677T thấp (29%), nghiên cứu Boris CS (2004) 168 trẻ tự kỷ,lại lên tới 79,2% Tần số alen đột biến T677 tìm thấy trẻ tự kỷ nghiên 321 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 cứu thay đổi Nghiên cứu Mohammad 16,3%, thấp nghiên cứu (20%) thấp hẳn so với nghiên cứu Boris (51,2%) [9, 10] Sự khác biệt giải thích khác độ tuổi, chủng tộc đối tượng nghiên cứu kỹ thuật phát đột biến Ngoài ra, đối tượng nghiên cứu Boris ngồi trẻ tự kỷ, lấy thêm trẻ có chẩn đốn rối loạn phát triển khơng đặc hiệu, thuộc hội chứng phát triển lan tỏa kiểu tự kỷ giống bệnh tự kỷ [10] Bảng 7: Kết số nghiên cứu đột biến C677T gen MTHFR trẻ tự kỷ LLA CS (2017) Divyakolu (2013) Shawky (2014) Mohammas (2009) Boris (2004) 20 50 20 138 168 ARMS - PCR PCR - RFLP Lai phân tử (RH) PCR - RFLP PCR Tỷ lệ đột biến C677T(%) 40 46 65 29 79,2 CC (%) 60 54 35 71 20,8 CT(%) 40 44 50 25,4 56 TT(%) 15 3,6 23,2 Tần số alen đột biến (%) 20 24 40 16,3 51,2 Thông số nghiên cứu Cỡ mẫu Kỹ thuật sử dụng phát đột biến Kết nghiên cứu khác cho thấy trẻ mang gen đột biến, chủ yếu gặp kiểu gen đột biến dị hợp tử, đột biến đồng hợp tử gặp Về đa h nh A1298C Đa hình A1298C có khác kết theo báo cáo số nghiên cứu Tỷ lệ gặp đột biến nghiên cứu 60%, với nghiên cứu Park Jungwon Hàn Quốc (2014), tỷ lệ thấp hơn, khoảng 37,7% [11], Boris (2004) 45% Tuy nhiên, tỷ lệ gặp đột biến theo nghiên cứu Nagwa Meguid (2015) 24 trẻ tự kỷ Ai Cập, tỷ lệ lên tới 100% [12] Các nghiên cứu khác cỡ mẫu, cách lựa chọn đối tượng nghiên cứu, độ tuổi phương pháp xác định đột biến 322 Tần số alen đột biến C1298 nghiên cứu 35%, thấp Nagwa Meguid (52,1%) Hai nghiên cứu Boris (2004) Park Jungwon (2014) cho tần suất gặp alen đột biến thấp kết gần nhau, tương ứng 25,3% 21,8% Cũng giống đột biến C677T, nghiên cứu khác tỷ lệ kiểu gen, theo báo cáonhững trẻ có kiểu gen mang đột biến, chủ yếu tồn trạng thái dị hợp tử [10, 11, 12] Mối liên quan m t số đa h nh gen MTHFR tự k Nghiên cứu Hà Thị Minh Thi Nguyễn Thị Nguyệt Minh 60 người niên khỏe mạnh tình nguyện thấy tỷ lệ kiểu gen 677CC 71,7%, 677CT: 25% TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 677TT: 3,3% Tần số alen đột biến T677 nhóm người khỏe mạnh: 15,8%; thấp 20% nhóm trẻ mắc bệnh tự kỷ nghiên cứu [3] Nếu so sánh số liệu từ nghiên cứu bệnh chứng khác với nhóm chứng độ tuổi tần số alen đột biến T677 nhóm trẻ tự kỷ chúng tơi (20%) cao nhóm trẻ khơng mắc bệnh tự kỷ nghiên cứu Shawky (15%) [8] hay Mohammas (7,5%) [9] Tần số alen đột biến C1298 nhóm trẻ tự kỷ chúng tơi (35%) cao nhóm chứng từ nghiên cứu Park Jungwon (16,1%) [10] hay Boris (32%) [10] Như vậy, tần số alen đột biến 20 trẻ tự kỷ nghiên cứu lớn so với tần số alen đột biến nhóm chứng số nghiên cứu khác Sự phân bố theo số lượng alen đột biến trẻ tự kỷ thống kê phân tích Tỷ lệ trẻ khơng mang alen đột biến thuộc hai đột biến nêu (20%) tương tự kết Mohammad (18,8%) [8], cao so với nghiên cứu Boris (2%) Có 55% số trẻ mang alen đột biến T677 đột biến C677T C1298 đột biến A1298C, cao so với phân tích Boris (44,6%) Chúng tơi nhận thấy 80% trẻ tự kỷ mang gen đột biến, 15% trẻ mang kiểu gen dị hợp tử kép đột biến 677CT/1298AC, kết Boris cao (25%) Nghiên cứu Boris không ghi nhận trường hợp mang alen đột biến (mang phối hợp kiểu gen 677TT/1298CC) [9] KẾT LUẬN Tỷ lệ đa hình C677T A1298C gen MTHFR 80% Trong đó, 40% đa hình C677T, kiểu gen dị hợp tử, tần số alen 677T: 20% 60% đa hình A1298C, tần số alen 1298C 35% Trẻ tự kỷ có kiểu gen phối hợp chủ yếu 677CC 1298AC (35%) Dị hợp tử kép 677CT/1298AC chiếm 15% Các đa hình phát trẻ tự kỷ cao so với nghiên cứu đối chứng Việt Nam giới Cần mở rộng phân tích đa hình C677T A1298C gen MTHFR đa hình liên quan đến chuyển hóa folate/homocysteine trẻ tự kỷ Việt Nam L I CẢM ƠN Nghiên cứu thực thành công nhờ hỗ trợ tập thể cán Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Vũ Thị Bích Hạnh Tự kỷ phát sớm can thiệp sớm Nhà xuất Y học Hà Nội 2007 Nguyễn Thị Hương Giang, Trần Thị Thu Hà Nghiên cứu xu mắc số đặc điểm dịch tễ học trẻ tự kỷ điều trị Bệnh viện Nhi Trung ương giai đoạn 2000 - 2007 Tạp chí Y học Thực hành 2008, (4), tr.104-107 Hà Thị Minh Thi, Nguyễn Thị Nguyệt Minh Nghiên cứu xác định đa hình C677T gen MTHFR kỹ thuật PCR - RFLP bệnh nhân có tinh dịch đồ bất thường Tạp chí Y dược học 2012, 2(1), tr.66-68 Centers for Disease Control and Prevention Community Report on Autism, Atlanta 2016 323 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Didem Behice Oztop, Elif Funda Sener, Yusuf Ozkul MTHFR gene C677T polymorphism in autism spectrum disorders Genetics Research International 2014, pp.1-5 Vandana Rai Association of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene C677T polymorphism with autism: evidence of genetic susceptibility Metab Brain Dis 2016, 31 (4), pp.727-735 Sireesha Divyakolu, Yadavalli Tejaswini, Winnie Thomas et al Evaluation of C677T polymorphism of the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene in various neurological disorders Neurological Disorders 2013, (1), pp.142-146 R M Shawky, Farida El-baz, T M Kamal et al Study of genotype–phenotype correlation of methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene polymorphisms in a sample of Egyptian autistic children The 324 Egyptian Journal of Medical Human Genetics 2014, (15), pp.335-341 N.S Mohammad, Ram Prakash Singh, Usha Naik et al Aberrations in folate metabolic pathway and altered susceptibility to autism Psychiatric Genetics 2009, 19, pp.171-176 10 Marvin Boris M.D, Allan Goldblatt P.A, Joseph Galanko PhD et al Association of MTHFR gene variants with autism Journal of American Physicians and Surgeons 2004, (4), pp.106-108 11 J Park, M Ro, J A Pyun et al MTHFR 1298A4C is a risk factor for autism spectrum disorder in the Korean population Psychiatry Research 2014, 215 (1), pp.258-259 12 Nagwa Meguid, Ola Gebril, Rehab Khalil et al Evaluation of MTHFR genetic polymorphism as a risk factor in Egyptian autistic children and mothers Journal of Psychiatry 2015, 18 (1), pp.1-4  ... nh gen MTHFR * Tỷ lệ đa hình C677T A1298C gen MTHFR: Trong 20 trẻ nghiên cứu, 16 trẻ (80%) mang gen đột biến Đa hình gen MTHFR, cao so với trẻ (20%) không mang gen đột biến Bảng 3: Tỷ lệ đa hình. .. giới có nhiều nghiên cứu đa hình C677T gen MTHFR trẻ tự kỷ, phân tích thống kê tổng hợp nghiên cứu C677T nhiên, kết chưa thực thống [6] Tỷ lệ đa hình C677T gen MTHFR trẻ tự kỷ 40% Nghiên cứu Divyakolu... Các đa hình phát trẻ tự kỷ cao so với nghiên cứu đối chứng Việt Nam giới Cần mở rộng phân tích đa hình C677T A1298C gen MTHFR đa hình liên quan đến chuyển hóa folate/homocysteine trẻ tự kỷ Việt