nghiên cứu hệ xúc tác sinh học để thủy phân polysaccharid thành oligo- và saccharide

2.2.9 Phương pháp xác định đường glucose bằng axit dinitro salicylic DNS 2.2.10 Phương pháp xác định etanol bằng chuẩn độ với K2Cr2O7 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu nguồn

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

1.1.3 Cơ chế thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase

1.1.4 Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng

của vi sinh vật

1.1.4.1 Ảnh hưởng của pH tới quá trình phát triển của vi vinh vật

1.1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật

1 2 Cấu trúc và tính chất của một số thành phần có trong rơm rạ

1.2.1 Cellulose

1.2.2 Hemicellulose

1.2.3 Lignin

1.3 Vài nét về nhiên liệu sinh học

1.3.1 Các thế hệ nhiên liệu sinh học

1.3.1.1 Nhiên liệu sinh học thế hệ I

1.3.1.2 Nhiên liệu sinh học thế hệ II

1.3.2 Tình hình sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học

1.3.2.1 Trên thế giới

1.3.2.2 Tại Việt Nam

1.4 Phương pháp thủy phân cellulose và lên men etanol

1.4.1 Thủy phân cellulose

1.4.2 Lên men etanol

1.4.3 “Lên men đồng thời” và “Lên men nối tiếp”

1.4.4 Tiền xử lý nguyên liệu

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Các chủng vi sinh vật để nghiên cứu

2.1.2 Các chế phẩm enzyme cellulase

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu

2.2.1.1 Tách cellulose từ rơm rạ

2.2.1.2 Phương pháp tiền xử lý

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh

2.2.2.1 Môi trường để nuối cấy các chủng vi sinh vật

2.2.2.2 Nuôi cấy các chủng vi sinh vật

2.2.2.3 Thu dịch enzyme từ các chủng vi sinh

2.2.5.1 Dùng máy so màu

2.2.5.2 Phương pháp xác định ATP

2.2.6 Phương pháp cố định enzyme cellulase từ tế bào vi sinh

2.2.7 Thủy phân cellulose bằng enzyme

2.2.7.1 Thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase tự do chưa cố định

2.2.7.2 Thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase cố định trên PVA

2.2.8 Lên men đồng thời (SSF)

2.2.9 Phương pháp xác định đường glucose bằng axit dinitro salicylic

(DNS)

2.2.10 Phương pháp xác định etanol bằng chuẩn độ với K2Cr2O7

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu nguồn nguyên liệu để sản xuất etanol

3.2 Nghiên cứu tiền xử lý nguyên liệu

3.2.1 Hiệu quả thủy phân cellulose

3.2.2.1 Xử lý cơ học và tiền xử lý nguyên liệu

3.2.2.2 So sánh hiệu quả của quá trình thủy phân rơm được xử lý cơ

học và tiền xử lý

3.2.3 So sánh hiệu quả thủy phân cellulose và rơm tiền xử lý

3.3 Nghiên cứu lựa chọn chủng vi sinh để thuỷ phân polisaccharide

3.3.1 Khảo sát 5 chủng vi sinh

3.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ ảnh hưởng tới các

chủng vi sinh trong quá trình thủy phân nguyên liệu 3.3.1.2 Khảo sát khả năng thủy phâ của 5 chủng vi sinh

3.3.2 So sánh hiệu quả thủy phân của chủng A Terreus với enzyme

Cellic HTech2 3.4 Nghiên cứu hiệu quả quá trình cố định enzyme cellulase

3.4.1 Cố định enzyme cellulase

3.4.2 Hiệu quả quá trình cố định enzyme cellulase

3.5 Khảo sát khả năng chuyển hóa các sản phẩm trung gian thành nhiên liệu

sinh học của các chủng nấm men

3.5.1 Khảo sát các chủng nấm men của Việt Nam

3.5.2 Khảo sát các chủng nấm men của Nga

3.6 Nghiên cứu “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol

3.6.1 Kết quả lựa chọn các chủng nấm men cho phương pháp lên men

đồng thời

3.6.2 “Lên men đồng thời” chuyển hóa rơm rạ thành etanol thế hệ II

3.6.2.1 Cố định nấm Saccharomyces cerevisiae T2 trên PVA

3.6.2.2 Tiến hành lên men

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Axit dinitrosalicylic Polyvinyl alcohol Triclo axetic axit Simultaneous saccharification and fermentation (Đồng thời đường hóa và lên men)

Optical density (mật độ quang) Hiệu suất tế bào theo ATP Hiệu suất tế bào theo sản phẩm Hiệu suất tế bào theo cơ chất gam/lít

Nồng độ Thể tích

Môi trường

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Vi sinh vật phân huỷ cellulose (nuôi cấy được) 13

Bảng 1.2 Giá trị pH đối với sự phát triển của một số vi sinh vật 17

Bảng 1.3 Nhiệt độ (°C ) phát triển của một số vi sinh vật 19

Bảng 1.4 Giá trị trung bình các thành phần hóa học của rơm rạ (%) 21

Bảng 1.5 Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu 22

Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose 34

Bảng 2.2 Các chủng nấm men cho lên men etanol 34

Bảng 2.3 Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose 43

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của rơm, rạ một số giống lúa gieo trồng

tại các tỉnh phía Bắc, Bắc Trung Bộ

45

Bảng 3.2 Thành phần hóa học của rơm Rạ một số giống lúa gieo trồng

tại các tỉnh phía Bắc Trung bộ

46

Bảng 3.3 Kích thước vòng phân giải cellulose trên đĩa thạch 47

Bảng 3.4 Sự biến đổi nồng độ glucose (mg/ml) trong quá trình thủy phân

của cellulose và rơm cắt khúc

48

Bảng 3.5 Sự biến đổi hàm lượng Gc ,Go, Gh 50

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của pH tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu 52

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu 53

Bảng 3.8 Sự biến đổi nồng độ cellulose và glucose

theo thời gian của 5 chủng vi sinh

54

Bảng 3.9 Tổng hợp sự tạo thành glucose

trong quá trình thủy phân cellulose bởi các chủng vi sinh

57

Bảng 3.10 Sự biến đổi nồng độ glucose trong quá trình thủy phân cellulose

bằng tế bào chưa cố định và cố định enzyme Cellic HTech2

60

Bảng 3.11 Các chủng nấm men được lựa chọn để nghiên cứu 62

Bảng 3.12 Các thông số động học của quá trình lên men etanol bởi các

chủng của Việt Nam

62

Bảng 3.13 Một số thông số động học trong quá trình lên men 65

Bảng 3.14 Các chủng nấm men của Nga đƣợc lựa chọn để nghiên cứu 66

Bảng 3.15 Các thông số động học của quá trình lên men etanol bởi các

Bảng 3.18 Nồng độ etanol trong quá trình lên men etanol bằng nấm

Saccharomyces cerevisiae T2, Candida sp

71

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Giả thiết cơ chế thủy phân cellulose 16

Hình 1.2 Ảnh hưởng của pH đối với chủng vi sinh có pH tối ưu cho sự

phát triển là 6,2

18

Hình 1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ sinh trưởng tương đối (%)

của chủng vi sinh có nhiệt độ phát triển tối ưu là 45-47 0C

20

Hình 1.4 Cấu trúc không đồng nhất của phân tử cellulose 23

Hình 1.6 Giả thiết cấu trúc của lignin 26

Hình 1.7 Xu hướng sản xuất nhiên liệu sinh học trên thế giới 28

Hình 1.8 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men etanol 32

Hình 2.1 Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc 38

Hình 2.2 Lên men đồng thời trong điều kiện yếm khí 42

Hình 2.3 Đồ thị đường chuẩn glucose theo phương pháp DNS 43

Hình 2.4 Sự thay đổi màu trong quá trình chuẩn độ xác định etanol 44

Hình 3.4 Mẫu rơm được tiền xử lý ở 80оС, рН = 12, trong 3 giờ 49

Hình 3.5 Sự biến đổi hàm lượng Gc ,Go, Gh 50

Hình 3.6 So sánh hiệu quả thủy phân cellulose và rơm tiền xử lý 51

Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu 53

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu 54

Hình 3.9 Sự biến đổi nồng độ cellulose và glucose theo thời gian của 5

Hình 3.11 Sự biến đổi nồng độ glucose khi thủy phân bằng enzyme Cellic

HTech2 và nấm A Terreus

59

Hình 3.12 Hạt cố định enzyme Cellic HTech2 59

Hình 3.13 So sánh biến đổi nồng độ glucose trong quá trình thủy phân

cellulose bằng tế bào chưa cố định và cố định của các chủng vi sinh

61

Hình 3.14 Sự biến đổi các thông số động học trong quá trình lên men

etanol bằng chủng của Việt Nam

64

Hình 3.15 Sự biến đổi các thông số động học trong quá trình lên men

etanol bằng chủng của Nga

68

Hình 3.16 Hạt cố định nấm Saccharomyces cerevisiae T2 71

Hình 3.17 Sự biến đổi nồng độ etanol bằng phương pháp lên men đồng

thời của 2 chủng Candida sp(1); Saccharomyces cerevisiae

T2(2)

72

MỞ ĐẦU

Theo dự báo, các nguồn năng lượng tiềm ẩn trên trái đất (dầu mỏ, khí, than

đá, uran) chỉ trong khoảng 100 năm tới sẽ cạn kiệt, con người có thể lâm vào tình

trạng khủng hoảng năng lượng Vì vậy, việc tìm kiếm các nguồn năng lượng thay thế

trở thành một trong những nhiệm vụ cấp bách nhất hiện nay của nhân loại, trong đó có

Việt Nam Nguồn năng lượng thay thế đang trở thành hiện thực chính là nhiên liệu sinh

học (diesel, xăng, gas sinh học) Trong xăng sinh học, etanol (thu được từ các quá trình

lên men các sản phẩm hữu cơ như tinh bột, cellulose) được sử dụng để pha trộn thay

cho phụ gia chì

Năm 2010, trên thế giới, tổng sản lượng etanol đạt hơn 19 tỷ US gallon

tương đương 76 tỷ lít Dự kiến, năm 2011 tổng sản lượng etanol đạt 23 tỷ US gallon

tương đương 87 tỷ lít Hiện nay ở Việt Nam, đã sản xuất Ethanol chừng 0,3 tỉ lít

Mục tiêu tới năm 2015 là 1,9 tỉ lít [12]

Nhưng cần chú ý rằng, các công ty nước ngoài chỉ đầu tư xây dựng các nhà

máy sản xuất etanol sinh học thế hệ I - etanol từ lương thực sắn, mía đường Như

vậy, chúng ta chỉ tiếp thu công nghệ đã lạc hậu trên thế giới Điều này không chỉ

làm Việt Nam lạc hậu về mặt khoa học công nghệ mà còn tác động xấu tới chiến

lược an ninh lương thực Quốc gia

Nước ta có diện tích đất cây trồng lúa hơn 8 triệu ha Trong những năm gần

đây, hàng năm, sản lượng nông nghiệp quy ra thóc đạt gần 40 triệu tấn Với sản

lượng lớn như vậy, phế thải nông nghiệp ước chừng hơn 80 - 100 triệu tấn Hiện

nay, phế thải nông nghiệp không chỉ làm ô nhiễm môi trường sinh thái mà còn làm

mất đi cảnh quan văn hoá đô thị và nông nghiệp nông thôn Song, phế thải nông

nghiệp thực sự là một nguồn tài nguyên có giá trị kinh tế vô cùng lớn

Sản xuất nhiên liệu sinh học từ phế thải nông nghiệp (rơm, rạ), trước hết góp

phần giải quyết vấn đề năng lượng, cũng là thúc đẩy phát triển sản xuất lương thực

(lúa) Đồng thời, sản xuất nhiên liệu sinh học từ phế thải còn có các ý nghĩa sau:

Tái sử dụng tài nguyên (là phế thải )

Xử lý ô nhiễm môi trường tại các vùng nông thôn

Để góp phần thực hiện “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015,

tầm nhìn đến năm 2025” theo quyết định số 177/2007/Qđ-TTg do Thủ tướng chính

phủ ký ngày 20 tháng 11 năm 2007, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu hệ xúc

tác sinh học để thủy phân polisacchride thành oligo- và saccharide” Đây là một

trong những cơ sở để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học (etanol thế hệ II) từ

phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) chứa cellulose, hemicellulose

Trong khuôn khổ của đề tài, chúng tôi nghiên cứu các nội dung sau:

1 Lựa chọn các loại phế thải nguồn gốc nông nghiệp của Việt Nam (rơm, rạ)

để làm nguồn nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học

2 Nghiên cứu quá trình tách cellulose từ rơm, rạ

3 Lựa chọn nguồn vi sinh vật để lên men etanol

4 Nghiên cứu hệ xúc tác sinh học dị thể dựa trên cơ sở các enzyme cellulase

vi sinh cố định

5 Nghiên cứu quá trình thuỷ phân cellulose để tạo thành các sản phẩm

trung gian

6 Nghiên cứu quá trình chuyển hoá (lên men) các sản phẩm trung gian

(hydrolizat) thành nhiên liệu sinh học bằng con đường sinh học dùng các vi sinh

vật, enzyme tự do và cố định

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

Trong khuôn khổ đề tài, chúng tôi nghiên cứu hệ xúc tác sinh học là các vi

sinh vật và polisaccharide là cellulose có trong rơm, rạ Để có cái nhìn khái quát,

chúng tôi xin giới thiệu tổng quan về vi sinh vật phân hủy cellulose; cấu trúc, tính

chất của một số thành phần có trong rơm rạ

1.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose [11]

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân huỷ bởi vi sinh vật cả trong điều

kiện hiếu khí và kị khí Các loài vi sinh vật có thể có tác động hiệp lực hoặc thay

phiên nhau phân huỷ cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Số lượng các

loài vi sinh vật tham gia phân huỷ cellulose rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ

khuẩn, vi khuẩn, thậm chí cả nấm men Hiện nay, người ta đã biết được một số vi

sinh vật có khả năng phân huỷ cellulose (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Vi sinh vật phân huỷ cellulose (nuôi cấy được)

Actinomyces diastaticus A oryzae B amylogenas

Actinomyces roseus A terreus B flavefacicus

Actinomyces thermofucus A syndovii B megaterium

Actinomyces diastaticus A flarus B menssenteroides

Str thermofuscus T viridae Clos Lochehesdii

Str thermonitrificans T lignorum Acetobacter xylinum

Str thermoviolaceus T hazianum Pseudomonas fluorescens Str thermovulgaris Pen Notatum Ruminococcus albus

Str violaceus Cephalosporium Bacteroides amylophilus

Thermomonospora curvata Neurospora amylophillus sp

Thermomonospora vulgaris AaBasii diomycetes Cellulosemonas

Fusarium culmorum

1.1.1 Hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose [3, 16]

Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose là do chúng có thể tiết ra các

enzyme tạo thành một hệ enzyme gọi là hệ cellulase Tuy nhiên, trong thiên nhiên

không có một vi sinh vật nào có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp tất cả các loại

enzyme có trong hệ cellulase

Các vi sinh vật này có khả năng sinh tổng hợp mạnh loại enzyme này, loài

khác lại tổng hợp mạnh loại enzyme khác Chính vì thế, sự phân hủy cellulose trong

điều kiện tự nhiên thường rất chậm và không triệt để Các enzyme hệ cellulase này

xúc tác quá trình thủy phân cắt ngắn mạch cellulose

Nhiều tác giả cho rằng hệ cellulase gồm các enzyme chính:

Endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), còn gọi là cellulase (Cx) Enzyme này tác

động thuỷ phân lên các liên kết phía trong mạch cellulose một cách tuỳ tiện làm

trương phồng cellulose, dẫn đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và tăng chậm các

nhóm khử Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động

yếu ở vùng tinh thể của cellulose

Exo - 1,4- gluconase (EC 3.2.1.91), còn gọi là cellobiohydrolase (C1)

Enzyme này giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose

Enzyme này tác động yếu lên vùng vô định hình ở phía bên trong của mạch, nhưng

tác động mạnh lên mạch bên ngoài của cellulose tinh thể hoặc cellulose đã bị phân

giải một phần Hai enzyme exo và endo- glucanase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu

quả rõ rệt

 - 1,6 - glucosidase (EC 3.2.1.21), còn gọi là cellobiase Enzyme này thuỷ

phân cellobiose và các cellodextrin hoà tan, chúng có hoạt tính thấp và giảm khi

chiều dài của mạch cellulose tăng lên Tuỳ theo vị trí mà  - glucosidase được coi là

nội bào, ngoại bào hoặc liên kết với thành tế bào Chức năng của  - glucosidase có

lẽ là điều chỉnh sự tích luỹ các chất cảm ứng của cellulase

1.1.2 Ức chế hệ enzyme cellulase

Các enzyme trong hệ cellulase hoạt động hiệp lực rất mạnh nên có thể thủy

phân cellulose tinh thể cho tới glucose Tuy vậy, có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới hoạt

tính của enzyme, như nhiệt độ và pH môi trường Các yếu tố này sẽ được phân tích

kỹ hơn trong các phần sau Ngoài các yếu tố đó, hoạt tính của enzyme còn bị nhiều

tác nhân khác ảnh hưởng tới Các tác nhân này có thể làm tăng hoạt tính của

enzyme gọi là các chất hoạt hóa Cũng có các tác nhân có tác động ngược lại, làm

giảm hoạt tính của enzyme gọi là các chất ức chế

Các chất ức chế hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose có thể có bản

chất vô cơ hoặc hữu cơ Có chất ức chế chính là hợp phần của nguyên liệu, cũng có

những chất từ bên ngoài môi trường tác động tới Xét về mặt tác động thuỷ phân

sinh khối (chứa cellulose, hemicellulose), chất ức chế là các thành phần tồn tại ngay

trong nguồn nguyên liệu cần được xem xét kỹ

Trong các thành phần hóa học của phế phẩm nông nghiệp (rơm, rạ),

hemicellulose chiếm tới ~25 %, lignin chiếm tới ~12 %, silic chiếm khoảng ~13 %,

cũng tương tự như vậy, có thể thấy các chất này xuất hiện trong vỏ trấu Nhiều công

trình nghiên cứu cho thấy rằng đây là các chất ức chế rất mạnh hoạt tính của các

enzyme hệ cellulase, đặc biệt ức chế làm giảm mạnh hoạt tính của các enzyme

exoglucanase và -glucosidase (những enzyme thủy phân cellulobiose thành

glucose)

1.1.3 Cơ chế thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase

Việc nghiên cứu cơ chế thủy phân cellulose được tác giả Klyosov [8,9] chú ý

từ sớm Sau này nhiều tác giả khác cũng chú ý tới vấn đề này Cơ chế thủy phân

cellulose được giả thiết có ít nhất hai bước:

Bước 1: Endoglucanase (ký hiệu C1) sẽ làm trương hoặc hydrat hóa các liên

kết trong mạch cellulose

Bước 2: Exoglucanase (ký hiệu Cx) và β - glucosidase (cellubiase) thủy phân

các liên kết mạch phía ngoài giải phóng glucose

Mô hình thủy phân cellulose

Mô hình thủy phân cellulose của Klyosov

Hình 1.1 Giả thiết cơ chế thủy phân cellulose

1.1.4 Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng quá trình sinh trưởng của vi sinh vật

1.1.4.1 Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh trưởng của VSV [18, 30, 31]

Phần lớn các vi sinh vật phát triển thuận lợi trong môi trường có pH trong

khoảng 5,5 - 7,5 Rất ít các vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH nhỏ hơn

4,0 hoặc cao hơn 9,0 Tuy vậy, vẫn tồn tại các vi sinh vật phát triển trong môi

trường nhỏ hơn 2,0 hoặc cao hơn 10,0 (Bảng 1.2)

Cellulose Endo - glucanase Cellobiohydrolase Cellobiase

Endo – glucanase + Cellobiohydrolase

Bảng 1.2 Giá trị pH đối với sự phát triển của một số vi sinh vật

8.0 - 9.0

Staphylococcus aureus growth

17

Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH thấp (tính axit cao)

gọi là “Ưa axit” (acidophile) Đối với các chủng quá ưa axit (extreme acidophile),

pH có thể thấp tới 4,2

Thí dụ: Chủng Trichoderma reesei có thể sinh ra hệ enzyme cellulase có hoạt

tính cao để thủy phân cellulose trong môi trường axit có pH = 4,8 Có chủng đặc

biệt như chủng ưa axit cổ đại (thermoacidophilic archaeon) Sulfolobus solfataricus

A chịu được axit rất cao pH = 1, 8 rất bền nhiệt, đồng thời sinh ra endo-β-glucanase

bền nhiệt và có hoạt tính cao Ở pH = 1,8 và 80 0C enzyme này chỉ mất 50 % hoạt

tính sau 8 giờ bảo quản

Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH trung tính (quanh

vùng 7) gọi là “Vừa phải”(obligate acidophile) Đối với chúng, cần môi trường có

nồng độ ion H+

để bảo đảm độ bền cho màng nguyên sinh chất

Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH cao (tính kiềm cao)

gọi là “Ưa kiềm” (alkaliphile) Đối với các chủng quá ưa kiềm (extreme

alkaliphile), có thể phát triển trong môi trường có pH cao tới 9,5 như các loài

Geoalkalibacter ferrihydriticus, Alkalibacterium iburiense, Bacillus okhensis

Đồ thị hoạt tính thủy phân cellulose của các chủng vi sinh phụ thuộc vào pH

thường có dạng quả chuông với cực đại ở pH tối ưu Vị trí cực đại đồ thị phụ thuộc

vào pH tối ưu của các chủng vi sinh

Đối với chủng vi sinh có pH tối ưu cho sự phát triển là 6,2 thì tốc độ sinh

trưởng tương đối (%) có thể thay đổi như đồ thị trên hình 1.2:

A, %

100-

80-

60-

Hình 1.2 Ảnh hưởng của pH đối với chủng vi sinh có pH tối ưu cho sự phát triển là 6,2

1.1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng của VSV [7, 10, 15, 31]

Dựa vào khả năng thích ứng với nhiệt độ, vi sinh vật có thể chia thành 3

nhóm với các nhiệt độ thích hợp:

1- Chịu lạnh (psychrophilic) ( 0  25oC) 2- Ưa ấm (mesophilic) (25oC  40oC) 3- Ưa nóng (thermophilic) (35oC  60oC)

Kết quả theo dõi nhiệt độ đối với sự phát triển của một số vi sinh vật được

ghi trong bảng 1.3:

Bảng 1.3 Nhiệt độ (°C ) phát triển của một số vi sinh vật

Hình 1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ sinh trưởng tương đối (%)

của chủng vi sinh có nhiệt độ phát triển tối ưu là 45-47 0C

Thí dụ: Đối với chủng vi sinh có nhiệt độ phát triển tối ưu là 45-47 0C, tốc độ

sinh trưởng tương đối (%) có thể thay đổi như đồ thị trên hình 1.3

Nhiều chủng nấm men là những chủng ưa nhiệt, như các chủng lên men

etanol, thí dụ chủng Thermoanaerobacter Ngoài ra, còn có chủng vi sinh vật

35 40 45 50 55 t0C

, % 100-

thích nghi với nhiệt độ ngoài vùng nhiệt độ của các chủng vi sinh vật thuộc 3

nhóm nêu trên

Các chủng thích nghi với nhiệt độ rất thấp dưới vùng nhiệt độ cho các chủng

vi sinh vật thuộc nhóm “Chịu lạnh” được gọi là “Quá ưa lạnh” (Extreme

psychophile hoặc psychotrophs hoặc Cryophile) Các chủng vi sinh vật này có thể

phát triển ở nhiệt độ rất thấp - 10 đến -15oC Chúng được tìm thấy ở những biển

băng giá thuộc 2 cực của trái đất như Arthrobacter sp., Psychrobacter sp., và các

thành viên của giống Halomonas, Pseudomonas, Hyphomonas, Sphingomonas.

Các chủng thích nghi phát triển ở nhiệt độ rất cao, cao hơn cả nhiệt độ phát

triển cho các chủng thuộc nhóm “Ưa nóng”, có thể tới 70°C hoặc cao hơn nữa, gọi

là “Quá ưa nóng” (Extreme thermophiles) Một số chủng còn thích hợp với nhiệt độ 80°C - 105°C, được gọi là Hyperthermophiles Những chủng này được tìm thấy ở

các vùng cận núi lửa, suối nước nóng như ở công viên Yellowstone National Park

châu Phi hoặc vùng Kamchatka của Nga

1 2 Cấu trúc và tính chất của một số thành phần có trong rơm rạ

Thành phần của rơm rạ chứa chủ yếu là cellulose, hemicellulose và số ít các

hợp phần khác (Bảng 1.4) [4]

Bảng 1.4 Giá trị trung bình các thành phần hóa học của rơm rạ (%)

Cellulose là thành phần cơ bản của vách tế bào thực vật và có lẽ là hợp chất

sinh học phong phú nhất trên trái đất, hàng năm được tạo thành với khối lượng lớn

đến mức vượt tất cả các sản phẩm tự nhiên khác Theo một số tác giả, sinh khối

Trong vách tế bào thực vật cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ với

các polysaccarit khác tạo thành những phức hợp bền vững Hàm lượng cellulose

trong xác thực vật thường thay đổi trong khoảng 50 - 80%, trong giấy là 61%,

trong trấu là 31%, bã mía là 46%, trong sợi bông hàm lượng này vượt trên 90%

(Bảng 1.5)

Bảng 1.5 Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu [5]

Cellulose có công thức (C6H10O5)n là polymer mạch thẳng của -D-glucose

với liên kết -(1 4) (gọi là polysaccharide), bao gồm 10.000 - 20.000 gốc

glucose, nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucosid Kiểu liên kết này đối lập với liên

kết α-1,4-glucosid có trong tinh bột, glycogen và các carbohydrate khác Cellobiose

là đơn vị cấu trúc lặp lại của cellulose gồm có 2 gốc glucose:

Cellulose Phân tử cellulose chứa 3 dạng anhydroglucose Dạng thứ nhất có đầu khử

với nhóm bán acetal tự do (hoặc aldehyde) ở C-1 Dạng thứ hai có đầu không khử

với nhóm hydroxyl tự do ở C-4 và dạng thứ 3 có vòng nối giữa C-1 và C-4 Không

giống nhƣ các alcohol đơn giản, phản ứng thủy phân cellulose bị kiểm soát nhiều

hơn bởi yếu tố không gian so với khả năng phản ứng theo tính chất vốn có của các

nhóm hydroxyl trong vòng anhydroglucose

Các nhóm hydroxyl của gốc glucose ở mạch này tạo liên kết hydro với

nguyên tử oxy của mạch khác giữ cho các mạch ở bên cạnh nhau một cách vững

chắc, hình thành nên các vi sợi (microfibril) với độ bền cao

Đặc điểm quan trọng và đặc trƣng của cellulose tự nhiên đó là cấu trúc

không đồng nhất, gồm hai vùng (Hình 1.4):

- Vùng cellulose có cấu trúc tinh thể có trật tự cao, rất bền vững với các tác

động bên ngoài

- Vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ do đó kém bền vững hơn

vùng tinh thể vùng vô định hình vùng tinh thể

Hình 1.4 Cấu trúc không đồng nhất của phân tử cellulose

Cellulose có cấu trúc tinh thể là cellulose chỉ tạo nên từ monomer glucose

Cellulose có cấu trúc tinh thể (cellulose microcrystalline) còn gọi là α cellulose

hoặc “cellulose thực” Khi cho tác động với dung dịch NaOH 17.5% ở 20°C,

cellulose tinh thể (α cellulose) có đặc trưng là không tan, phần tan trong dung dịch

này là β cellulose và γ cellulose β cellulose kết tủa khi cho thêm axit, phần còn lại

không kết tủa với axit là γ cellulose β cellulose gọi là hemicellulose A (xylan), γ

cellulose gọi là hemicellulose B (arabinoxylan)

Tuy cellulose của bông có trật tự cao nhất nhưng trong cấu trúc, lượng đường

glusose chỉ đạt 90%, còn lại là các đường xylose, arabinose và rất ít rhamnose

Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn vùng tinh thể mạng

lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này

Trong tự nhiên, các chuỗi glucan của cellulose có cấu trúc dạng sợi Mỗi đơn

vị sợi nhỏ nhất có đường kính khoảng 3 nm Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có

đường kính 10 – 40 nm, dài 100-40000 nm và bao gồm đến 40 chuỗi cellulose

Những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học

Toàn bộ bó sợi có một lớp vỏ Hemicellulose và lignin rắn chắc bao bọc bên ngoài

làm cho sự xâm nhập của enzyme vào cấu trúc bên trong hết sức khó khăn Điều

này làm tăng thêm độ bền vững của cellulose nói chung

Cellulose tinh thể là hợp chất bền vững Nếu như đun ở 60-70 0C, tinh bột đã

từ trạng thái tinh thể chuyển sang vô định hình thì đối với cellulose ở 320 0C mới

xảy ra chuyển trạng thái như vậy

Cellulose không tan trong nước, trong nhiều dung môi hữu cơ và các dung

dịch kiềm loãng Cellulose có thể bị phân hủy thành glucose khi đun nóng với axit

hoặc kiềm Liên kết glucosit không bền với axít Dưới tác dụng của axít, cellulose

tạo thành các sản phẩm thủy phân có độ bền cơ học kém hơn Cellulose khi bị thủy

phân hoàn toàn sẽ thu được sản phẩm cuối cùng là đường hòa tan D-glucose

1.2.2 Hemicellulose [17, 32]

Hemicellulose có mạch ngắn khoảng 500-3000 gốc đường đơn, là polyme có

mạch phân nhánh, cùng có mặt với cellulose trong thành tế bào thực vật Trong khi

cellulose có cấu trúc tinh thể bậc cao chặt chẽ rất khó bị thủy phân thì hemicellulose

có cấu trúc tùy tiện, dễ bị thủy phân bởi kiềm hoặc axít cũng như bởi các enzyme

hemicellulase để tạo thành glucose, và các đường khác như xylose, mannose,

galactose, rhamnose, arabinose

Hemicellulose bao gồm chủ yếu Xylan (gọi là Hemicellulose A) và

Arabinoxylan (gọi là Hemicellulose B) Xylan là polyme mạch thẳng của D-xylose

với liên kết -(1 4) Arabinoxylan gồm mạch chính là xylan gắn với mạch nhánh

là L-arabinofuranose bởi các liên kết (1→2) Như vậy, đơn vị thành phần tạo nên

cấu trúc Hemicellulose chính là D-xylose và một ít L-arabinofuranose (Hình 1.5)

Xylan – Hemicellulose A

Arabinoxylan Hemicellulose B

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử hemicellulose

1.2.3 Lignin [22]

Lignin là một polymer dị thể, tạo nên bởi các monomer là p-coumaryl

alcohol, coriferyl alcohol, sinaryl alcohol, cùng có mặt với cellulose trong thành tế

bào thực vật, cùng với cellulose bao bọc xung quanh cellulose tạo thành những bó

sợi vững chắc

Lignin có thể bị thủy phân bởi các tác nhân hóa học hoặc bởi các enzyme

như manganese peroxidase, lignin peroxidase cellobiose dehydrogenase

Khi nhiệt phân, lignin cho sản phẩm là methoxy phenols và đặc biệt là các

guaiacol and syringol có tác dụng tạo mùi cho thực phẩm hun khói

Các monome này có các liên kết ngang với nhau tạo nên mạng lưới polyme - lignin

Hình 1.6 Giả thiết cấu trúc của lignin Mục đích của đề tài là thủy phân polysaccharide có trong rơm rạ đến sản

phẩm glucose, đồng thời lên men tạo etanol dùng làm nhiên liệu sinh học Do vậy,

trước khi trình bày về phương pháp thủy phân cellulose và lên men etanol, chúng

tôi xin giới thiệu một vài nét về nhiên liệu sinh học

1.3 Vài nét về nhiên liệu sinh học

1.3.1 Các thế hệ nhiên liệu sinh học và nguyên liệu chủ yếu để sản xuất

Etanol dùng làm nhiên liệu sinh học được chia làm 2 thế hệ:

1.3.1.1 Nhiên liệu sinh học thế hệ I [33]

Etanol dùng làm nhiên liệu sinh học thế hệ I được sản xuất từ lương thực như

ngô, sắn, mía đường Sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ I đang được thực hiện tại

các vùng khí hậu nóng ẩm như ở Brazil và một số nước khác dùng nguyên liệu mía

đường Ở Mỹ, nguyên liệu chủ yếu để sản xuất nhiên liệu sinh học là ngô, đường Ở

một số nước châu Á như Trung Quốc, Thái Lan dùng sắn Kê cũng hứa hẹn nhiều

triển vọng là nguyên liệu quan trọng để sản xuất etanol tại phía nam nước Mỹ

Tại các nước có khí hậu ôn hoà như châu Âu, nguyên liệu chủ yếu để sản

xuất nhiên liệu sinh học là củ cải đường, lúa mì, hạt cải dầu

1.3.1.2 Nhiên liệu sinh học thế hệ II [23, 28]

Etanol dùng làm nhiên liệu sinh học thế hệ II được sản xuất từ sinh khối thực

vật là các phế thải nông nghiệp (thân cây lúa, ngô, lúa mỳ, sắn) Lignocellulose là

thành phần chính cấu tạo nên sinh khối thực vật, chủ yếu bao gồm cellulose,

hemicellulose, lignin Nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ II từ sinh khối

được tiến hành từ cuối thế kỷ trước và được đẩy mạnh hơn trong thế kỷ này Một số

nước đang thực hiện như khu vực Đông Nam Á dùng nguyên liệu là dầu dừa, cây

sậy; Trung Quốc dùng cây lúa miến; Ấn Độ dùng cây gai dầu, cây chà mè; Nhật bản

sử dụng gỗ thông Cỏ lông, thân gỗ các loài thông cũng là loại sinh khối được chú ý

nhiều để lên men sản xuất etanol. Đặc biệt, ở Bắc Mỹ các loài thông Pinus contorta

mọc rất nhiều, có thể cao tới 50 mét, đường kính đạt 2 mét cho khối lượng gỗ lớn,

nên là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất etanol từ sinh khối

Ngoài ra, người ta còn cho rằng nhiên liệu sinh học thế hệ III được sản xuất

từ rong tảo, nhưng về bản chất nguồn nguyên liệu vẫn thuộc thế hệ II

Như vậy, nguyên liệu được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ I

là các polysaccharide được tạo bởi liên kết (1→4) -glucosid: Amylose,

amylopectin; nguyên liệu được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ II các

polysaccharide được tạo bởi liên kết  (1 4) - glucosid: Cellulose, hemicellulose

Với thành phần chính của rơm rạ đã nêu ở mục 1.2 và một vài số liệu về phế

phẩm nông nghiệp tại Ấn Độ và Việt Nam được nêu dưới đây, có thể thấy phế

phẩm nông nghiệp là một trong những nguồn nguyên liệu quan trọng để sản xuất

nhiên liệu sinh học thế hệ II

Năm 1977, tại Ấn Độ, với 38,6 triệu ha đất trồng lúa thu được 42,8 triệu tấn

lúa và 81 triệu tấn phế phẩm nông nghiệp, bao gồm 66 triệu tấn rơm, rạ, 15 triệu tấn

trấu (husks-vỏ hạt lúa), tại Việt Nam có 5 triệu ha đất trồng lúa thu hoạch 10 triệu

tấn lúa Ngày nay, nhờ có kỹ thuật canh tác tiên tiến, Ấn Độ đạt 141 triệu tấn lúa/

38,6 triệu ha đất trồng, Việt Nam đạt 35,5 triệu tấn lúa/ 7,3 triệu ha đất trồng Khối

lượng phụ phẩm nông nghiệp ước tính sẽ thu được khoảng 70 - 80 triệu tấn

1.3.2 Tình hình sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học [12]

1.3.2.1 Trên thế giới

Trên thế giới, chương trình sản xuất etanol làm nhiên liệu sinh học đang

được thực hiện mạnh mẽ Tổng sản lượng etanol từ những năm 2004 tới nay đều

vượt 10 tỷ US gallon (40 tỷ lít), trong đó các nước sản xuất nhiều là Mỹ, Brazil,

EU, Trung Quốc, Ấn Độ Năm 2010, tổng sản lượng etanol của thế giới đạt 22,95 tỷ

US gallon (86,9 tỷ lít), trong đó, Mỹ đạt 13,2 tỷ US gallon (50,0 tỷ lít), Brazil 6.92

tỷ US gallon (26,2 tỷ lít) Hai cường quốc này chiếm 88 % sản lượng etanol toàn thế

giới Dự kiến năm 2011 đạt 88,7 tỷ lít (Hình 1.7)

Hình 1.7 Xu hướng sản xuất nhiên liệu sinh học trên thế giới

Xu hướng sử dụng etanol làm nhiên liệu sinh học đang dần phát triển mạnh

trên thế giới Hiện nay, ở Brazil, etanol đã chiếm tới 30% nhiên liệu cho các động

cơ, có 33.000 trạm bán xăng pha ethanol; ở Mỹ có 1522 trạm và Thuỵ Điển (nước

có số bán xăng pha etanol cao nhất Châu Âu) có 792 trạm Nhiên liệu cho các xe ở

Brazil đều pha ít nhất là 25% etanol Phần lớn các xe ở Mỹ chạy bằng nhiên liệu

chứa 10% etanol (gọi là hỗn hợp etanol) Người ta đang nghiên cứu để nâng cao

hàm lượng etanol trong nhiên liệu Năm 2007, Portland, Oregon là hai thành phố

đầu tiên của Mỹ chỉ bán xăng pha ít nhất 10% etanol Đầu năm 2008, ba bang

Missouri, Minnesota, và Hawaii yêu cầu xăng phải pha etanol Nhu cầu sử dụng

bioetanol đang tăng dần ở châu Âu, nhất là ở Đức, Thuỵ Điển, Pháp, Tây Ban Nha

Trong năm 2006, các nhà sản xuất đã đáp ứng được 90% nhu cầu này

1.3.2.2 Tại Việt Nam

Ngày 20/11/2007, Thủ tướng Chính phủ đã ban hành Quyết định số

177/2007/QĐ-TTg phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học (NLSH) đến

năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” Đây là định hướng đúng đắn trong việc tìm

kiếm và sử dụng nguồn năng lượng sạch mới trong tương lai Hiện tại, ở nước ta đã

có một số nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học đặt tại các tỉnh Quảng Nam, Đồng

Nai, Đắk Nông, Phú Thọ, Quảng Ngãi, Bình Phước với nguyên liệu là sắn lát Dựa

trên cơ sở phân tích các mối quan hệ giữa nguyên liệu và quy luật thị trường cũng

như giá thành sản phẩm, nguyên liệu cho sản xuất etanol làm nhiên liệu sinh học

cần phải nhanh chóng chuyển hướng sang sử dụng biomass (các dạng cành cây,

mùn cưa, lá, rơm rạ…) Các loại hạt, củ, quả cho bột nên tập trung cho mục tiêu

lương thực

1 4 Phương pháp thủy phân cellulose và lên men etanol

1.4.1 Thủy phân cellulose [6, 8, 9]

Thủy phân cellulose để tạo nên các mảnh oligocellulose ngắn hơn và cho tới

glucose có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế vì việc sử dụng các cơ chất cellulose sau

thủy phân sẽ trở nên đơn giản và thuận lợi hơn rất nhiều Tuy nhiên, việc tìm ra

phương pháp thủy phân thích hợp và rẻ tiền là rất quan trọng vì tính chất phức tạp

và chi phí cao cho các cách xử lý cellulose đang là một trong những yếu tố cơ bản

đối với vấn đề khai thác cũng như sử dụng cellulose ở quy mô công nghiệp

Thủy phân cellulose có thể tiến hành bằng phương pháp hoá học hoặc bằng

phương pháp sinh học sử dụng enzyme

Phương pháp hoá học ít có hiệu quả đối với các phần cellulose có cấu trúc

tinh thể hoặc cấu trúc trật tự bậc cao với liên kết  (1-4), song lại thích hợp để phá

vỡ các phần lignin của cellulose Trong phương pháp hóa học, hóa chất thường

dùng là axit với nồng độ loãng, thí dụ H2SO4 5% hoặc hỗn hợp H2SO4 5%, HCl 5%

Để tránh bị phá hủy glucose (sản phẩm thủy phân), người ta còn dùng hỗn hợp dung

dịch HCl 0.5%, ZnCl2 (65% -74%) (pH 4,8; 100°C) Sau 4 giờ thủy phân, 80%

cellulose chuyển thành dextrin hòa tan

Phương pháp công nghệ sinh học sử dụng enzyme, vi sinh có phần ưu điểm

hơn Các liên kết  (1-4) của cellulose rất dễ bị phá vỡ bởi các vi sinh có chứa

enzyme cellulase, hemicellulase Phần amylopectin với liên kết  (1-6) có thể được

phá vỡ bằng các vi sinh có chứa  (1-6) glucosidase

Các thí nghiệm thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase thường được tiến

hành trong tủ ấm với các điều kiện tối ưu để enzyme có hoạt tính cao nhất (40-

45°C, pH = 4,0-4,5)

1.4.2 Lên men etanol [7, 15]

Từ lâu con người đã biết “Lên men” để tạo ra nhiều sản phẩm bao gồm thức

ăn, đồ uống, chất thơm, dược phẩm và hóa chất Ngày nay, người tà đã ứng dụng

“Lên men” để thu nhận nhiều sản phẩm đơn giản như ethanol từ các phế thải của

nông, lâm nghiệp v v

Lên men etanol là quá trình yếm khí khi không có ôxy tác động nhờ các vi

sinh vật chuyển hoá các loại nguyên liệu thành etanol Nguyên liệu sử dụng cho quá

trình lên men etanol có thể chia làm 3 loại: đường; tinh bột; sinh khối chứa

cellulose, hemi cellulose

Hiệu quả của quá trình lên men không những chỉ phụ thuộc vào bản chất của

các chủng vi sinh, mà còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường trong quá trình lên

men như nhiệt độ, pH, nồng độ dung dịch cơ chất v v

Đường có thể chuyển hóa trực tiếp thành etanol Tinh bột, sinh khối chứa

cellulose, hemi cellulose phải qua bước thủy phân chuyển hóa thành đường Ngay

sau khi tạo thành, đường được các enzyme vi sinh lên men chuyển hóa thành etanol

Như vậy, lên men etanol là quá trình nhờ các vi sinh vật tác động chuyển hoá

các đường như glucose, fructose, sucrose, xylose, arabinose, lactose, galactose,

mannose thành etanol Thực hiện lên men có thể là nấm men, nấm sợi, vi khuẩn,

xạ khuẩn

Nhiều chủng vi sinh có thể thực hiện lên men ethanol đã được nghiên cứu kỹ

và đã trở thành thương phẩm quen thuộc như Clostridium acetobutylicum, C

thermocellum, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus,

Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Granulobacter butylicus,

Granulobacter sarcharobutyricum, Kluyveromyces fragilis, Propionibacterium

acidipropionici, Saccharomyces sp (Saccharomyces cerevisiae; saccharomyces

uvarum), Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter brocki),

Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Saccharomyces cerevisiae hoặc

Zymomonas mobilis.

Các chủng vi sinh có thể thực hiện lên men ethanol có hiệu quả là những

chủng nấm men ưa nhiệt, hoạt động với nhiệt độ tối ưu 45-500C, thậm chí còn là các

chủng quá ưa nhiệt, hoạt động với nhiệt độ tới 80-900C như Thermoanaerobacter

thermohydrosulfuricus, Caldanaerobacter subterraneus subsp, Tengcongensis Các

chủng này đã được sử dụng trong công nghiệp để sản xuất etanol như Clostridium

uzonii, Thermoanaerobacterium aciditolerans

Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men etanol cùng với sự phát

triển của vi sinh vật được trình bày trên hình 1.8:

0 5 10 15 20 25

Hình 1.8 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men etanol

1- Glucose, 2- Ethanol; 3- Mật độ tế bào

1.4.3 “Lên men đồng thời” và “Lên men nối tiếp” [20, 29]

Sản xuất etanol từ sinh khối có thể thực hiện bằng phương pháp “Lên men

nối tiếp” (separate hydrolysis and fermentation – SHF) hoặc bằng phương pháp

“Lên men đồng thời” (simultaneous saccharification and fermentation - SSF) Trong

phương pháp “Lên men nối tiếp” hai giai đoạn thủy phân (đường hóa) và lên men

etanol được tiến hành nối tiếp nhau trong hai bình phản ứng riêng biệt (Thủy phân

có thể tiến hành trong bình thứ nhất Sản phẩm của giai đoạn này được chuyển sang

bình thứ hai để lên men) hoặc trong cùng một bình phản ứng (khi giai đoạn thủy

phân kết thúc thì bắt đầu giai đoạn lên men) Khi thực hiện phương pháp “Lên men

đồng thời” hai giai đoạn trên được tiến hành đồng thời trong cùng một bình phản

ứng (giai đoạn lên men được bắt đầu ngay sau khi sản phẩm của giai đoạn thủy

phân hình thành)

Một ưu điểm rõ nét nhất của phương pháp “Lên men đồng thời” là sản phẩm

của giai đoạn đầu (glucose sinh ra trong thủy phân nguyên liệu) không tích lũy nhiều

trong bình phản ứng, không gây nên hiện tượng ức chế giai đoạn sau (lên men etanol)

Nhưng để thực hiện “Lên men đồng thời” cần chú ý trong sản xuất etanol

làm nhiên liệu sinh học từ rơm, rạ, giai đoạn thủy phân có nhiệt độ tối ưu trong

khoảng 45- 50оC Như vậy, để sử dụng phương pháp này có hiệu quả, cần phải lựa

chọn các chủng vi sinh vật lên men hoạt động có hiệu lực cao tại nhiệt độ tối ưu cho

giai đoạn thủy phân Các chủng vi sinh vật đáp ứng được yêu cầu ấy thường là các

nấm men chịu nhiệt

1.4.4 Tiền xử lý nguyên liệu [29]

Quá trình sản xuất ethanol từ sinh khối gồm 2 giai đoạn Trong đó, giai đoạn

thủy phân nguyên liệu để thu dịch thủy phân chứa các oligosaccharide và các đường

tan là chìa khóa quyết định cho sự thành công của giai đọan lên men etanol

Glucose và các đường đơn khác sau khi được tạo thành ở giai đoạn thủy phân, sẽ

được chuyển hóa thành etanol

Để giai đoạn lên men có hiệu quả, cần tiền xử lý nguyên liệu nhằm tách và

loại bớt hemicellulose, lignin Điều này được giải thích bởi 2 nguyên nhân chính sau:

Một là, trong cellulose tinh thể, lượng đường glusose có thể đạt đến 90%, các

đường như xylose, arabinose, rhamnose còn lại không đáng kể Như vậy, sử dụng

nguyên liệu chứa chủ yếu cellulose sẽ thu được sản phẩm có hàm lượng glucose

cao Điều này có lợi cho giai đoạn lên men etanol từ glucose

Hai là, tách và chỉ sử dụng cellulose từ các thành phần hỗn hợp của nguyên

liệu là một bước làm sạch cellulose, loại bỏ các tạp chất hemicellulose, lignin, silic

và các dư lượng chất còn lại trong nguyên liệu Các tạp chất này là những chất ức

chế rất mạnh hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose

Lignin, hemicellulose có tác dụng làm giảm độ hấp phụ của enzyme cellulase

dẫn đến ức chế thủy phân cellulose Đã có nhiều nghiên cứu để loại bỏ lignin,

hemicellulose khỏi môi trường thủy phân cellulose Có thể kiềm hóa môi trường để

chuyển lignin, hemicellulose sang dạng tan, dùng axít loãng như sulfuric acid,

phosphoric acid, dùng hỗn hợp peroxide và acetic acid (peroxide−HAc) 69,1% ở

80°C trong 26,5 giờ để xử lý nguyên liệu hoặc dùng albumin huyết thanh bò (BSA)

bao bọc lignin để trả lại khả năng hấp phụ của cellulase Nhiều ion kim loại như

Ca(II) và Mg(II), có khả năng tạo phức với lignin cũng có thể được sử dụng để lôi

kéo lignin

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Các chủng vi sinh vật để nghiên cứu

Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose

1 Chủng vi khuẩn C32 Phân lập ở Hà Nội

2 Chủng Xạ khuẩn 7P Phân lập ở Hà Nội

3 Chủng nấm Aspergillus terreus Nga chuyển giao

4 Chủng Vi khuẩn T2 Từ rừng Cúc Phương

5 Chủng vi khuẩn C36 Phân lập ở Hà Nội

Bảng 2.2 Các chủng nấm men cho lên men etanol

Cellic HTech2: là chế phẩm enzyme thương mại của hãng Novozymes

Denmark chứa tổ hợp enzyme cellulase từ Bacillus subtilis đột biến dùng để thủy

phân chuyển hóa sinh khối chứa các polysaccharide cellulose, hemicellulose, lignin

thành đường tan

Chế phẩm enzyme thương mại “Cellic HTech2” hoạt động tối ưu ở pH =

5,0-5,5; nhiệt độ 45-500C

Novozymes 188: chế phẩm enzyme thương mại của hãng Novozymes-Firma,

Denmark, chứa tổ hợp enzyme cellulase từ Trichoderma reesei

Spezyme CP cellulase: chế phẩm của hãng Genencor (Canada), chứa tổ hợp

enzyme cellulose sinh ra trong lên men Trichoderma longibrachiatum (còn gọi

chung là Trichoderma reesei), trong đó đặc biệt là β-glucosidase có hoạt tính đủ

mạnh làm cho cellobiose không bị tích lũy lại trong “Lên men đồng thời” (SSF)

Spezyme CP còn chứa chất ức chế sự phát triển của Klebsiella oxytoca P2 là chủng

ức chế mạnh quá trình lên men etanol

Spezyme CP tác động phân hủy carbohydrate cellulose, hemicellulose, và

β-glucosidase, được sử dụng rộng rãi cho “Lên men đồng thời” (SSF) để chuyển hóa

cellulose thành etanol

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu

2.2.1.1 Tách cellulose từ rơm rạ (phương pháp Hypoclorit) [34]

Tách riêng cellulose từ nguyên liệu theo phương pháp sau:

Cân 10g rơm đã được nghiền nhỏ (cỡ 1,0 mm) cho vào cốc thủy tinh, cho

tiếp vào 500 ml nước cất và 50ml NaOH 10% và đặt cốc vào nồi đun cách thủy

trong 5 phút, sau đó lọc dung dịch bằng cách đổ lên một mảnh vải pôpơlin màu

trắng đặt trên miệng phễu Khi lọc xong, bột rơm được rửa bằng nước nhiều lần

Tiếp theo, bột rơm được chuyển từ mảnh vải vào trong cốc thủy tinh, cho nước cất

vào đến vạch 500ml, cho tiếp 50ml HCl 10% Hỗn hợp này được đun cách thủy 5

phút rồi lại lọc rửa như trên Tiếp theo, cho bột rơm đã rửa sạch vào cốc thủy tinh,

thêm nước cất đến vạch 500ml và thêm 5ml dung dịch NaClO Hỗn hợp này được

để ở chỗ tối trong 20 phút rồi lọc, rửa, chuyển vào cốc thủy tinh và được clo hóa lần

hai với NaClO trong 20 phút Tiếp đó rơm được lọc qua vải, rửa sạch rồi lại ngâm

trong 500ml H202 2%, rồi lại rửa nhiều lần Cuối cùng Cellulose còn lại sau khi đã

được rửa sạch, được chuyển vào cốc đã biết khối lượng và sấy đến khô ở 80oC

2.2.1.2 Phương pháp tiền xử lý rơm [30]

Xử lý cơ chất rơm với mục đích loại bớt hemicellulose và lignin được tiến

hành bằng cách nghiền nhỏ rơm rồi ngâm bằng dung dịch NaOH 10%, sau đó đun

cách thủy ở 50oC trong 24 giờ để loại bớt hemicellulose, lignin Tiếp đó rơm được

rửa nhiều lần với nước, cuối cùng dùng axit HCl 10% chỉnh pH của rơm đã được

tiền xử lý bằng 5 và sấy đến khô ở 80o

C trong 8 giờ

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh

2.2.2.1 Môi trường để nuôi cấy các chủng vi sinh vật

- Môi trường Crapeck để nuôi cấy nấm mốc

Các môi trường trên được khử trùng ở áp suất 1atm, trong 30 phút

2.2.2.2 Nuôi cấy các chủng vi sinh vật

- Nuôi cấy chủng nấm mốc

Cho 100ml môi trường nuôi cấy vào bình tam giác 250ml, khử trùng môi

trường ở áp suất 1atm trong 30 phút Sau khi khử trùng tiến hành cấy chủng nấm

mốc vào dịch môi trường Tiến hành lắc dịch nuôi cấy trong 48 giờ, ở nhiệt độ

370C với tốc độ khuấy 240 vòng/phút

- Nuôi cấy chủng vi khuẩn

Cho 150ml dịch môi trường MPA vào bình tam giác 250ml Khử trùng môi

trường ở áp suất 1atm trong 30 phút Sau khi khử trùng tiến hành cấy chủng vi

khuẩn vào dịch môi trường Lắc dịch nuôi cấy trong 48 giờ, tốc độ 240 vòng/phút

- Nuôi cấy chủng xạ khuẩn

Cho 150 ml dịch môi trường H1 vào bình tam giác 250ml Khử trùng môi

trường ở áp suất 1atm trong 30 phút Sau khi khử trùng tiến hành cấy chủng xạ

khuẩn vào dịch môi trường Lắc dịch nuôi cấy trong 96 giờ, tốc độ 240 vòng/phút

2.2.2.3 Thu dịch enzyme từ các chủng vi sinh

Lấy dịch sau khi nuôi cấy của các chủng vi sinh vật cho vào các ống nghiệm

mỗi ống 10ml, đem ly tâm 20 phút với tốc độ 5000 vòng/phút Sau khi ly tâm,

loại bỏ cặn được dịch enzyme trong suốt Dịch này được gọi là dịch giống

2.2.3 Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc [1]

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy Đưa môi trường vào các đĩa petri, để 1-2

ngày trong tủ ấm 30-350C cho khô bề mặt

- Chuẩn bị dung dịch pha loãng mẫu là nước muối sinh lý 0,85%; cho vào

các ống pha loãng và khử trùng ở 1 atm trong 30 phút

- Pha loãng mẫu theo tỉ lệ: 1,0 ml mẫu + 9,0ml dung dịch pha loãng => độ

pha loãng 10 lần

- Cấy 0,1- 0,3 ml mẫu vào đĩa petri có chứa môi trường nuôi cấy