Luận văn thạc sĩ nghiên cứu hệ xúc tác sinh học để thủy phân polysaccharid thành oligo và saccharide

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU HỆ XÚC TÁC SINH HỌC ĐỂ THỦY PHÂN POLYSACCHARIDE THÀNH OLIGO- VÀ SACCHARIDE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU HỆ XÚC TÁC SINH HỌC ĐỂ THỦY PHÂN POLYSACCHARIDE THÀNH OLIGO- VÀ SACCHARIDE Chuyên ngành: Hóa lí thuyết hóa lí Mã số: 604431 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Vũ Ngọc Ban – Trƣờng ĐH KHTN, ĐHQGHN GS TSKH Trần Đình Toại – Viện Hóa học, Viện KH&CN VN Hà Nội – Năm 2011 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 11 CHƢƠNG - TỔNG QUAN 13 1.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose 13 1.1.1 Hệ Enzyme cellulase 14 1.1.2 Ức chế hệ enzyme cellulase 15 1.1.3 Cơ chế thủy phân cellulose hệ enzyme cellulase 15 1.1.4 Các yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới trình sinh trƣởng 16 vi sinh vật 1.1.4.1 Ảnh hƣởng pH tới trình phát triển vi vinh vật 16 1.1.4.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình sinh trƣởng vi sinh vật 19 Cấu trúc tính chất số thành phần có rơm rạ 21 1.2.1 Cellulose 21 1.2.2 Hemicellulose 24 1.2.3 Lignin 25 1.3 Vài nét nhiên liệu sinh học 26 1.3.1 Các hệ nhiên liệu sinh học 26 1.3.1.1 Nhiên liệu sinh học hệ I 26 1.3.1.2 Nhiên liệu sinh học hệ II 26 1.3.2 Tình hình sản xuất sử dụng nhiên liệu sinh học 28 1.3.2.1 Trên giới 28 1.3.2.2 Tại Việt Nam 29 1.4 Phƣơng pháp thủy phân cellulose lên men etanol 29 1.4.1 Thủy phân cellulose 29 1.4.2 Lên men etanol 30 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 1.4.3 “Lên men đồng thời” “Lên men nối tiếp” 32 1.4.4 Tiền xử lý nguyên liệu 33 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Nguyên vật liệu 34 2.1.1 Các chủng vi sinh vật để nghiên cứu 34 2.1.2 Các chế phẩm enzyme cellulase 34 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Phƣơng pháp xử lý nguyên liệu 35 2.2.1.1 Tách cellulose từ rơm rạ 35 2.2.1.2 Phƣơng pháp tiền xử lý 36 2.2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy vi sinh 36 2.2.2.1 Môi trƣờng để nuối cấy chủng vi sinh vật 36 2.2.2.2 Nuôi cấy chủng vi sinh vật 37 2.2.2.3 Thu dịch enzyme từ chủng vi sinh 38 2.2.3 Phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc 38 2.2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase 39 2.2.4.1 Đơn vị enzyme 39 2.2.4.2 Phƣơng pháp đục lỗ thạch 39 2.2.4.3 Xác định hoạt lực enzyme cellulase đƣợc tách chiết từ vi 40 sinh vật 2.2.5 Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào 40 2.2.5.1 Dùng máy so màu 40 2.2.5.2 Phƣơng pháp xác định ATP 40 2.2.6 Phƣơng pháp cố định enzyme cellulase từ tế bào vi sinh 41 2.2.7 Thủy phân cellulose enzyme 41 2.2.7.1 Thủy phân cellulose enzyme cellulase tự chƣa cố định 41 2.2.7.2 Thủy phân cellulose enzyme cellulase cố định PVA 41 2.2.8 Lên men đồng thời (SSF) 42 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 2.2.9 Phƣơng pháp xác định đƣờng glucose axit dinitro salicylic 42 (DNS) 2.2.10 Phƣơng pháp xác định etanol chuẩn độ với K2Cr2O7 44 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Nghiên cứu nguồn nguyên liệu để sản xuất etanol 45 3.2 Nghiên cứu tiền xử lý nguyên liệu 46 3.2.1 Hiệu thủy phân cellulose 46 3.2.1.1 Tách cellulose từ rơm, rạ 46 3.2.1.2 Định tính enzyme cellulase 47 3.2.1.3 So sánh hiệu việc dùng cellulose rơm cắt khúc để 47 thủy phân 3.2.2 Hiệu trình thủy phân rơm đƣợc xử lý học tiền 49 xử lý 3.2.2.1 Xử lý học tiền xử lý nguyên liệu 49 3.2.2.2 So sánh hiệu trình thủy phân rơm đƣợc xử lý 49 học tiền xử lý 3.2.3 So sánh hiệu thủy phân cellulose rơm tiền xử lý 51 3.3 Nghiên cứu lựa chọn chủng vi sinh để thuỷ phân polisaccharide 51 3.3.1 Khảo sát chủng vi sinh 51 3.3.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng pH nhiệt độ ảnh hƣởng tới 52 chủng vi sinh trình thủy phân nguyên liệu 3.3.1.2 Khảo sát khả thủy phâ chủng vi sinh 3.3.2 So sánh hiệu thủy phân chủng A Terreus với enzyme 54 58 Cellic HTech2 3.4 Nghiên cứu hiệu trình cố định enzyme cellulase 59 3.4.1 Cố định enzyme cellulase 59 3.4.2 Hiệu trình cố định enzyme cellulase 60 3.5 Khảo sát khả chuyển hóa sản phẩm trung gian thành nhiên liệu 61 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung sinh học chủng nấm men 3.5.1 Khảo sát chủng nấm men Việt Nam 61 3.5.2 Khảo sát chủng nấm men Nga 66 3.6 Nghiên cứu “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol 3.6.1 Kết lựa chọn chủng nấm men cho phƣơng pháp lên men đồng thời 69 69 70 3.6.2 “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol hệ II 70 3.6.2.1 Cố định nấm Saccharomyces cerevisiae T2 PVA 70 3.6.2.2 Tiến hành lên men 71 KẾT LUẬN 73 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate BSA Bovine serum albumine (Albumin huyết bò) CMC Carboxyl methyl cellulose DNS Axit dinitrosalicylic PVA Polyvinyl alcohol TCA Triclo axetic axit SSF Simultaneous saccharification and fermentation (Đồng thời đƣờng hóa lên men) OD Optical density (mật độ quang) YATP Hiệu suất tế bào theo ATP Y(p/s) Hiệu suất tế bào theo sản phẩm Y(x/s) Hiệu suất tế bào theo chất g/l gam/lít C Nồng độ V Thể tích MT Mơi trƣờng Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Vi sinh vật phân huỷ cellulose (nuôi cấy đƣợc) 13 Bảng 1.2 Giá trị pH phát triển số vi sinh vật 17 Bảng 1.3 Nhiệt độ (°C ) phát triển số vi sinh vật 19 Bảng 1.4 Giá trị trung bình thành phần hóa học rơm rạ (%) 21 Bảng 1.5 Cellulose tinh khiết nguyên liệu 22 Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose 34 Bảng 2.2 Các chủng nấm men cho lên men etanol 34 Bảng 2.3 Mật độ quang dãy dung dịch chuẩn glucose 43 Bảng 3.1 Thành phần hóa học rơm, rạ số giống lúa gieo trồng 45 tỉnh phía Bắc, Bắc Trung Bộ Bảng 3.2 Thành phần hóa học rơm Rạ số giống lúa gieo trồng 46 tỉnh phía Bắc Trung Bảng 3.3 Kích thƣớc vịng phân giải cellulose đĩa thạch 47 Bảng 3.4 Sự biến đổi nồng độ glucose (mg/ml) trình thủy phân 48 cellulose rơm cắt khúc Bảng 3.5 Sự biến đổi hàm lƣợng Gc ,Go, Gh 50 Bảng 3.6 Ảnh hƣởng pH tới trình thuỷ phân nguyên liệu 52 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình thuỷ phân nguyên liệu 53 Bảng 3.8 Sự biến đổi nồng độ cellulose glucose 54 theo thời gian chủng vi sinh Bảng 3.9 Tổng hợp tạo thành glucose 57 trình thủy phân cellulose chủng vi sinh Bảng 3.10 Sự biến đổi nồng độ glucose trình thủy phân cellulose 60 tế bào chƣa cố định cố định enzyme Cellic HTech2 Bảng 3.11 Các chủng nấm men đƣợc lựa chọn để nghiên cứu 62 Bảng 3.12 Các thông số động học trình lên men etanol 62 chủng Việt Nam Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung Bảng 3.13 Một số thông số động học trình lên men 65 Bảng 3.14 Các chủng nấm men Nga đƣợc lựa chọn để nghiên cứu 66 Bảng 3.15 Các thông số động học trình lên men etanol 66 chủng Nga Bảng 3.16 Một số thông số động học trình lên men (bởi chủng 69 Nga) Bảng 3.17 Kết chuyển hóa dịch thủy phân rơm thành etanol sử 70 dụng tế bào nấm men cố định 37ºС 45ºС Bảng 3.18 Nồng độ etanol trình lên men etanol nấm Saccharomyces cerevisiae T2, Candida sp 71 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Giả thiết chế thủy phân cellulose 16 Hình 1.2 Ảnh hƣởng pH chủng vi sinh có pH tối ƣu cho 18 phát triển 6,2 Hình 1.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới tốc độ sinh trƣởng tƣơng đối (%) 20 chủng vi sinh có nhiệt độ phát triển tối ƣu 45-47 0C Hình 1.4 Cấu trúc khơng đồng phân tử cellulose 23 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử hemicellulose 25 Hình 1.6 Giả thiết cấu trúc lignin 26 Hình 1.7 Xu hƣớng sản xuất nhiên liệu sinh học giới 28 Hình 1.8 Sự biến đổi thành phần trình lên men etanol 32 Hình 2.1 Phƣơng pháp đếm số lƣợng khuẩn lạc 38 Hình 2.2 Lên men đồng thời điều kiện yếm khí 42 Hình 2.3 Đồ thị đƣờng chuẩn glucose theo phƣơng pháp DNS 43 Hình 2.4 Sự thay đổi màu trình chuẩn độ xác định etanol 44 Hình 3.1 Cellulose tách từ rơm rạ 46 Hình 3.2 Hiệu thủy phân cellulose 48 Hình 3.3 Mẫu rơm đƣợc xử lý học 49 Hình 3.4 Mẫu rơm đƣợc tiền xử lý 80оС, рН = 12, 49 Hình 3.5 Sự biến đổi hàm lƣợng Gc ,Go, Gh 50 Hình 3.6 So sánh hiệu thủy phân cellulose rơm tiền xử lý 51 Hình 3.7 Ảnh hƣởng pH tới trình thuỷ phân nguyên liệu 53 Hình 3.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới trình thuỷ phân nguyên liệu 54 Hình 3.9 Sự biến đổi nồng độ cellulose glucose theo thời gian 57 chủng vi sinh Hình 3.10 Sự biến đổi nồng độ glucose trình thủy phân cellulose chủng vi sinh 58 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung Bảng 3.13 Một số thơng số động học q trình lên men (thứ tự chủng nấm men đƣợc xếp theo thứ tự bảng 3.15) TT Thông số động học lên men Nồng độ etanol cực đại, g/l Hiệu suất etanol (% so với lý thuyết) Hiệu suất tế bào theo ATP, (YATP)x (x 10-8 mol/g protein) Các chủng nấm men 85,6 91,2 87,1 81,7 84,5 90,5 86,0 81,3 2,73 2,79 2,84 2,46 Hiệu suất tế bào theo ATP (YATP) đại lƣợng biểu thị khối lƣợng tế bào đƣợc tạo thành vi sinh vật sử dụng mol ATP để lấy lƣợng cho q trình tích luỹ polyphosphat Cần nhấn mạnh rằng, nồng độ АТP tế bào chứng tỏ khả sống tế bào Các kết khảo sát nồng độ ATP tế bào nấm đƣợc trình bày dịng bảng 3.17 Từ bảng 3.12, 3.13 hình 3.14 nhận thấy, số chủng nấm men đƣợc khảo sát cho thấy, chủng Candida sp chủng Saccharomyces cerevisiae T2 thích hợp với điều kiện nóng ẩm Việt Nam Thông số động học lên men quan trọng “Nồng độ etanol cực đại (g/l)” chủng đạt giá trị cao 91,2 87,1 g/l; hiệu suất tế bào theo ATP (YATP ) đạt 2,79 2,84 x 108 (mol/g protein) Nhƣ vậy, sử dụng cách hiệu chủng Candida sp chủng Saccharomyces cerevisiae T2 cho lên men etanol Việt Nam 66 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 3.5.2 Khảo sát chủng nấm men Nga Bảng 3.14 Các chủng nấm men Nga đƣợc lựa chọn để nghiên cứu TT Chủng nấm men Klyuveromyces marxianus Viết tắt K.m Xuất sứ Nga Candida sp C sp Viện Vi sinh vật ĐHQG Saccharomyces cerevisiae Т2 Sc T2 Nga Saccharomyces cerevisiae V 7028 S V7028 Nga Kết khảo sát đƣợc ghi bảng 3.15, Ký hiệu thông số: - Glucose, g/l - Mật độ tế bào x lần, g/l - Etanol, g/l Bảng 3.15 Các thông số động học trình lên men etanol chủng Nga Chủng Thời gian, vi sinh Thông số K.m C sp S T2 S V7028 12 24 36 48 60 72 200 198 196 160 80 41 26 18 15 2 21 49 78 86.5 87 11 23 30 33 34 34 35 200 198 195 160 80 41 25 15 10 2 22 52 80 92 93 11 23 30 33 34 34 35 200 199 197 160 80 41 26 20 17 2 22 51 79 88 89 21 30 32 33 33 33.5 200 198 195 160 80 45 27 17 10 2 22 52 78 87 88 11 23 30 33 34 34 35 67 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung Cũng từ kết bảng cho phép xây dựng biểu đồ q Thơng số động học, g/l trình lên men 250 Kluyveromyces marxianus 200 150 100 50 0 20 40 60 80 Thông số động học, g/l Thời gian, 250 Candida sp 200 150 100 50 0 20 40 60 80 Thời gian, 68 Nguyễn Thị Hồng Nhung Thông số động học, g/l Luận văn thạc sĩ 250 Saccharomyces cervisiae T2 200 150 100 50 0 20 40 60 80 Thông số động học, g/l Thời gian, 250 Saccharomces cerevisiae V7028 200 150 100 50 0 20 40 60 80 Thời gian, Hình 3.15 Sự biến đổi thơng số động học trình lên men etanol chủng Nga 69 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung Từ kết bảng 3.15 cho phép tính tốn thơng số dƣới đây: Bảng 3.16 Một số thơng số động học q trình lên men (thứ tự chủng nấm men đƣợc xếp theo thứ tự bảng 3.15) TT Thông số động học lên men Nồng độ etanol cực đại, g/L Hiệu suất etanol (% so với lý thuyết) Hiệu suất tế bào theo ATP, (YATP)x (x 10-8 mol/g protein) Các chủng nấm men 81,6 91,2 87,1 80,8 80,5 90,5 86,0 79,5 2,78 2,69 2,84 2,60 Bảng 3.16 cho thấy thông số động học lên men quan trọng “Nồng độ etanol cực đại (g/l)” chủng Candida sp đạt giá trị 91, g/l chủng Saccharomyces cerevisiae T2 đạt giá trị 87,1 g/l Từ kết khảo sát so sánh, lựa chọn chủng Candida sp (Việt Nam), Saccharomyces cerevisiae T2 (Nga) chủng có hiệu suất lên men etanol cao cho nghiên cứu 3.6 Nghiên cứu “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol 3.6.1 Kết lựa chọn chủng nấm men cho phương pháp lên men đồng thời Với mục đích lựa chọn chủng nấm men hoạt động có hiệu lực cao vùng nhiệt độ nhƣng tối ƣu cho giai đoạn “Đƣờng hóa” “Lên men etanol” cho mục đích lên men đồng thời, chúng tơi tiến hành lên men hai nhiệt độ 37ºС 45ºС 24 рН = 5,0 với nồng độ glucose ban đầu dịch thủy phân rơm enzyme 19,7 g/l Kết so sánh đƣợc ghi bảng 3.21 70 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung Bảng 3.17 Kết chuyển hóa dịch thủy phân rơm thành etanol sử dụng tế bào nấm men cố định 37ºС 45ºС Hiệu suất, % Etanol, g/l Các chủng nấm men cố định 37ºС 45ºС 37ºС 45ºС Candida sp 9,1 6,3 89,0 61,6 S cerevisiae V7028 8,9 5,9 87,04 57,7 S cerevisiae Т2 10,1 6,7 98,8 65,6 Klyuveromyces marxianus 8,0 1,8 78,3 17,6 Từ kết cho thấy, - Ở nhiệt độ thấp 37ºС, chủng nấm men chịu nhiệt (Candida sp Saccharomyces cerevisiae) ƣa ấm (Klyuveromyces marxianu) cố định PVA thể hoạt tính trao đổi chất cao gần tƣơng tự nhƣ Nồng độ etanol đạt 8,0- 10,1 g/l, có hiệu suất so với lý thuyết đạt 78-98 % - Ở nhiệt độ cao 45ºС, chủng nấm men chịu nhiệt thể hoạt tính trao đổi chất cao, đạt nồng độ etanol hiệu suất Candida sp (6,3g/l; 61,6%), Saccharomyces cerevisiae Т2 (6,7g/l; 65,6%) Trong đó, chủng ƣa ấm Klyuveromyces marxianus có hoạt tính trao đổi chất thấp, đạt nồng độ etanol 1,8 g/l hiệu suất 17,6 % Nhƣ vậy, chủng nấm men chịu nhiệt đáp ứng đƣợc yêu cầu nhiệt độ cao (45ºС) đảm bảo cho hai q trình “Đƣờng hóa” “Lên men ethanol” có hiệu Vì vậy, chúng tơi sử dụng hai chủng nấm men chịu nhiệt Candida sp Saccharomyces cerevisiae Т2 cho mục đích SSF 3.6.2 “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol hệ II 3.6.2.1 Cố định nấm Saccharomyces cerevisiae T2 PVA Trên sở lựa chọn đƣợc hai chủng nấm men chịu nhiệt Candida sp Saccharomyces cerevisiae Т2, tiến hành cố định loại nấm PVA theo phƣơng pháp nêu mục 2.2.5 Kết nhƣ hình 3.16 71 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung Hình 3.16 Hạt cố định nấm Saccharomyces cerevisiae T2 3.6.2.2 Tiến hành lên men Bố trí mẫu thí nghiệm: Mẫu 1: 5g rơm tiền xử lý +100 ml nƣớc cất Mẫu 2: 5g rơm tiền xử lý +100 ml nƣớc cất Chỉnh pH mẫu 5, khử trùng 30 phút; thêm vào mẫu 11,3g hạt cố định enzyme Htech 2, 11,3g hạt cố định (mẫu 1: Candida sp; mẫu 2: Saccharomyces cerevisiae T2); để mẫu thí nghiệm vào tủ ấm (37oC) 48 Hút mẫu để xác định hàm lƣợng etanol sau Kết biến đổi nồng độ etanol đƣợc ghi bảng 3.18, hình 3.17: Bảng 3.18 Nồng độ etanol trình lên men nấm Saccharomyces cerevisiae T2, Candida sp Thời gian, 16 24 32 40 48 E1 (g/l) 0.45 1.5 4.9 10.1 14.1 16.2 17.4 E2 (g/l) 0.2 0.9 4.3 8.91 13.1 14.89 15.9 72 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung Etanol, g/l 20 18 16 14 12 10 0 16 24 32 40 48 Thời gian, Hình 3.17 Sự biến đổi nồng độ etanol phƣơng pháp lên men đồng thời chủng Candida sp(1); Saccharomyces cerevisiae T2(2) Kết nghiên cứu cho thấy rằng, tạo chất xúc tác sinh học sở lựa chọn chủng nấm men chịu nhiệt Candida sp Saccharomyces cerevisiae Т2 cố định PVA cho mục đích lên men chuyển hóa rơm rạ thành nhiên liệu sinh học Chất xúc tác sinh học tạo đƣợc có hoạt tính cao 37ºС sử dụng đƣợc nhiều lần 73 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung KẾT LUẬN Sau trình thực đề tài luận văn, rút kết nhƣ sau: 1- Khảo sát thành phần rơm, rạ số tỉnh phía Bắc Bắc Trung cho thấy lƣợng chứa cellulose có giá trị từ 38 đến 43 % Nhƣ vậy, phế thải nơng nghiệp (rơm, rạ) Việt Nam nói chung nguyên liệu tốt cho sản xuất etanol sinh học 2- Kết nghiên cứu xử lý nguyên liệu trƣớc tiến hành thủy phân để lên men etanol: Thủy phân đƣờng hóa cellulose tách từ rơm, rạ cho hàm lƣợng glucose sinh sau 48 gấp khoảng 10 lần so với thủy phân đƣờng hóa nguyên liệu thơ có kích thƣớc từ cm đến cm Việc sử dụng nguyên liệu thủy phân cellulose tinh khiết tách từ rơm, rạ cho hàm lƣợng glucose cao nguyên liệu rơm tiền xử lý nhƣng khác biệt không nhiều Do vậy, xét mặt hiệu kinh tế ứng dụng vào quy mơ cơng nghiệp nên dùng rơm tiền xử lý làm để sản xuất etanol vừa giúp giảm chi phí, vừa rút ngắn thời gian xử lý nguyên liệu 3- Kết nghiên cứu sử dụng chủng vi sinh để thuỷ phân nguyên liệu cho thấy trình thuỷ phân cellulose thành glucose chủng vi sinh có pH tối ƣu nằm khoảng từ 4,5 đến 5,5 nhiệt độ tối ƣu nằm khoảng từ 37oC đến 45oC: Trong chủng vi sinh khảo sát, nấm A terreus có khả thủy phân polisaccharide thành glucose cao nhất, tiếp đến vi khuẩn C32, xạ khuẩn 7P, vi khuẩn T2, vi khuẩn C36 nhƣng khả thủy phân chủng vi sinh thấp enzyme Cellic HTech2 4- Quá trình cố định cellulase từ chủng vi sinh tạo chất xúc tác sinh học để thuỷ phân rơm, rạ thành sản phẩm trung gian hòa tan Đồng thời, cố định tế bào nấm men tạo đƣợc hạt xúc tác lên men chuyển hóa glucose thành etanol Hai loại hạt xúc tác sử dụng lại nhiều lần 74 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung trình thủy phân lên men etanol Điều mở khả ứng dụng xúc tác sản xuất công nghiệp 5- Từ kết khảo sát khả lên men etanol số chủng vi sinh Việt Nam Nga cho thấy sử dụng cách hiệu chủng Candida sp (Việt Nam) Saccharomyces cerevisiae V7028 (Nga) cho lên men etanol Các chủng thích hợp với điều kiện khí hậu nóng ẩm Việt Nam 6- Đã thử nghiệm phƣơng pháp len men đồng thời kết luận thực chuyển hóa trực tiếp nguyên liệu (rơm, rạ) thành etanol phƣơng pháp 75 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Nguyến ánh Tuyết (2005), Thí nghiệm vi sinh vật học- thí nghiệm công nghệ sinh học – T2, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr 194-210 Lê Xuân Phƣơng (2008), Thí nghiệm vi sinh vật, Giáo trình, Trƣờng ĐH Đà Nẵng Tiếng Anh Arnold L Demain, Michael Newcomb, and J H David Wu (2005), “Cellulase, Clostridia, and Ethanol”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 69(1), pp 124-154 Brylev N., Adylov D K., Tukhtaeva G G., Kamal'dinova N A., Abidova L D and Rakhimov D A (2001), “Polysaccharides of Rice Straw”, Chemistry of Natural Compounds, 37(6), pp 569-570 Hon D N S (2008), “Cellulose: Chemistry and Technology, Encyclopedia of Materials”, Science and Technology , pp 1039-1045 Juan Tian, Jianghua Wang, Shun Zhao, Caiyun Jiang, Xia Zhang and Xiaohong Wang (2010), “Hydrolysis of cellulose by the heteropoly acid H3PW12O40” Cellulose, 17(3), pp 587-594 Karla I Ziegelmann-Fjeld, Musa M Musa, Robert S Phillips, J Gregory Zeikus and Claire Vieille (2007), “A Thermoanaerobacter ethanolicus secondary alcohol dehydrogenase mutant derivative highly active and stereoselective on phenylacetone and benzylacetone”, Protein Engineering Design and Selection, 20(2), pp 47-55 Klyosov, A.A., Churilova, I.V (1980), “Hydrolysis of Microcrystalline Cellulose by Multienzyme Cellulase Complexes of Various Origin”, Биохимия, 45, pp 1685-1695 Klyosov, A.A., Grigorash, S.Yu (1981), “The Regularities of Glucose and Cellobiose Formation and the Action of ,Multienzyme Cellulase Systems on 76 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung Insoluble (Native) Cellulose The Enzymatic Hydrolysis of Cellulose”, Bioorgan Khimiya, 7, pp 1538-1552 10 Kublanov I.V., Prokofeva M.I., Kostrinkina N.A., Kolganova T.V., Tourova T.P., Wiegel J and “Thermoanaerobacterium Bonch-Osmolovskaya aciditolerans sp nov., E.A a (2007), moderate thermoacidophile from a Kamchatka hot spring”, Int J Syst Evol Microbiol, 57, pp 260-264 11 Lee, Y.-E., M K Jain, C Lee, S E Lowe, and J G Zeikus (1993), “Taxonomic distinction of saccharolytic thermophilic anaerobes: description of Thermoanaerobacterium xylanolyticum gen nov., sp nov., and Thermoanaerobacterium saccharolyticum gen nov., sp nov.; reclassification of Thermoanaerobium Clostridium brockii, Clostridium thermohydrosulfuricum E100-69 thermosulfurigenes, and as Thermoanaerobacter brockii comb nov., Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes comb nov., and Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus comb nov., respectively; and transfer of Clostridium thermohydrosulfuricum 39E to Thermoanaerobacter ethanolicus”, Int J Syst Bacteriol, 43, pp 41-51 12 Lichts F.O (2010), "Industry Statistics: 2010 World Fuel Ethanol Production", Renewable Fuels Association, http://www.ethanolrfa.org/pages/statistics#E Retrieved 2011-04-30 13 Meisenheimer P.L.; O’Brien M.A, Cali J J (2008), "Luminogenic enzyme substrates: The basis for a new paradigm in assay design." Promega Notes 100: 22–26 http://www.promega.com/pnotes/100/16620_22/16620_22.pdf 14 Miller G L (1959), “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”, Anal Chem., 3, pp.426-428 15 Nan-Qi Ren, Guang-Li Cao, Wan-Qian Guo, Ai-Jie Wang, Yu-Hong Zhu, Bingfeng Liu and Ji-Fei Xu (2010), “Biological hydrogen production from corn stover 77 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung by moderately thermophile Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum W16”, International Journal of Hydrogen Energy, 35(7), pp.2708-2712 16 Nidetzky B., Steiner W., Hayn M., and Claeyssens M (1994), “Cellulose hydrolysis by the cellulases from Trichoderma reesei: a new model for synergistic interaction”, Biochem J, 298(Pt 3), pp.705–710 17 Nishiyama, Yoshiharu, Langan, Paul, Chanzy, Henri (2002), "Crystal Structure and Hydrogen-Bonding System in Cellulose Iβ from Synchrotron X-ray and Neutron Fiber Diffraction", J Am Chem Soc, 124 (31), pp 9074–82 18 Nowlan B, Dodia MS, Singh SP, Patel BK (2006), "Bacillus okhensis sp nov., a halotolerant and alkalitolerant bacterium from an Indian saltpan" Int J Syst Evol Microbiol, 56 (5), 1073–7 19 Olofsson K, Rudolf A, Lidén G (2008), “Designing simultaneous saccharification and fermentation for improved xylose conversion by a recombinant strain of Saccharomyces cerevisiae”, J Biotechnol, 134(1-2), pp.112-20 20 Pessoa A J R., Mancilha I.M., Sato S (1997), "Acid Hydrolysis of hemicellulose from sugarcane bagasse”, Braz J Chem Eng., 14(3), São Paulo Sept 1997 21 Rajai H Atalla, Akira Isogai (2010), Celluloses, Comprehensive Natural Products II, Chapter 6.16, pp 493-539 22 Ralph, J et al (2001), "Elucidation of new structures in lignins of CAD- and COMT-deficient plants by NMR", Phytochem, 57 (6), pp 993–1003 23 Rose Marie Garay M., Mónica Rallo de la B., René Carmona C., y Jaime Araya C (2009), “Characterization of anatomical, chemical, and biodegradable properties of fibers from corn, wheat, and rice residues”, Chilean J Agric Res V.69, N.3, 406-415 24 Science Outreach Programme University of Canterbury (2007), Determination of ethanol by redox titration with potassium dichromate, University of Caterbury - Christchurch, New Zealand 78 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung 25 Sho Shindo, Yoko Sato, Susumu Hioki and Arata Ito (2007), “Simultaneous saccharification and bioethanol production from powder of Japanese cedar (Cryptomeria japonica)”, Journal of Biotechnology, V 131, Issue 2, Supplement 1, pp S23-S24 26 Sun J X and Sun R C (2004), “Isolation and characterization of cellulose from sugarcane bagasse”, Journal Polymer Degradation and Stability ,Volume 84, Issue 2, pp 331-339 27 Tabao, Nik Shawn C.; Monsalud, Rosario G (2010), “Screening and optimization of cellulase production of Bacillus strains isolated from Philipine mangroves”, Philippine Journal of Systematic Biology, Vol 4, pp.79-87 28 Tu M B, Zhang X, Paice M, McFarlane P, Saddler J N (2009), “Effect of surfactants on separate hydrolysis fermentation and simultaneous saccharification fermentation of pretreated lodgepole pine”, Biotechnol Prog, 25, pp.1122–1129 29 Vásquez Mariana P., Silva Juliana N.C., Souza Mauricio B., Pereira Nei (2007), “Enzymatic hydrolysis optimization to ethanol production by simultaneous saccharification and fermentation”, Applied Biochemistry and Biotechnology, vol 137-140, no 1-12, pp.141-153 30 Yiwei Huang, Gerhard Krauss, Sylvain Cottaz, Hugues Driguez and Georg Lipps (2005), “A highly acid-stable and thermostable endo-b-glucanase from the thermoacidophilic archaeon Sulfolobus solfataricus”, Biochem J , 385(Pt 2), pp.581–588 31 Yoshinori Murata, et al (2006), "Genome-wide expression analysis of yeast response during exposure to 4C," Extremophiles, 10, pp.117–128 32 Youping Zhou, Hilary Stuart-Williams, Graham D Farquhar, Charles H Hocart (2010), “The use of natural abundance stable isotopic ratios to indicate the 79 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung presence of oxygen-containing chemical linkages between cellulose and lignin in plant cell walls”, Phytochemistry, Volume 71, Issues 8-9, pp.982-993 33 Zsuzsa Benko, Alexandra Andersson, Zsolt Szengyel, Melinda Gaspar, Kati Reczey and Henrik Stalbrand (2007), “Heat extraction of corn fiber hemicellulose”, Applied Biochemistry and Biotechnology, Volume 137-140, Numbers 1-12 Tiếng Nga 34 Ефременко Е.Н., Степанов Н.А., Мартыненко Н.Н., Грачева И.М (2008), “Способ получения иммобилизованного биокатализатора и биокатализатор для производства спиртосодержащих напитков”, Патент РФ на изобретение, № 2322499 80 ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU HỆ XÚC TÁC SINH HỌC ĐỂ THỦY PHÂN POLYSACCHARIDE THÀNH OLIGO- VÀ SACCHARIDE Chun... Nam (rơm, rạ) để làm nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học Nghiên cứu trình tách cellulose từ rơm, rạ Lựa chọn nguồn vi sinh vật để lên men etanol Nghiên cứu hệ xúc tác sinh học dị thể... đƣờng sinh học dùng vi sinh vật, enzyme tự cố định 11 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Thị Hồng Nhung CHƢƠNG - TỔNG QUAN Trong khuôn khổ đề tài, nghiên cứu hệ xúc tác sinh học vi sinh vật polisaccharide