2.2.4.1 Đơn vị enzyme
Một đơn vị enzyme (U) đƣợc xác định là lƣợng enzyme cần thiết để chuyển hóa 1 mol cơ chất trong 1 phút trong điều kiện 250C, pH tối ƣu (Định nghĩa này do International Union of Biochemistry xác lập năm 1964).
Hoạt độ enzyme cellulase đƣợc đánh giá theo lƣợng đƣờng khử (glucose) sinh ra trong phản ứng thủy phân cellulose mà chúng tham gia xúc tác. Cụ thể, hoạt độ enzyme đƣợc tính bằng hiệu số lƣợng đƣờng khử (tính theo glucose) giữa bình thí nghiệm và bình kiểm tra, từ đó tính ra đơn vị hoạt độ của 1ml dịch mơi trƣờng hoặc 1g chế phẩm.
2.2.4.2 Phương pháp đục lỗ thạch [2]
Phƣơng pháp này cho phép xác định hoạt tính của enzyme trong vi sinh vật. - Mơi trƣờng thử hoạt tính enzyme:
MT1: CMC 0,5% MT2: Bột rơm 0,5% MT3: Cellulose 0,5%
Hòa tan 0,25g cơ chất (CMC, bột rơm, cellulose) vào 500ml nƣớc cất. Chỉnh dung dịch về pH = 5 bằng HCl 0,1N. Bổ sung agar 1,5% đun cho tan hoàn tồn rồi phân phối dung dịch vào các bình tam giác, sau đó đem khử trùng các bình tam giác trong nồi hấp khử trùng ở 1atm trong 30 phút.
- Pha dung dịch lugol gồm: hòa tan 2,65g KI vào 100ml nƣớc cất rồi cho tiếp 0,05g I2, khuấy đều, lọc qua giấy lọc.
- Tiến hành: đổ lần lƣợt MT1, MT2, MT3 vào các đĩa petri với độ dày 1cm, sấy khô môi trƣờng trong box cấy. Sau đó đục lỗ thạch trên mỗi đĩa bằng que đục lỗ (đƣờng kính lỗ thạch d = 1,2cm). Tiếp tục nhỏ enzyme vào các lỗ thạch sao cho dung dịch không tràn qua miệng lỗ, gói đĩa petri bằng túi nilong và để vào tủ lạnh ở 8oC trong 24 giờ rồi lấy ra cho vào tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ. Cuối cùng, đổ dung dịch lugol, quan sát và đo kích thƣớc vịng phân giải.
- Đánh giá hoạt tính của enzyme: đo kích thƣớc vịng phân giải CMC, bột rơm, cellulose (D) rồi trừ đi kích thƣớc của khuẩn lạc (d). Hiệu số của vòng phân giải = D – d. Hiệu số đo đƣợc càng lớn thì chứng tỏ hoạt tính cellulase càng cao. Lƣu ý, D-d 2cm là hoạt tính enzyme mạnh, D-d 1cm là hoạt tính enzyme trung bình, D-d ≤ 1cm là hoạt tính enzyme yếu.
2.2.4.3 Xác định hoạt lực enzyme cellulase được tách chiết từ vi sinh vật
Vi sinh vật tiết ra các enzyme cellulase phân huỷ các thành phần hữu cơ trong phế thải nông nghiệp nên qua hoạt lực enzyme cellulase có thể đánh giá đƣợc khả năng phân hủy cellulose. Hệ enzyme cellulase của vi sinh vật xúc tác phân hủy (thủy phân) cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Vì vậy, để đánh giá khả năng phân hủy cellulose qua hoạt lực enzyme cellulase phải tiến hành nuôi cấy vi sinh vật để tách chiết và sau đó xác định hoạt tính enzyme qua phản ứng enzyme. Cụ thể:
- Exoglucanase thuỷ phân phần cellulose kết tinh. Cơ chất đƣợc sử dụng ở đây là Na- CM- cellulose.
- Endoglucanase thuỷ phân phần cellulose không kết tinh. Cơ chất đƣợc sử dụng ở đây là CMC.
Cách tiến hành: cho 3ml dung dịch có chứa 50mg cơ chất vào ống nghiệm, thêm 1ml dung dịch đệm axetat 0,5M, pH = 5 và 1ml dung dịch enzyme, nâng nhiệt
độ lên đến 500C và giữ trong một giờ. Lấy ra 1ml cho vào một ống nghiệm khơ và sạch, thêm ngay hóa chất TCA để dừng phản ứng enzyme và định lƣợng đƣờng khử.