Để phân tích đa hình này ở quần thể người Việt Nam, nghiên cứu có mục tiêu tối ưu phương pháp khuếch đại gen - Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism - PCR - RFLP) với các cặp mồi, chu trình nhiệt, enzyme giới hạn được lựa chọn, thử nghiệm để xác định điều kiện tối ưu.
HNUE JOURNAL OF SCIENCE Natural Sciences, 2020, Volume 65, Issue 3, pp 123-129 This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn DOI: 10.18173/2354-1059.2020-0015 TỐI ƯU QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID RS320 THUỘC GEN LIPOPROTEIN LIPASE N Ư I VIỆT NAM Phạm Thị Bích Đào1, Dương Tuấn Linh2, Bùi Thị Thúy Nga2, Nguyễn Ánh Ngọc2, Trần Quang Thuyên3, Trần Thị Lan Anh4, Phùng Thanh Hương4 Trần Quang Bình2 Bộ môn Y sinh, Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương Viện Dinh Dưỡng, 3Viện Y học Dự phịng Qn đội Bộ mơn Hóa sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội T Đa h nh rs tr n g n Lipoprotein lipase (LPL) c o c o c li n quan n triglyc ri , chol st rol toàn phần, lipoprotein tỉ trọng cao, lipoprotein tỉ trọng thấp Để phân tích a h nh quần thể người Việt Nam, nghiên cứu có mục tiêu tối ưu phương ph p khu ch ại g n - Đa h nh chiều ài oạn cắt gi i hạn Polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism - PCR - RFLP) v i cặp mồi, chu trình nhiệt, enzyme gi i hạn c lựa chọn, thử nghiệm ể x c ịnh iều kiện tối ưu t qu , ch ng o t i tối ưu c quy tr nh P R v i nhiệt cặp C, ph n ứng cắt của enzyme gi i hạn cần ơn vị nzym HindIII t số m u ại iện cho kiểu g n ,T , TT sau x c ịnh ng P R - R P c phân tích lại ng phương ph p gi i tr nh tự cho k t qu tương ồng Quy tr nh x c ịnh kiểu g n a h nh rs ng phương ph p PCR - RFLP c thể p ụng tr n quy m l n ể x c ịnh tỉ lệ kiểu g n phân tích mối li n quan gi a a h nh rs v i rối loạn lipi m u Từ khóa: Gen LPL, rs320, PCR - RFLP Rối loạn lipid máu tình trạng bệnh lí có m t nhiều thơng số lipid bị rối loạn: tăng chol st rol tăng triglyc ri T ), tăng lipoprot in tỉ trọng thấp (LDL-C), gi m lipoprotein tỉ trọng cao (HDL-C) [1 u tố nguy n t i rối loạn lipi m u gồm y u tố i truyền, y u tố m i trường, ch ăn, t p thể ục, o ph hay c c ệnh tiểu ường, ệnh th n, ệnh gan Trong y u tố i truyền chi m t i - 60% [2] ho t i ph t c a h nh ơn nucl oi S P) loci tr n g n người c li n quan n rối loạn lipi m u t số g n li n quan n rối loạn lipi m u c x c ịnh P , ABCA1 (ATP-binding cassette subfamily A member 1), LIPG (lipase G), PCSK9 (Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9), LIPC (lipase C), CETP (Cholesteryl ester transfer protein), APOB (apoprotein B), APOE-C1-C4-C2 (apoprotein E-C1-C4-C2), APOA1-C3-A4-A5 (apoprotein A1-C3-A4-A5) [4] Gen LPL n m cánh ngắn nhiễm sắc thể số , vị trí ao gồm xon intron, chiều ài 30 kb [5], mã hóa cho enzyme LPL (Lipoprotein lipase) c vai tr thủy phân T chylomicron Lipoprotein tỉ trọng thấp D - Very Low Density Lipoproteins) Ngày nh n bài: 4/7/2019 Ngày sửa bài: 6/2/2020 Ngày nh n ăng 13/2/2020 Tác gi liên hệ: Phạm Thị Bích Đào Địa e-mail: dao.ptbich@gmail.com 123 P.T.B Đào, D.T Linh, B.T.T Nga, N.A Ngọc, T.Q Thuyên, T.T.L Anh, P.T Hương T.Q Bình thành acid béo tự o glyc rol Đây c quy t ịnh tốc qu tr nh chuyển h a lipoprotein [6] Các nghiên cứu lâm sàng kiểm tra t bi n chức LPL d n t i rối loạn lipi m u ệnh tăng chylomicron m u c tính chất gia nh [7] ệnh tăng lipoprot in [8] ho t i c kho ng i n thể c x c ịnh gen LPL Trong a h nh ơn nucl oti rs a h nh phổ bi n gen LPL [5] c báo cáo có li n quan n triglyc ri nồng HD -C [9-11], cholesterol toàn phần [12, 13], LDL-C [14] m t số dân t c nhiều phương ph p x c ịnh S P P R - RFLP (Polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism) [15], AS - PCR (Allele-Specific PCR), realtime- PCR [16], gi i tr nh tự Trong phương ph p P R - R P k thu t x c, tốn k m kh ng y u cầu c c thi t ị tiền, thi t k cho PCR-RFLP dễ dàng [15 Phương ph p P R- R P c sử dụng ể phân tích a h nh ơn nucl oti tr n m t số gen phịng thí nghiệm Việt am APOA5 (Apolipoprotein A5) [17], CDKN2A (cyclin-dependent kinase Inhibitor 2A) [18] Nghiên cứu có mục tiêu tối ưu phương ph p P R-RFLP có tham kh o cặp mồi nghiên cứu Ranjit ể phân tích a h nh ơn nucl oti rs thu c gen LPL người Việt Nam K t qu nghiên cứu giúp cho việc phân tích a h nh g n P rs tr n quy mô l n nghiên cứu ti p theo N Đ * : ồm người ân t c Kinh từ 40 - 64 tuổi tỉnh Hà am tham gia nghi n cứu Đề tài m t phần ghi n cứu t p năm ệnh i th o ường Typ h i chứng chuyển h a người iệt am tr y u tố i truyền lối sống c H i ồng y ức Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương th o quy t ịnh số IRB-VN0105734/2016 * Kit Wizard® Genomic ADN Purification (Promega, USA), GoTaq Green ast r mix x Prom ga), nư c tinh GIBCO® UltraPure Distilled Water (Invitrogen), enzyme Hin B, nh Quốc), thạch garos Prom ga, ), ệm UltraPureTM 10X TBE Buffer (Invitrogen, ), R sa ntron Biot chnology, Hàn Quốc), thang chu n D ntron Biot chnology, Hàn Quốc) * P p áp ết ADN từ máu toàn phần: Phương ph p t ch D từ t bào bạch cầu máu tồn phần sử dụng b Kit Wizard® Genomic ADN Purification (Promega, USA) * Xá định kiểu gen bằ p p áp RFLP-PCR c D ng phản ng C đ hu ch đại đoạn g n ch a rs ặp mồi sử ụng gồm mồi xu i LPL rs ’- GATGCTACCTGGATAATCAAAG - ’ mồi ngư c P rs R ’- TT T TT T T T - ’ DT, ) th o nghi n cứu Ranjit [19] iểm tra mồi tr n trang mạng Blast prim r 20 Prim r w 21 x c ịnh tính ặc hiệu mồi, chiều ài s n ph m Ti n hành thử nghiệm v i c c nhiệt cặp kh c ể lựa chọn nhiệt cặp tối ưu cho quy tr nh c Điện i đ i tra sản ph C S n ph m P R c iện i tr n thạch agaros , 100V 40 phút, nhu m v i R sa , thang chu n D c chụp h nh nh iện i tr n m y l oc c sản ph C v i n gi i hạn đ c hiệu v i rs nzym gi i hạn Hin tham kh o 19 c tr nh tự vị trí cắt 124 Tối ưu qu trình phân tích đa hình đơn nucl oti rs thuộc g n Lipoprot in lipas người Việt Nam ’… ↓ TT… ’ ’…TT ↑ … iểm tra s n ph m cắt tr n trang mạng [22 v i nzym Hin ể x c ịnh s n ph m sau ủ nzym s n ph m PCR ủ v i enzyme HindIII ph t oC c Điện i i tra sản ph sau hi n Điện di kiểm tra s n ph m sau ủ v i nzym tr n thạch , , ùng ệm TBE 0,5X, nhu m R Sa , sử ụng thang chu n D iểm tra s n ph m sau iện i tr n m y l oc Đ nh gi k t qu kiểu g n ng kích thư c c c ăng iện i thu c tr n h nh nh iện i * P p áp Phương ph p gi i tr nh tự g n ùng ể kiểm tra k t qu x c ịnh kiểu gen b ng phương ph p P R-R P S n ph m P R c tinh m t số m u tương ứng v i kiểu g n TT, T , gửi c ng ti arog n, Hàn Quốc làm gi i tr nh tự g n t qu gi i tr nh tự c so s nh v i k t qu phân tích kiểu g n phương ph p P R-RFLP 2.2 Kết bàn luận 22 ả iểm tra mồi tr n trang mạng Blast prim r 20 Prim r w 21 cho s n ph m c kích thư c p Sau c ti n hành ph n ứng P R ể x c ịnh nhiệt cặp tối ưu Thành phần ph n ứng P R , µ nư c tinh sạch; 6,0 µL master mix GoTaq Green PCR; 0,75 pmol mồi loại nồng pmol µl) µ D nồng ng µl) tổng thể tích 12 µL hu tr nh ph n ứng giai oạn i n tính nhiệt 94 oC phút; ti p theo 32 chu kì o 94 giây giai oạn cặp giây c thực nhiệt khác nhau: 56 oC¸ 57 oC, 58 oC, 59 o giai oạn kéo dài 72 o giây, giai oạn ủ nhiệt 72 oC phút Hình Hình đ ện di s n phẩm PCR s mẫu nghiên c u 125 P.T.B Đào, D.T Linh, B.T.T Nga, N.A Ngọc, T.Q Thuyên, T.T.L Anh, P.T Hương T.Q Bình Hình Hình ảnh điện di sản ph m PCR c a mẫu nghiên c uở nhiệt độ bắt c p o 56 oC, 57 oC, 58 oC, 59 oC; gi ng 1, 2, 3: nhiệt độ bắt c p l C; gi ng 4, 5, 6: nhiệt độ bắt o o o c pl C; gi ng 8, 9, 10: nhiệt độ bắt c p l C; gi ng 11, 12, 13: nhiệt độ bắt c p l C; gi ng 14: mẫu ch ng â (nư c); gi ng 7: thang chu n D o Hình Hình ảnh điện i sản ph sau hi n c a ẫu C nhiệt độ C; i ng ẫu sản ph C sau hi n gi ng thang chu n D t qu iện di s n ph m PCR m u nghiên cứu nhiệt bắt cặp oC, 57 oC, 58 oC, 59 o c thể H nh cho thấy c nhiệt bắt cặp ều c c c ăng iện di s n o ph m P R, nhiệt ăng m r n t o s n ph m nhiệt cặp 57 oC ủ nzym HindIII ph t C Mỗi ph n ứng cắt enzyme chứa , µ nư c tinh sạch; 2,0 µL 10x NEBuffer; 0,15 µL Hin ơn vị) 5,0 µL s n ph m PCR S n ph m PCR sau ủ nzym c iện i thể H nh B cho thấy m u , c ăng p p, m u c ăng p p, p o hư v y nhiệt nhiệt cặp tối ưu quy tr nh x c ịnh g n a h nh rs320 ng nzym Hin ủ ơn vị ph n ứng 2.2.2 Kết x ịnh kiểu gen Sau kh o s t nhiệt cặp nzym HindIII, ti n hành x c ịnh kiểu gen m t số m u nghiên cứu K t qu iện di s n ph m P R H nh ) sau cắt b ng enzyme gi i hạn HindIII H nh B) m t số m u nghiên cứu cho thấy tỉ lệ x c ịnh kiểu gen m u nghiên cứu ăn vào c c ăng s n ph m sau ủ v i enzyme gi i hạn ể x c ịnh kiểu gen Các m u 3, 4, 9, 11, 13, 14, 15 mang kiểu gen TT Các m u 1, 5, 6, 7, 8, , c kiểu gen TG M u mang kiểu gen GG đ ện di s n phẩm PCR (A) sau cắt với enzyme giới hạn (B) s mẫu nghiên c u A: K t điện di 15 sản ph m PCR 355bp, gi ng - 10 - 16: mẫu nghiên c u, gi ng 9: thang chu n D gi ng Ch ng â ; B: K t điện di 15 sản ph m PCR sau v i enzyme HindIII, gi ng - 10 - 16: mẫu nghiên c u, gi ng 9: thang chu n D Hình Hình 126 Tối ưu qu trình phân tích đa hình đơn nucl oti rs thuộc g n Lipoprot in lipas người Việt Nam 2.2.3 Kiể r xác củ t số m u tương ứng v i kiểu g n , T , TT sau x c ịnh ng P R- R P c m gi i tr nh tự t qu H nh cho thấy vị trí S P rs vị trí nucl oti ) kiểu g n c iểu thị màu n H nh ), kiểu g n T c iểu thị màu n H nh B), kiểu g n TT c iểu thị màu H nh ) t qu cho thấy x c ịnh kiểu g n ng phương ph p P R-R P hoàn toàn trùng kh p v i k t qu gi i tr nh tự hư v y phương ph p x c ịnh kiểu g n ng phương ph p P R - RFLP nghiên cứu c kh o s t triển khai k thu t x c, kh ng y u cầu c c thi t ị tiền, kh ng y u cầu k thu t cao, thi t k dễ àng c thể áp dụng nhiều phòng thí nghiệm Việt Nam ể x c ịnh kiểu gen LPL rs320 người Việt Nam ế Hình i ug n ủ hình ẫ i ug nT ể hình C i u g n TT Kết luận Quy tr nh x c ịnh kiểu gen LPL rs320 b ng phương ph p P R-RFLP quần thể người Việt am c tối ưu gồm c sau: Bư c 1: ùng ph n ứng P R ể khu ch ại oạn g n chứa S P rs v i nhiệt bắt mồi 57 oC; Bư c iện i ể kiểm tra s n ph m P R Bư c 3: s n ph m P R c cắt b ng 127 P.T.B Đào, D.T Linh, B.T.T Nga, N.A Ngọc, T.Q Thuyên, T.T.L Anh, P.T Hương T.Q Bình enzyme gi i hạn HindIII v i ơn vị/ph n ứng; Bư c iện di s n ph m sau ủ nzym tr n thạch agaros , ph t 100 V Quy tr nh c thể p ụng ể x c ịnh tỉ lệ kiểu g n phân tích mối li n quan gi a a h nh rs v i rối loạn lipi Lời c Nghiên cứu c tài tr Qu Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia OST D) ề tài mã số 106-YS.01-2015.10 T I LIỆU THA H O [1] B t , Hư ng ẫn v u tr ệnh nội ti t - chu n h a hà xuất n học, tr 255-275 [2] Weiss, L A., Pan, L., Abney, M., & Ober, 2006 The sex-specific genetic architecture of quantitative traits in humans Nature Genetics, 38, 2, 218 [3] Hernandez, M M., Williams, F M M., Potter, T., Valdes, A M., Spector, T., & Menni, 2017 Genetic and microbiome influence on lipid metabolism and dyslipidemia Physiological Genomics, 50, 2, 117-126 [4] Luo, H., Zhang, X., Shuai, P., Miao, Y., Ye, Z., & Lin, Y., 2017 Genetic variants influencing lipid levels and risk of dyslipidemia in Chinese population Journal of Genetics, 96, 6, 985-992 [5] Rojas, M P., Prieto, C., Bermúdez, V., Garicano, C., Nava, T N., Martínez, M S., & Martínez, N G., 2017 Dyslipidemia: Genetics, lipoprotein lipase and HindIII polymorphism F1000Research, 6, 2073 [6] Chamberlain, J C., Thorn, J A., Oka, K., Galton, D J., & Stocks, J., 1989 DNA polymorphisms at the lipoprotein lipase gene: associations in normal and hypertriglyceridaemic subjects Atherosclerosis, 79, 1, 85-91 [7] Mead, J R., Irvine, S A., & Ramji, D P., 2002 Lipoprotein lipase: structure, function, regulation, and role in disease Journal of molecular medicine, 80, 12, 753-769 [8] Holmes, R S., Vandeberg, J L., & Cox, L A., 2011 Comparative studies of vertebrate lipoprotein lipase: a key enzyme of very low density lipoprotein metabolism Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 6, 2, 224-234 [9] Ahn, Y I., Kamboh, M I., Hamman, R F., Cole, S A., & Ferrell, R E., 1993 Two DNA polymorphisms in the lipoprotein lipase gene and their associations with factors related to cardiovascular disease Journal of Lipid Research, 34, 3, 421-428 [10] Jemaa, R I A D H., Fumeron, F., Poirier, O., Lecerf, L., Evans, A., Arveiler, Fruchart, J C., 1995 Lipoprotein lipase gene polymorphisms: associations with myocardial infarction and lipoprotein levels, the ECTIM study Journal of Lipid Research, 36, 10, 2141-2146 [11] Peacock, R E., Hamsten, A., Nilsson-Ehle, P., & Humphries, S E., 1992 Associations between lipoprotein lipase gene polymorphisms and plasma correlations of lipids, lipoproteins and lipase activities in young myocardial infarction survivors and agematched healthy individuals from Sweden Atherosclerosis, 97, 2-3, 171-185 [12] Mattu, R K., Needham, E W., Morgan, R., Rees, A., Hackshaw, A K., Stocks, J., & Galton, D J., 1994 DNA variants at the LPL gene locus associate with angiographically defined severity of atherosclerosis and serum lipoprotein levels in a Welsh population Arteriosclerosis and thrombosis: Journal of Vascular Biology, 14, 7, 1090-1097 128 Tối ưu qu trình phân tích đa hình đơn nucl oti rs thuộc g n Lipoprot in lipas người Việt Nam [13] Thorn, J A., Chamberlain, J C., Alcolado, J C., Oka, K., Chan, L., Stocks, J., & Galton, D J., 1990 Lipoprotein and hepatic lipase gene variants in coronary atherosclerosis Atherosclerosis, 85, 1, 55-60 [14] Larson, I., Hoffmann, M M., Ordovas, J M., Schaefer, E J., März, W., & Kreuzer, J., 1999 The lipoprotein lipase HindIII polymorphism: association with total cholesterol and LDL-cholesterol, but not with HDL and triglycerides in 342 females Clinical Chemistry, 45, 7, 963-968 [15] Rasmussen, H B., 2012 Gel electrophoresis-principles and basics In Tech, 315-334 [16] Rahman, M T., Uddin, M S., Sultana, R., Moue, A., & Setu, M., 2013 Polymerase chain reaction (PCR): a short review J of Anwer Khan Modern Medical College, 4, 1, 30-36 [17] Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Phạm Trần Phương, Trần Quang Bình, 2016 Tối ưu ho quy tr nh x c ịnh kiểu gen a h nh PO rs trẻ em nam - 11 tuổi Hà N i Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Sư phạm Hà N i, 61, 4, 130-136 [18] Nguyễn Thị Trung Thu, Phạm Trần Phương, Trần Quang Bình, X c ịnh a hình rs10811661 gen CDKN2A quần thể người Việt Nam sử dụng phương ph p AS-PCR RFLP-PCR Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Sư phạm Hà N i, 62, 3, 114-120 [19] Pusapati Madan Ranjit, Girijasankar Guntuku, 2017 Association of Lipid Profile, Atherogenic Indices, and LPL HindIII Gene Polymorphism with Coronary Artery Disease Positive Subjects International Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 9, 1, 6-15 [20] Primer-blast https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/truy c p [21] Primer3web http://primer3.ut.ee/ truy c p [22] Restrictionmapper http://www.restrictionmapper.org/ truy c p ngày ABSTRACT The optimal protocol for analysis of single nucleotide polymorphism rs320 on Lipoprotein Lipase gene of Vietnamese populations Pham Thi Bich Dao1, Duong Tuan Linh2, Bui Thi Thuy Nga2, Nguyen Anh Ngoc2, Tran Quang Thuyen3, Tran Thi Lan Anh4, Phung Thanh Huong4, Tran Quang Binh2 Department of Biomedicine Hai Duong Central College of Pharmacy National Institute of Nutrition, 3Military Institute of Preventive Medicine Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy The rs320 polymorphism of LPL gene has been reported to be associated with triglycerides, total cholesterol, HDL-C, and LDL-C To analyze this polymorphism in Vienamese populations, the study aimed to optimize the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method with primers, thermal cycles, and restriction enzyme which were selected and tested to identify opimal condition of PCR-RFLP method The GG, TG, and TT genotypes by PCR - RFLP methods were confirmed by the sequencing method The experimental results determined the annealing temperature of 57 oC for PCR, the minimum units of HindIII for incubation with PCR product In conclusion, this optimal PCR-RFLP method can be applied to genotype LPLrs320 in large populations to investigate the association between the rs320 polymorphism and dyslipidemia Keywords: LPL gene, rs320, PCR - RFLP 129 ... - 16: mẫu nghiên c u, gi ng 9: thang chu n D Hình Hình 126 Tối ưu qu trình phân tích đa hình đơn nucl oti rs thuộc g n Lipoprot in lipas người Việt Nam 2.2.3 Kiể r xác củ t số m u tương ứng v... nghiệm Việt Nam ể x c ịnh kiểu gen LPL rs320 người Việt Nam ế Hình i ug n ủ hình ẫ i ug nT ể hình C i u g n TT Kết luận Quy tr nh x c ịnh kiểu gen LPL rs320 b ng phương ph p P R-RFLP quần thể người. .. gi i hạn Hin tham kh o 19 c tr nh tự vị trí cắt 124 Tối ưu qu trình phân tích đa hình đơn nucl oti rs thuộc g n Lipoprot in lipas người Việt Nam ’… ↓ TT… ’ ’…TT ↑ … iểm tra s n ph m cắt tr n trang