Bài viết này được nghiên cứu với mục tiêu nhằm phân tích hai đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR ở trẻ tự kỷ. Đối tượng và phương pháp: 20 trẻ tự kỷ được chẩn đoán theo tiêu chuẩn DSM - IV. Sử dụng kỹ thuật ARMS-PCR để phân tích gen MTHFR từ ADN chiết tách trong máu ngoại vi.
Trang 1PHÂN TÍCH ĐA HÌNH C677T VÀ A1298C CỦA GEN MTHFR
TRẺ TỰ KỶ
Lương Thị Lan Anh*; Nguyễn Thị Trang* Trần Đức Ph n*; Trần Sơn Hải*
TÓM TẮT
Mục tiêu: phân tích hai đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR ở trẻ tự kỷ Đối tượng và phương pháp: 20 trẻ tự kỷ được chẩn đoán theo tiêu chuẩn DSM - IV Sử dụng kỹ thuật
ARMS-PCR để phân tích gen MTHFR từ ADN chiết tách trong máu ngoại vi Kết quả: 80% trẻ
có đa hình C677T và A1298C, 40% C677T đều là kiểu gen dị hợp tử, A1298C chiếm 60%, trong đó 50% là kiểu gen dị hợp tử và 10% kiểu gen đồng hợp tử Dị hợp tử kép 677CT/1298AC: 15% Các đa hình phát hiện ở trẻ tự kỷ đều cao hơn so với các nghiên cứu đối
chứng tại Việt Nam và trên thế giới Kết luận: mở rộng phân tích đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR và các đa hình liên quan đến chuyển hóa folate/homocysteine ở trẻ Việt Nam tự kỷ
* Từ khóa: Tự kỷ; Đa hình C677T và A1298C; Gen MTHFR
Analysis MTHFR Gene C677T and A1298C Polymorphism in Autism Spectrum Disorders
Summary
Objectives: To analyze the C677T and A1298C polymorphism of MTHFR gene in autistic children Subjects and methods: 20 children were diagnosed with autism according to DSM-IV criteria by using ARMS-PCR technique to analyze MTHR gene Results: C677T and A1298C
polymorphisms: 80% of children with C677T and A1298C polymorphisms, 40% of C677T were
heterozygote, 60% of A1298C, of which, 50% were heterozygote and 10% were homozygous Both 677CT/1298AC compound occupied 15% Polymorphic findings in autism children are higher than in the control studies in Vietnam and in the world Conclusion: We extended the polymorphism analysis of C677T and A1298C of MTHFR gene and folate/homocysteine-related polymorphisms gene in autism Vietnamese children
* Keywords: Autism; C677T and A1298C polymorphisms; MTHFR gene
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tự kỷ là một hội chứng thần kinh và hành
vi sinh ra do bất thường chức năng của
hệ thần kinh gây nên rối loạn phát triển
Trẻ biểu hiện điển hình ở 3 lĩnh vực, bao
gồm khiếm khuyết về khả năng quan hệ
xã hội, khả năng ngôn ngữ giao tiếp và sinh ra hành vi cùng các mối quan tâm bất thường [1] Tỷ lệ trẻ tự kỷ tăng lên nhanh chóng ở hầu hết các quốc gia trên thế giới
* Trường Đại học Y Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Lương Thị Lan Anh (luongthilananh@hmu.edu.vn)
Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 31/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 05/09/2017
Trang 2Theo Trung tâm Kiểm soát và phòng
bệnh Mỹ (2016 - CDC), tỷ lệ trẻ tự kỷ ở
nhóm trẻ 8 tuổi từ 1/150 năm 2000 lên
1/68 năm 2012, trong đó tỷ lệ nam/nữ
mắc bệnh khoảng 4,5/1 [2] Tại Việt Nam,
chưa có nhiều nghiên cứu về tỷ lệ trẻ tự
kỷ trên toàn quốc Tuy nhiên, tỷ lệ trẻ tự
kỷ có xu hướng gia tăng Theo nghiên
cứu của Khoa Phục hồi Chức năng, Bệnh
viện Nhi trung ương cho thấy xu thế mắc
tự kỷ tăng nhanh từ 122% đến 268%
trong giai đoạn năm 2004 - 2007 so với
năm 2000, số trẻ tự kỷ đến khám vào
năm 2007 tăng tới 50 lần [3]
Tự kỷ là bệnh di truyền đa nhân tố với
yếu tố gen và di truyền đóng vai trò quan
trọng Nhiều tác giả chỉ ra một số gen liên
quan đến tự kỷ, trong đó gen MTHFR
đang được nghiên cứu gần đây Gen
MTHFR mã hóa cho protein có hoạt tính
enzym xúc tác cho phản ứng tạo
5-methyltetrahydrofolate, là hợp chất đóng
vai trò quan trọng trong chuyển hóa axít
folic, là chất cho methyl để chuyển
homocystein thành methionin Khi có đột
biến, gen MTHFR làm giảm hoạt động
của enzym, dẫn đến tăng nồng độ
homocystein trong máu của trẻ tự kỷ Các
nghiên cứu cũng chỉ ra tính đa hình đơn
nucleotid (snp) của gen MTHFR là một
yếu tố nguy cơ của trẻ tự kỷ thông qua
tần suất của kiểu gen đồng hợp tử, dị hợp
tử các alen đột biến, đặc biệt tần số của
alen C677T hay A1298C khi so sánh
bệnh - chứng Tuy nhiên, vấn đề các SNP
của gen MTHFR có thực sự là yếu tố
nguy cơ của trẻ tự kỷ hay không, nhiều
nghiên cứu hiện vẫn còn chưa thật sự
thống nhất [4
Trên thế giới có nhiều nghiên cứu về
đột biến gen MTHFR và bệnh tự kỷ, nhưng
tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu về vấn đề này Hơn nữa, việc phân tích các đột biến gen trong bệnh tự kỷ và nếu thực
sự tồn tại mối liên quan với bệnh, có thể
mở ra một hướng mới trong công tác tư vấn trước sinh, dự phòng và hạn chế tự
kỷ Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Phân tích hai đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR ở trẻ tự kỷ
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
- 20 trẻ được bác sỹ chuyên khoa chẩn đoán xác định tự kỷ
- Chẩn đoán xác định trẻ tự kỷ theo tiêu chuẩn DSM - IV, trẻ có ít nhất 6 dấu hiệu, trong đó: 2 dấu hiệu biểu hiện khiếm khuyết về chất lượng quan hệ xã hội; 1 dấu hiệu biểu hiện khiếm khuyết về chất lượng giao tiếp; 1 dấu hiệu có hành vi bất thường
* Thời gian và địa điểm nghiên cứu:
- Từ tháng 7 - 2016 đến 4 - 2017
- Nghiên cứu tại Bộ môn Y Sinh học -
Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội
2 Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả cắt ngang
* Quy trình: lấy mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi của trẻ tự kỷ (máu chống đông EDTA) và tách chiết ADN Kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng AND bằng máy
đo quang phổ Nano-Drop 2000 (với độ tinh sạch khi tỷ số OD260nm/280nm= 1,8 - 2) Ứng dụng kỹ thuật ARMS - PCR phân tích 2 đa hình C677T và A1298C
Trang 3* Thành phần phản ứng ARM-PCR:
Bảng 1: Thành phần trong một mẫu phản ứng PCR
Master mix
Mồi: alen thường (C677 hoặc A1298)hoặc alen đột biến
* Chu trình luân nhiệt: 94o
C/1 phút; [94oC/10s; 66oC/20s; 72oC/20s] x 35; 72oC/1 phút; 10oC/10 phút
- Điện di và phân tích kết quả: sản phẩm PCR được điện di trên agarose gel 3%, hiển thị trên máy chụp gel UVP
Bảng 2: Xác định kiểu gen theo kết quả điện di
âm
Chứng
(-): không quan sát thấy vạch màu trên bản điện di; (+): phát hiện vạch màu trên bản điện di)
- Các số liệu được tổng hợp và tính toán bằng Word và Excel 2010
* Đạo đức của nghiên cứu:
Có cam kết, thỏa thuận với BN, BN kí vào bản chấp thuận nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu được thông báo rõ về mục đích nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu được giữ kín bí mật khi cung cấp thông tin và được phản hồi kết quả nghiên cứu
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 T lệ đa h nh gen MTHFR
* Tỷ lệ đa hình C677T hoặc A1298C gen MTHFR:
Trong 20 trẻ nghiên cứu, 16 trẻ (80%) mang gen đột biến Đa hình gen MTHFR, cao hơn
so với 4 trẻ (20%) không mang gen đột biến
Bảng 3: Tỷ lệ từng đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR
Trang 42 T lệ kiểu gen đa h nh C677T và A1298C của gen MTHFR
Bảng 4: Tỷ lệ kiểu gen đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR
C677T
A1298C
Tất cả 8 trẻ mang gen đột biến C677T đều mang kiểu gen CT (dị hợp tử đột biến), chiếm 40% tổng số trẻ tự kỷ và không có trẻ nào mang kiểu gen TT (đồng hợp tử đột biến) Còn lại, 12 trẻ mang kiểu gen CC (đồng hợp tử bình thường), chiếm 60%
Trong 12 trẻ mang gen đột biến A1298C, 10 trẻ mang kiểu gen AC (dị hợp tử đột biến), chiếm 50% số trẻ tự kỷ trong nghiên cứu Trong khi số trẻ mang kiểu gen CC (đồng hợp tử đột biến) thấp hơn, 2 trẻ chiếm 10% số trẻ tự kỷ trong nghiên cứu Còn lại, 8 trẻ mang kiểu gen AA (đồng hợp tử bình thường) chiếm 40%
3 Ph n bố t lệ phối hợp kiểu gen t i 2 vị trí 677 và 1298 và t lệ số alen đ t
biến của gen MTHFR
Bảng 5: Phân bố tỷ lệ phối hợp kiểu gen tại hai vị trí 677 và 1298 và tỷ lệ số alen đột
biến của gen MTHFR
T lệ số alen đ t biến
(CC: Đồng hợp tử bình thường; CT: Dị hợp tử đột biến C677T; TT: Đồng hợp tử đột biến C677T; AA: Đồng hợp tử bình thường; AC: Dị hợp tử đột biến A1298C; CC: Đồng
hợp tử đột biến A1298C)
Trang 5Phối hợp kiểu gen gặp nhiều nhất là
giữa đồng hợp tử 677CC và dị hợp tử
1298AC (35%) Không gặp trường hợp
nào phối hợp kiểu gen khác với đồng hợp
tử đột biến 677TT Chúng tôi ghi nhận 3
trường hợp dị hợp tử kép 677CT/1298AC
của 2 đột biến (15%), 1 trường hợp có kết
hợp kiểu gen dị hợp tử đột biến C677T
với đồng hợp tử đột biến A1298C (5%) và
không có trường hợp nào đồng hợp tử
hai đột biến
Phân bố theo số lượng alen đột biến,
chủ yếu gặp BN mang 1 alen đột biến
hoặc alen T677 hoặc alen C1298 (11 trẻ
= 55%) Số trẻ không mang alen đột biến
nào và mang 2 alen đột biến đều ở 4 trẻ
(20%) Chúng tôi không ghi nhận trường
hợp nào mang 4 alen đột biến trong nhóm
nghiên cứu
4 Tần số alen đ t biến C677T và
A1298C của gen MTHFR
Bảng 6: Tần số alen đột biến C677T
và A1298C của gen MTHFR
C677T
Tần số alen T của đột biến C677T
(20%) thấp hơn tần số alen C (80%) và
tần số alen C của đột biến A1298C (35%)
cũng thấp hơn tần số alen A (65%)
BÀN LUẬN
Sử dụng kỹ thuật ARMS - PCR để
phát hiện đột biến C677T và A1298C của
gen MTHFR, bước đầu ghi nhận và xử lý
các số liệu về hai đa hình này ở trẻ tự kỷ
Mặc dù còn hạn chế về cỡ mẫu, nhưng đây cũng làmở đầu cho các nghiên cứu tiếp theo chi tiết hơn về đa hình trên trẻ tự
kỷ sau này
1 Về đa h nh C677T
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu
về đa hình C677T của gen MTHFR ở trẻ
tự kỷ, các phân tích thống kê tổng hợp những nghiên cứu về C677T tuy nhiên, kết quả chưa thực sự thống nhất [6]
Tỷ lệ đa hình C677T trên gen MTHFR
ở trẻ tự kỷ là 40% Nghiên cứu của Divyakolu và CS (2013) với cỡ mẫu 50 cho tỷ lệ này là 46% Tỷ lệ các kiểu gen cũng có kết quả khá tương đồng giữa hai nghiên cứu, tần số alen đột biến T677 ở nghiên cứu của Divyakolu (24%) cao hơn chúng tôi (20%) Nghiên cứu này không phát hiện trường hợp nào mang đồng hợp tử đột biến TT, còn nghiên cứu của Divyakolu cũng chỉ phát hiện được 1 trường hợp (2%)[7]
Shawky (2014) có cùng cỡ mẫu (20 trẻ
tự kỷ) và cùng độ tuổi với trẻ trong nghiên cứu, nhưng kết quả có sự khác biệt Cụ thể, tỷ lệ đột biến (65%), tỷ lệ kiểu gen dị hợp tử (50%) và đồng hợp tử đột biến (15%), tần số alen đột biến T677 (40%) đều cao hơn Tỷ lệ kiểu gen CC là 35%, thấp hơn so với tỷ lệ 60% của chúng tôi
Sự khác biệt này có thể do sử dụng kỹ thuật khác nhau, cũng như liên quan tới vấn đề chủng tộc [7] Nghiên cứu của Mohammas và CS (2009) trên 138 trẻ tự
kỷ thấy tỷ lệ đột biến C677T thấp hơn (29%), trong khi nghiên cứu của Boris và
CS (2004) trên 168 trẻ tự kỷ,lại lên tới 79,2% Tần số alen đột biến T677 được tìm thấy ở trẻ tự kỷ trong những nghiên
Trang 6cứu cũng thay đổi Nghiên cứu Mohammad
là 16,3%, thấp hơn nghiên cứu chúng tôi
(20%) và thấp hơn hẳn so với nghiên cứu
của Boris (51,2%) [9, 10] Sự khác biệt
được giải thích là do khác nhau độ tuổi,
chủng tộc của đối tượng nghiên cứu và
kỹ thuật phát hiện đột biến Ngoài ra, đối tượng nghiên cứu Boris ngoài trẻ tự kỷ, còn lấy thêm những trẻ có chẩn đoán rối loạn phát triển không đặc hiệu, cùng thuộc hội chứng phát triển lan tỏa kiểu tự
kỷ giống như bệnh tự kỷ [10]
Bảng 7: Kết quả một số nghiên cứu đột biến C677T của gen MTHFR ở trẻ tự kỷ
(2017)
Divyakolu (2013)
Shawky (2014)
Mohammas (2009)
Boris (2004)
Kỹ thuật sử dụng phát
Lai phân
Kết quả giữa các nghiên cứu tuy khác
nhau nhưng đều cho thấy khi trẻ mang
gen đột biến, chủ yếu gặp kiểu gen đột
biến dị hợp tử, trong khi đột biến đồng
hợp tử thì ít gặp hơn
2 Về đa h nh A1298C
Đa hình A1298C cũng có sự khác
nhau về kết quả theo báo cáo của một số
nghiên cứu Tỷ lệ gặp đột biến này trong
nghiên cứu là 60%, trong khi với nghiên
cứu của Park Jungwon tại Hàn Quốc
(2014), tỷ lệ này thấp hơn, khoảng 37,7%
[11], của Boris (2004) là 45% Tuy nhiên,
tỷ lệ gặp đột biến này theo nghiên cứu
của Nagwa Meguid (2015) trên 24 trẻ tự
kỷ Ai Cập, tỷ lệ này lên tới 100% [12]
Các nghiên cứu khác nhau về cỡ mẫu,
cách lựa chọn đối tượng nghiên cứu, độ
tuổi và phương pháp xác định đột biến
Tần số alen đột biến C1298 trong nghiên cứu là 35%, thấp hơn của Nagwa Meguid (52,1%) Hai nghiên cứu của Boris (2004) và Park Jungwon (2014) cho tần suất gặp alen đột biến này thấp hơn
và kết quả gần như nhau, tương ứng 25,3% và 21,8%
Cũng giống như đột biến C677T, tuy các nghiên cứu khác nhau về tỷ lệ kiểu gen, nhưng theo báo cáonhững trẻ có kiểu gen mang đột biến, chủ yếu vẫn tồn tại ở trạng thái dị hợp tử [10, 11, 12]
3 Mối liên quan giữa m t số đa h nh
gen MTHFR và tự k
Nghiên cứu của Hà Thị Minh Thi và Nguyễn Thị Nguyệt Minh trên 60 người thanh niên khỏe mạnh tình nguyện thấy tỷ
lệ kiểu gen 677CC là 71,7%, 677CT: 25%
Trang 7và 677TT: 3,3% Tần số alen đột biến
T677 ở nhóm người khỏe mạnh: 15,8%;
thấp hơn 20% ở nhóm trẻ mắc bệnh tự kỷ
trong nghiên cứu của chúng tôi [3]
Nếu so sánh số liệu từ các nghiên cứu
bệnh chứng khác với nhóm chứng cùng
độ tuổi thì tần số alen đột biến T677 ở
nhóm trẻ tự kỷ của chúng tôi (20%) cao
hơn nhóm trẻ không mắc bệnh tự kỷ
trong nghiên cứu của Shawky (15%) [8]
hay Mohammas (7,5%) [9] Tần số alen
đột biến C1298 trong nhóm trẻ tự kỷ của
chúng tôi (35%) cao hơn nhóm chứng từ
nghiên cứu của Park Jungwon (16,1%)
[10] hay Boris (32%) [10]
Như vậy, tần số alen đột biến ở 20 trẻ
tự kỷ trong nghiên cứu của chúng tôi lớn
hơn so với tần số alen đột biến ấy trong
nhóm chứng của một số nghiên cứu
khác
Sự phân bố theo số lượng alen đột
biến trong mỗi trẻ tự kỷ được thống kê và
phân tích Tỷ lệ trẻ không mang alen đột
biến nào thuộc hai đột biến nêu trên
(20%) tương tự kết quả của Mohammad
(18,8%) [8], nhưng cao hơn so với nghiên
cứu của Boris (2%) Có 55% số trẻ mang
1 alen đột biến hoặc T677 của đột biến
C677T hoặc C1298 của đột biến A1298C,
cao hơn so với phân tích của Boris
(44,6%) Chúng tôi nhận thấy trong 80%
trẻ tự kỷ mang gen đột biến, 15% trẻ
mang kiểu gen dị hợp tử kép đột biến
677CT/1298AC, kết quả của Boris cao
hơn (25%) Nghiên cứu chúng tôi và của
Boris đều không ghi nhận trường hợp nào
mang 4 alen đột biến (mang phối hợp
kiểu gen 677TT/1298CC) [9]
KẾT LUẬN
Tỷ lệ đa hình C677T và A1298C của gen MTHFR là 80% Trong đó, 40% đa hình C677T, đều là kiểu gen dị hợp tử, tần số alen 677T: 20% 60% đa hình A1298C, tần số alen 1298C là 35% Trẻ tự kỷ có kiểu gen phối hợp chủ yếu 677CC và 1298AC (35%) Dị hợp tử kép 677CT/1298AC chiếm 15%
Các đa hình phát hiện ở trẻ tự kỷ đều cao hơn so với các nghiên cứu đối chứng tại Việt Nam và trên thế giới Cần mở rộng phân tích đa hình C677T và A1298C
của gen MTHFR và đa hình liên quan đến
chuyển hóa folate/homocysteine ở trẻ tự
kỷ Việt Nam
L I CẢM ƠN
Nghiên cứu thực hiện thành công nhờ
sự hỗ trợ của tập thể cán bộ Bộ môn Y Sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y
Hà Nội
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Vũ Thị Bích Hạnh Tự kỷ phát hiện sớm
và can thiệp sớm Nhà xuất bản Y học Hà Nội
2007
2 Nguyễn Thị Hương Giang, Trần Thị Thu
Hà Nghiên cứu xu thế mắc và một số đặc điểm dịch tễ học của trẻ tự kỷ điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương giai đoạn 2000 - 2007 Tạp chí Y học Thực hành 2008, (4), tr.104-107
3 Hà Thị Minh Thi, Nguyễn Thị Nguyệt Minh Nghiên cứu xác định đa hình C677T trên gen MTHFR bằng kỹ thuật PCR - RFLP ở bệnh nhân có tinh dịch đồ bất thường Tạp chí Y dược học 2012, 2(1), tr.66-68
4 Centers for Disease Control and Prevention Community Report on Autism,
Atlanta 2016
Trang 85 Didem Behice Oztop, Elif Funda Sener,
Yusuf Ozkul MTHFR gene C677T polymorphism
in autism spectrum disorders Genetics Research
International 2014, pp.1-5
6 Vandana Rai Association of
methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR)
gene C677T polymorphism with autism:
evidence of genetic susceptibility Metab Brain
Dis 2016, 31 (4), pp.727-735
7 Sireesha Divyakolu, Yadavalli Tejaswini,
Winnie Thomas et al Evaluation of C677T
polymorphism of the methylenetetrahydrofolate
reductase (MTHFR) gene in various neurological
disorders Neurological Disorders 2013, 2 (1),
pp.142-146
8 R M Shawky, Farida El-baz, T M
Kamal et al Study of genotype–phenotype
correlation of methylene tetrahydrofolate
reductase (MTHFR) gene polymorphisms in a
sample of Egyptian autistic children The
Egyptian Journal of Medical Human Genetics
2014, (15), pp.335-341
9 N.S Mohammad, Ram Prakash Singh, Usha Naik et al Aberrations in folate
metabolic pathway and altered susceptibility
to autism Psychiatric Genetics 2009, 19, pp.171-176
10 Marvin Boris M.D, Allan Goldblatt P.A, Joseph Galanko PhD et al Association of
MTHFR gene variants with autism Journal of American Physicians and Surgeons 2004, 9 (4), pp.106-108
11 J Park, M Ro, J A Pyun et al MTHFR
1298A4C is a risk factor for autism spectrum disorder in the Korean population Psychiatry Research 2014, 215 (1), pp.258-259
12 Nagwa Meguid, Ola Gebril, Rehab Khalil et al Evaluation of MTHFR genetic
polymorphism as a risk factor in Egyptian autistic children and mothers Journal of Psychiatry 2015, 18 (1), pp.1-4