Quá trình sản xuất ethanol từ sinh khối gồm 2 giai đoạn. Trong đó, giai đoạn thủy phân nguyên liệu để thu dịch thủy phân chứa các oligosaccharide và các đƣờng tan là chìa khóa quyết định cho sự thành công của giai đọan lên men etanol. Glucose và các đƣờng đơn khác sau khi đƣợc tạo thành ở giai đoạn thủy phân, sẽ đƣợc chuyển hóa thành etanol.
Để giai đoạn lên men có hiệu quả, cần tiền xử lý nguyên liệu nhằm tách và loại bớt hemicellulose, lignin. Điều này đƣợc giải thích bởi 2 nguyên nhân chính sau:
Một là, trong cellulose tinh thể, lƣợng đƣờng glusose có thể đạt đến 90%, các đƣờng nhƣ xylose, arabinose, rhamnose cịn lại khơng đáng kể. Nhƣ vậy, sử dụng nguyên liệu chứa chủ yếu cellulose sẽ thu đƣợc sản phẩm có hàm lƣợng glucose cao. Điều này có lợi cho giai đoạn lên men etanol từ glucose.
Hai là, tách và chỉ sử dụng cellulose từ các thành phần hỗn hợp của nguyên liệu là một bƣớc làm sạch cellulose, loại bỏ các tạp chất hemicellulose, lignin, silic và các dƣ lƣợng chất còn lại trong nguyên liệu. Các tạp chất này là những chất ức chế rất mạnh hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose.
Lignin, hemicellulose có tác dụng làm giảm độ hấp phụ của enzyme cellulase dẫn đến ức chế thủy phân cellulose. Đã có nhiều nghiên cứu để loại bỏ lignin, hemicellulose khỏi môi trƣờng thủy phân cellulose. Có thể kiềm hóa mơi trƣờng để chuyển lignin, hemicellulose sang dạng tan, dùng axít lỗng nhƣ sulfuric acid, phosphoric acid, dùng hỗn hợp peroxide và acetic acid (peroxide−HAc) 69,1% ở 80°C trong 26,5 giờ để xử lý nguyên liệu hoặc dùng albumin huyết thanh bò (BSA) bao bọc lignin để trả lại khả năng hấp phụ của cellulase. Nhiều ion kim loại nhƣ
Ca(II) và Mg(II), có khả năng tạo phức với lignin cũng có thể đƣợc sử dụng để lôi kéo lignin.