(DNS) [14]
Glucose phản ứng tạo màu với thuốc thử DNS. Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đƣờng glucose trong một phạm vi nhất định. Sản phẩm sau phản ứng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang ở bƣớc sóng 540 nm. Dựa theo đồ thị đƣờng chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS ta sẽ dễ dàng tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng sinh ra trong mẫu thí nghiệm.
Dựng đƣờng chuẩn glucose:
Đƣờng glucose đƣợc sấy khô trong 5 giờ ở 800C. Tiến hành pha loãng glucose tạo một dãy các nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,10; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 (mg/ml).
Lấy 300µl dung dịch glucose ở mỗi nồng độ trên cho vào các ống nghiệm. Bổ sung 900µl dung dịch DNS vào mỗi ống nghiệm rồi đun sôi trong 5 phút. Làm lạnh nhanh dƣới vòi nƣớc chảy và tiến hành đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 540nm. Kết quả đo độ hấp đƣợc ghi trong bảng sau
Bảng 2.3. Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose theo phƣơng pháp DNS (đo trên máy UV-VIS Double, Model UVD-3200 Labomed)
C (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
OD 540nm 0,253 0,289 0,399 0,566 0,656 0,783 0,949
Từ các kết quả trong bảng trên, dựng đƣờng chuẩn tƣơng quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ (Hình 2.4).
- Mẫu thí nghiệm: Lấy 150µl enzyme cho vào ống nghiệm, đặt vào bể ổn nhiệt ở 500C trong 5 phút. Lấy mẫu ra cho thêm 150µl cơ chất CMC 1% (pH = 7), khuấy trộn hỗn hợp thu đƣợc rồi tiếp tục ủ ở 500
C.
Sau 30 phút, lấy ống nghiệm ra khỏi bể ổn nhiệt, bổ sung 900µl dung dịch thuốc thử DNS. Đun sôi 5 phút rồi làm lạnh nhanh dƣới vòi nƣớc chảy để hạ nhiệt độ dung dịch về nhiệt độ phòng. Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch ở bƣớc sóng 540nm.
- Mẫu đối chứng: Lấy 150µl enzyme cho vào ống nghiệm, bổ sung 900µl dung dịch thuốc thử DNS. Sau đó thêm 150µl dung dịch cơ chất CMC 1%. Tiến hành đun sôi 5 phút và làm các bƣớc tiếp theo nhƣ ống thí nghiệm.
Đồ thị phương trình đường chuẩn Glucose
y = 1.19x + 0.1996R2 = 0.9826 R2 = 0.9826 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 C (mg/ml) OD540nm
Hình 2.3. Đồ thị đƣờng chuẩn glucose theo phƣơng pháp DNS