Trong nghiên cứu này, 82/265 chủng vi khuẩn lactic được xác định là sinh enzyme β -galactosidase bằng phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch có bổ sung X-gal. Trong đó, chủng RGH7.1, RGH6.1, RGH8.8 sinh enzyme β-galactosidase ngoại bào có hoạt độ cao nhất tương ứng là 685,95 U/L, 498,92 U/L và 492,23 U/L. β-galactosidase của ba chủng này đều có hoạt độ cao ở pH 2 và 3 với hoạt độ tương đối tương ứng dao động từ 74,32 - 83,16%, 86,49 - 93,24%.
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 Optimization of autolysis conditions for waste brewer’s yeast Nguyen Thi Thanh Thuy, Ho Tuan Anh Abstract Treated brewers’ yeast is optimized for the autolysis conditions followed the Box-Behnken design Derringer’s desirability function is used for optimization of output factors The results showed that the autolysis ability of waste beer yeast depended on various factors, but the most important ones were temperature, composting time and pH The combined factors had very little or insignificant impact on the result, except the interaction between pH and composting time caused reducing the dissolved substances Under the optimum condition the ratio of yeast: water at 1: 3, stirring speed at 30 rpm, temperature at 52ºC, pH at 5.8 and composting time in 22h, the percentage of protein conveted to free amino nitrogen, of the protein transformed to dissolved form, and of the dry matter transformed into extract were 41.3; 73.6 and 52.1%, respectively The desirability value for all three target function was 94.3%. Keywords: Waste beer yeast, optimization, autolysis, mathematical model, experimental design Ngày nhận bài: 5/7/2017 Ngày phản biện: 10/7/2017 Người phản biện: TS Nguyễn Xuân Cảnh Ngày duyệt đăng: 27/7/2017 TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME β - GALACTOSIDASE CHỊU AXIT (pH - 3) Nguyễn Hồng Anh1, Hồ Tuấn Anh2 TĨM TẮT Trong nghiên cứu này, 82/265 chủng vi khuẩn lactic xác định sinh enzyme β -galactosidase phương pháp nuôi cấy mơi trường thạch có bổ sung X-gal Trong đó, chủng RGH7.1, RGH6.1, RGH8.8 sinh enzyme β-galactosidase ngoại bào có hoạt độ cao tương ứng 685,95 U/L, 498,92 U/L 492,23 U/L β-galactosidase ba chủng có hoạt độ cao pH với hoạt độ tương đối tương ứng dao động từ 74,32 - 83,16%, 86,49 - 93,24% Hoạt độ β-galactosidase ba chủng 50% sau ủ pH 3, chủng RGH 7.1 có độ bền với pH pH tốt nhất, hoạt độ lại sau ủ tương ứng 50,01% 65,14% Kết nghiên cứu enzyme β-galactosidase ngoại bào từ chủng RGH 7.1 có tiềm lớn ứng dụng công nghiệp chế biến sữa không lactose, viên nang uống chứa enzyme β-galactosidase bền pH cho người khơng dung nạp lactose Từ khóa: Vi khuẩn lactic, β-galactosidase, bền pH I ĐẶT VẤN ĐỀ Enzyme β-galactosidase gọi lactase, enzyme xúc tác cho trình thủy phân lactose thành glucose galactose (Davail et al.,1994) Nhờ khả phân giải lactose mà β-galactosidase sử dụng nhiều công nghiệp sản xuất sản phẩm từ sữa để giảm hàm lượng lactose, thành phần sữa mà phần lớn người trưởng thành dung nạp đặc biệt số người lớn kể trẻ sơ sinh có dị ứng mạnh với đường lactose (Järvelä et al., 2009) β-galactosidase bổ sung vào trình sản xuất bơ sữa để tránh kết tinh lactose tăng độ sản phẩm, cải thiện chức sản phẩm từ sữa Ngoài ra, y dược chúng sử dụng hỗ trợ tiêu hóa cho người có khả hấp thụ lactose (Nakayama and Amachi, 1999) Khả chịu pH acid đóng vai trị quan trọng q trình thủy phân lactose sản phẩm chế biến sản phẩm sữa lên men β-galactosidase có khả hoạt động pH acid sản xuất sữa chua phomat làm tăng q trình acid hóa, làm giảm khả đơng đặc sữa chua tăng tốc độ phát triển cấu trúc hương vị cho phomat (Parmjit S Panesar et al., 2010) β-galactosidase tìm thấy động vật, thực vật, nấm men, nấm mốc vi khuẩn (Lê Xuân Phương, 2001) Trong đó, enzyme thu nhận từ vi khuẩn ưu việt vi khuẩn có sinh khối nhỏ, sinh sản nhanh, tỉ lệ enzyme tế bào lớn Mặt khác, môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy vi khuẩn lại rẻ tiền, dễ kiếm nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao tốn Khoa Cơng nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Trường Đại học Kinh tế Kỹ thuật Công nghiệp 79 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 (Ngô Xuân Mạnh ctv., 2005) Trong loài vi khuẩn nghiên cứu sản xuất β-galactosidase, vi khuẩn lactic quan tâm ngồi ưu điểm vi khuẩn lactic cịn có đặc tính cần thiết như: Là vi khuẩn an toàn thực phẩm; sử dụng thường xuyên thực phẩm người (sữa chua, dưa muối, ); dễ tìm kiếm so với nhiều lồi vi khuẩn khác; dễ dàng tìm β-galactosidase Cho đến nay, có số nghiên cứu enzyme β-galactosidase từ số vi khuẩn lactic (Splechtna et al., 2006; Hsu et al., 2005) Tuy nhiên, nghiên cứu enzyme β-galactosidase từ vi khuẩn lactic có hoạt tính cao bền pH axit thấp hạn chế Từ những sở trên, nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu tuyển chọn chủng lactic sinh enzyme β-galactosidase bền acid (pH 3), làm cơ sở cho ứng dụng vào việc chế biến sản phẩm từ sữa, viên nang enzyme uống cho người không dung nạp lactose II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Bộ sưu tập 265 chủng vi khuẩn lactic phân lập có ngân hàng chủng giống Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam sử dụng để tuyển chọn chủng sinh enzyme β-galactosidase có hoạt độ cao bền pH pH Các chủng có nguồn gốc từ sữa bò nhà máy sữa, sữa nguyên chất lên men, bắp cải muối chua, cải bẹ muối chua, ruột gà hồ, ruột gà ri, nước thải chuồng bò, ống nước thải nhà máy sữa, đất xung quanh chuồng bò vùng khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme β-galactosidase - Chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme β-galactosidase tuyển chọn phương pháp ni cấy mơi trường thạch MRS có bổ sung X-gal theo Toru Nakayama Teruo Amachi (1996) tóm tắt sau: Nguyên tắc: β-galactosidase thuỷ phân X-gal hình thành sản phẩm kết tủa màu xanh da trời kiểu indigo Vì vậy, vi khuẩn dương tính với enzyme tạo khuẩn lạc màu xanh nuôi cấy môi trường đĩa thạch bổ sung thị X-gal lactose - Xác định khả sinh enzyme β-galactosidase phương pháp cấy chấm điểm đĩa thạch Môi trường MRS hấp vơ trùng làm nguội, sau bổ sung 60 µl X-gal nồng độ 20 mg/ml 10 µl IPTG 0,1M đĩa, chang Đĩa cấy vi sinh 80 vật đưa vào tủ nuôi cấy nhiệt độ 37oC, điều kiện tối Kiểm tra kết sau 24 h, 48 h 72 h 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy chủng vi khuẩn lactic để thu enzyme β-galactosidase Chủng vi khuẩn lactic nuôi cấy mơi trường MRS lỏng có bổ sung lactose tiến hành theo phương pháp Nguyễn Lân Dũng cộng tác viên (1978) tóm tắt sau: Tiếp giống 1% từ ống nghiệm hoạt hóa vào bình tam giác chứa mơi trường MRS có bổ sung 1% đường lactose hấp khử trùng 121oC 15 phút nuôi cấy 37 oC, lắc 200 vòng/phút 24h Tiến hành li tâm 6000 vòng/phút 4oC 20 phút, gạn lấy phần dịch nổi, đặc 10 lần màng đặc có kích thước 10 kDa sử dụng dịch enzyme ngoại bào, phần sinh khối sử dụng để phá vỡ tế bào thu dịch enzyme nội bào mô tả Nguyen cộng tác viên (2012) Dịch enzyme nội bào ngoại bào bảo quản 4oC để xác định hoạt độ, ảnh hưởng pH đến hoạt độ độ bền enzyme 2.2.3 Xác định hoạt độ β-galactosidase ngoại bào nội bào Hoạt độ β-galactosidase xác định cách sử dụng o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (oNPG) làm chất mô tả Nguyen cộng tác viên (2006), mô tả sau: phản ứng enzyme - chất bắt đầu cách thêm 20 μL mẫu enzyme chuẩn bị mục 2.2.2 vào 480 μL 22 mM oNPG pha đệm 50 mM phosphate pH 6,5, sau ủ 10 phút 30oC, tốc độ lắc 600 vòng/phút Phản ứng dừng cách cho thêm 750 μl 0,4 M Na2CO3, o-nitrophenol (oNP) tạo xác định cách đo độ hấp thụ 420 nm Một đơn vị hoạt độ β-galactosidase định nghĩa lượng enzyme giải phóng μmol oNP / 1phút điều kiện phản ứng 2.2.4 Ảnh hưởng pH 2, pH đến hoạt độ độ bền enzyme β-galactosidase Ảnh hưởng pH 2, pH đến độ bền enzyme β-galactosidase xác định theo phương pháp Nguyen cộng tác viên (2012), sau: dịch enzyme β-galactosidase thô ủ đệm Britton robinson pH pH 3, nhiệt độ 30ºC Tại thời gian ủ khác nhau, enzyme lấy để xác định hoạt độ cịn lại (theo phương pháp mơ tả mục 2.2.3) Độ bền pH enzyme xác định cách so sánh % hoạt độ lại enzyme thời điểm đo với thời điểm bắt đầu ủ 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm tiến hành từ tháng 1/2017 - Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 tháng 5/2017 phịng thí nghiệm Trung tâm Khoa học công nghệ thực phẩm, Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết sàng lọc chủng lactic có khả sinh enzyme β-galactosidase Thực theo 2.2.1, chủng vi khuẩn lactic sử dụng để tuyển chọn chủng sinh enzyme β-galactosidase phương pháp ni cấy đĩa thạch có bổ sung X-gal Kết thể màu xanh đĩa thạch (minh họa hình 1) 82/265 chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme β-galactosidase (Bảng 1) Bảng Kết xác định khả sinh β-galactosidase chủng vi khuẩn lactic môi trường thạch bổ sung X-gal Tổng số Tổng số Kí Nguồn chủng vi chủng có khả STT hiệu phân lập khuẩn sinh βmẫu lactic galactosidase Sữa bò ST 26 nhà máy sữa Sữa nguyên SB 33 chất lên men Bắp cải muối BA 33 16 chua Cải bẹ muối BE 23 15 chua Ruột gà hồ RGH 29 Ruột gà ri RGD 20 Nước thải NT 39 chuồng bò Ống nước thải nhà máy ON 29 sữa Đất xung quanh Đ 33 chuồng bò Các chủng RGH 6.11, RGH7.1, RGH8.8, BE1.9, BE3.2, BA3.2, ON3 xuất màu xanh đậm sớm sau 24 nuôi cấy sử dụng để xác định hoạt tính enzyme β–galactosidase nội bào ngoại bào 3.2 Xác định hoạt độ enzyme β-galactosidase vi khuẩn lactic Kết xác định hoạt độ β-galactosidase chủng vi khuẩn lactic xuất màu xanh đậm sau 24 nuôi cấy thể bảng Bảng Hoạt độ β-galactosidase ngoại bào chủng vi khuẩn lactic Hoạt Hoạt độ độ Tổng Tên STT enzyme enzyme hoạt độ chủng ngoại bào nội bào (U/L) (U/L) (U/L) BE1,9 121,3 46,32 167,62 BE3.2 BA3.2 RGH6.11 RGH7.1 RGH8.8 ON3 75,9 170,7 498,92 685,95 492,23 50,43 18,69 36,42 23,56 34,85 45,89 17,06 94,59 207,12 522,48 720,80 538,12 67,49 Kết bảng cho thấy: Cả chủng có hoạt tính enzyme nội bào ngoại bào Tuy nhiên, hoạt tính enzyme ngoại bào cao nhiều lần so với nội bào, hoạt độ enzyme ngoại bào chủng RGH7.1, RGH6.11, RGH8.8 cao tương ứng 685,95 U/L, 498,92 U/L 492,23 U/L Kết tương đồng với kết Maurya Padalia., 2016, nghiên cứu sản xuất β-galactosidase ngoại bào từ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, hoạt độ enzyme 671 U/L Các chủng cịn lại có hoạt độ enzyme ngoại bào dao động khoảng từ 50,43 U/L - 170,7 U/L Hoạt độ enzyme nội bào thấp, từ 17,06 U/L - 46,32 U/L Các chủng RGH7.1, RGH6.11, RGH8.8 tuyển chọn để sử dụng cho nghiên cứu 3.3 Xác định ảnh hưởng pH tới hoạt độ, độ bền β-galactosidase từ chủng vi khuẩn lactic Hình Kết kiểm tra khả sinh enzyme β-galactosidase chủng vi khuẩn lactic RGH 7.1 mơi trường có chứa X-gal 3.3.1 Xác định ảnh hưởng pH 2, pH đến hoạt độ enzyme Các chủng RGH7.1, RGH6.11, RGH8.83 có hoạt độ enzyme cao dùng để xác định ảnh hưởng pH pH đến hoạt độ enzyme Kết thể bảng 81 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 7(80)/2017 Bảng Kết xác định ảnh hưởng pH 2, pH đến hoạt độ enzyme RGH6.11 RGH7.1 RGH8.8 100 pH pH=6,5 pH=2 498,92 376,7 pH=3 431,5 Hoạt độ tương đối (%) 100 Hoạt độ (U/L) 685,95 Hoạt độ tương đối (%) 100 74,32 91,31 Hoạt độ (U/L) 492,23 409,3 459 Hoạt độ tương đối (%) 100 83,16 93,24 75,5 86,49 509,80 626,34 Kết thể cho thấy ba chủng RGH6.1, RGH8.8, RGH7.1 có hoạt tính cao pH 2, pH với hoạt độ enzyme tương đối tương ứng dao động từ 74,32 - 83,16%, 86,49 - 93,24% Trong đó, chủng RGH8.8 có hoạt độ tương đối cao pH pH tương ứng 83,16% 93,24% 3.3.2 Xác định độ bền β-galactosidase pH 2, pH Các kết nghiên cứu độ bền pH pH enzyme β-galactosidase thể hình Phân tích giá trị đạt cho thấy, enzyme β-galactosidase chủng RGH6.11, RGH7.1, RGH.8.8 bền sau pH pH Sau đầu hoạt độ enzyme β-galactosidase pH pH cao tương ứng 78,84 - 84,21% 81,20 - 90,02% Sau hoạt độ tương đối enzyme pH pH lại tương ứng 52,32 - 62,26% 69,57 - 82,68% Sau hoạt độ tương đối enzyme pH pH giảm không nhiều so với thời điểm giờ, tương ứng 52,45 57,74% Sau hoạt độ tương đối enzyme pH pH lại tương ứng 50,12 - 54,16% 51,05 - 65,14% Theo công bố khoa học Bộ Y tế, khả tiêu hóa thức ăn dày từ đến Sau khoảng thời gian enzyme β-galactosidase chủng RGH7.1 trì hoạt độ 65,14%, pH 50,01% pH so với ban đầu Kết nghiên cứu sử dụng chủng vi khuẩn lactic RGH7.1 để nghiên cứu, sản xuất enzyme β-galactosidase, ứng dụng enzyme sản xuất thực phẩm không lactose 82 Hoạt độ tương đối (%) Tên chủng Hoạt độ/ Hoạt độ tương đối Hoạt độ (U/L) 120 RGH6.11 pH2 80 RGH6.11 pH3 RGH7.1 pH2 60 RGH7.1 pH3 RGH8.8 pH2 40 RGH8.8 pH3 20 0 Thời gian (h) Hình Độ bền enzyme β-galactosidase pH pH IV KẾT LUẬN Đã tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic RGH7.1 phân lập từ ruột gà hồ sinh enzyme β-galactosidase ngoại bào cao (685,95 U/L) Enzyme có hoạt độ cao bền pH pH 3, sau ủ pH pH hoạt độ tương đối enzyme lại tương ứng 50,01% 65,14% Kết enzyme beta-galactosidase từ chủng vi khuẩn Lactic RGH7.1 có tiềm ứng dụng chế biến sữa sản phẩm từ sữa, viên nang enzyme uống cho người không dung nạp lactose LỜI CẢM ƠN Nhóm tác giả xin trân trọng cảm ơn Dự án Việt Bỉ, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tài trợ kinh phí để thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, 1978 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập NXB Khoa học Kĩ thuật Hà Nội Ngô Xuân Mạnh, Võ Nhân Hậu, Nguyễn Thị Tú, 2005 Nghiên cứu điều kiện tối ưu cho việc thu nhận α-amylase chịu nhiệt từ vi khuẩn Bacillus lichenifomis Tạp chí Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp, 5(1): 412-416 Lê Xuân Phương, 2001 Vi sinh công nghiệp Nhà xuất Xây dựng Nakayama, T and T Amachi, 1999 Beta-galactosidase, Enzymology In Encyclopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation; Flickinger, M C., Drew, S W., Eds.; John Willey: New York: 1291-1305 Davail S., Feller G., Narinx E., Gerday C., 1994, Cold adaptation of proteins Purification, characterization, and sequence of the heat-labile subtilisin from the antarctic psychrophile Bacillus TA41 Biol Chem, 269 (26): 17448-17453 ... bò vùng khác 2. 2 Phương pháp nghiên cứu 2. 2.1 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme ? ?- galactosidase - Chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme ? ?- galactosidase tuyển chọn phương pháp... lọc chủng lactic có khả sinh enzyme ? ?- galactosidase Thực theo 2. 2.1, chủng vi khuẩn lactic sử dụng để tuyển chọn chủng sinh enzyme ? ?- galactosidase phương pháp ni cấy đĩa thạch có bổ sung X-gal... (minh họa hình 1) 82/ 265 chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme ? ?- galactosidase (Bảng 1) Bảng Kết xác định khả sinh ? ?- galactosidase chủng vi khuẩn lactic môi trường thạch bổ sung X-gal Tổng số Tổng