Luận văn thạc sĩ nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn bacillus thuringiensis phân lập

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  - TRẦN CHUNG DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  - TRẦN CHUNG DŨNG NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Trương Phúc Hưng Cơ quan: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, cho phép bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trương Phúc Hưng giáo viên hướng dẫn khoa học, người tạo điều kiện động viên suốt q trình thực luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán phịng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho tơi thực thí nghiệm phạm vi luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán Phịng Di truyền vi sinh vật viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo, cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè quan tâm, động viên dẫn cho tơi để tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình ln chỗ dựa vững cho tơi suốt q trình thực luận văn Học viên Trần Chung Dũng LỜI CAM ĐOAN Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ii Tôi xin cam đoan thực tồn cơng trình hướng dẫn TS Trương Phúc Hưng Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố luận văn khác Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm cam đoan Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2019 Tác giả Trần Chung Dũng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iii STT Viết tắt Viết đầy đủ Bp Base pair DNA Deoxyribonucleotide a xid E.coli Escherichia coli kDa Kilo Dalton MỤC LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn iv Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Tuyển chọn số chủng Bacillus thurigiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao Thái Nguyên 2.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho q trình lên men chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập xác định đặc điểm hình thái số chủng vi khuẩn B thuringiensis từ mẫu đất thu Thái Nguyên có khả diệt sâu 3.2 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao 3.3 Tối ưu điều kiện ni cấy tạo chế phẩm sinh học từ lồi vi khuẩn B thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Tổng quan vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) 1.1 Lược sử nghiên cứu ứng dụng Bt 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bt giới 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bt Việt Nam 1.2 Đại cương vi khuẩn Bt 1.2.1 Sự phân bố Bt 1.2.2 Đặc điểm hình thái Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn v 1.2.3 Phân biệt B.thuringiensis với loài khác chi Bacillus 1.2.4 Đặc điểm sinh hóa 1.2.5 Phân loại Bt 10 1.2.6 Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var kurstaki 11 1.2.7 Tính chất nuôi cấy 12 1.3.1 Độc tố Bt 13 1.3.2 Cơ chế tác động protein tinh thể lên côn trùng 15 II Tổng quan sâu tơ (côn trùng thử nghiệm) 17 III Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B thuringiensis 19 3.1 Phương pháp lên men bề mặt 20 3.2 Lên men chìm 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.2 Hóa chất thiết bị 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis 24 2.2.2 Phân loại Bacillus thuringiensis phương pháp huyết miễn dịch 25 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 25 2.2.4 Phương pháp lên men vi sinh vật 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Phân lập, tuyển chọn phân loại chủng Bacillus thuringiensis 28 3.1.1 Phân lập chủng B thuringiensis 28 3.1.2 Sự đa dạng hình thái tinh thể chủng B thuringiensis phân lập 29 3.1.3 Phân loại Bt phương pháp huyết 30 3.2 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) chủng Bacillus thiringiensis phân lập 31 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vi 3.3 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt phịng thí nghiệm 32 3.3.1 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh trưởng chủng TC2.5 32 3.3.2 Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm 34 3.3.3 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ chế phẩm Bt – TC2.5 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt loài nhóm chi Bacillus Bảng 1.2 Phân loại độc tố Cry1 Bt var kurstaki côn trùng đích 11 Bảng 3.1 Sự phân bố hình dạng tinh thể chủng Bacillus thuringiensis 25 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính diệt sâu tơ sau ngày thử nghiệm 27 Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng chủng TC 2.5 28 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng TC 2.5 29 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1A Chủng Bt mang bào tử tinh thể Hình 1.1B Hình dạng tế vào tinh thể số loài Bt Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H 10 Hình 1.3 Cấu trúc khơng gian chiều protein Cry 2Aa 13 Hình 1.4 Cơ chế tác động độc tố 15 Hình 1.5 Chu kỳ sống sâu tơ Plutella xylostella 16 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensi 24 Hình 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng, bào tử tinh thể vi khuẩn Bt quan sát kính hiển vi quang học 26 Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết chủng TC 2.5 (2) chủng đối chứng 4D4(1) 27 Hình 3.4 Chế phẩm Bt dạng bột sau lên men 30 Hình 3.5 Thử hoạt tính diệt sâu tơ với chế phẩm Bt-TC2.5 31 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 27 300C, 200 vòng/phút, thời gian nhân giống - 10 Dịch nuôi cấy (chứa tế bào giai đoạn sinh trưởng) sử dụng để làm giống cho thí nghiệm [34] 2.2.4.2 Lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis bình tam giác Sử dụng bình tam giác 500 ml chứa 100 ml mơi trường vô trùng bổ sung 1% dịch giống Lên men máy lắc ổn nhiệt 30 ± 0,10C, tốc độ lắc 200 vịng/phút, thời gian ni 48giờ [34] 2.2.5 Phương pháp tính tần suất - Tần số (n) số lần xuất giá trị mẫu số liệu - Tần suất (f) tỉ số tần số n kích thước mẫu N: fi= ni/N 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập, tuyển chọn phân loại chủng Bacillus thuringiensis 3.1.1 Phân lập chủng B thuringiensis Để phân lập tuyển chọn chủng B.thuringiensis có hoạt tính diệt côn trùng cánh (Diptera), 30 mẫu đất, thu thập địa điểm: đất đồi chè Tân Cương, đất trồng rau Túc Duyên, đất trồng hoa mầu Trại Cau tỉnh Thái Nguyên Mẫu đất sử dụng để phân lập theo phương pháp trình bày mục 2.2.1 Các khuẩn lạc riêng rẽ, đặc trưng cho nhóm Bc – Bt tách từ mẫu phân lập tương ứng với mẫu đất nghiên cứu sau tiến hành quan sát kính hiển vi quang học vật kính dầu Tiêu nhuộm đơn với Fushin Qua đó, lựa chọn chủng Bt có khả hình thành bào tử tinh thể Khuẩn lạc Bt có đặc điểm: trịn, có màu trắng sữa, có mép nhăn khơng (Hình 3.1) Các mẫu đất tiến hành phân lập theo phương pháp nêu Sau ngày nuôi cấy, đĩa thạch chứa môi trường MPA mọc lên số khuẩn lạc khác nhau, chủ yếu khuẩn lạc loài sinh bào tử thuộc chi bacillus Khuẩn lạc Bt Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Bt 29 Từ 30 mẫu đất thu thập Thái Nguyên, phân lập 152 chủng thuộc chi Bacillus Trong đó, xác định 81 chủng Bacillus thuringiensis sinh tinh thể sau nhuộm quan sát kính hiển vi quang học vật kính dầu Có 23 tổng số 30 mẫu đất chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis Tần suất xuất 0,76 số Bt 0,53 So với tài liệu cơng bố Ngơ Đình Bính cộng tần suất xuất số Bt Việt Nam lần luợt 0,63 0,3 Trong đó, số liệu giới công bố là: 0,38 -0,85 [20] 0,2 – 0,5 [17], Như vậy, mẫu đất mà phân lập có số Bt cao Tiến hành làm tiêu khuẩn lạc có hình thái bên ngồi đặc trưng cho nhóm vi khuẩn Bacillus quan sát đĩa phân lập nhuộm với thuốc nhuộm Fushin bazơ để quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần để kiểm tra khả hình thành bào tử tinh thể 3.1.2 Sự đa dạng hình thái tinh thể chủng B thuringiensis phân lập Các protein tinh thể Bt có dạng: hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập phương hình khơng xác định Các chủng khác có khả sinh tinh thể có hình dạng khác Bằng phương pháp quan sát sơ trực tiếp kính hiển vi quang học vật kính dầu với tiêu nhuộm đơn fushin, tiến hành phân loại hình dạng tinh thể cho chủng Bt phân lập (bảng 3.1) Bảng 3.1 Sự phân bố hình dạng tinh thể chủng Bacillus thuringiensis STT Hình dạng Hình lưỡng tháp Hình cầu Hình lập phương Hình cầu, hình lưỡng tháp Hình lập phương, hình cầu Cầu-Lưỡng tháp-Lập phương Số chủng 42 17 15 Tỉ lệ (%) 51,58 21 18,51 4,93 1,23 2,45 30 Từ số liệu thống kê bảng 3.1 ta thấy chủng Bt phân lập sinh tinh thể, chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm ưu (51,58%) Ngồi ta thấy cịn có chủng Bt sinh loại tinh thể (6,16%) loại tinh thể (2,45%) Điều thể tính đa dạng hình dạng tinh thể chủng Bt phân lập Thái Nguyên qua cho thấy Bt có phổ diệt côn trùng rộng từ côn trùng cánh vảy, cánh cứng, hai cánh tới giun tròn thực vật Tế bào sinh dưỡng Bào tử Tinh thể độc Hình 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng, bào tử tinh thể vi khuẩn Bt quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 vật kính dầu 3.1.3 Phân loại Bt phương pháp huyết Vi khuẩn Bt chia thành nhiều loài khác nhau, loài mang đặc điểm riêng biệt Trong số lồi Bt lồi Bt var kustaki có khả diệt trùng cánh vảy Chính chúng tơi tiến hành sàng lọc loài Bt var kustaki từ chủng phân lập cách sử dụng typ huyết H3a, 3b,3c Với kit huyết miễn dịch chuẩn nhận từ phịng Di truyền Vi sinh vật 31 chúng tơi tiến hành sàng lọc chủng Bt var kustaki cách sử dụng typ huyết H3a, 3b, 3c Với phương pháp phân loại trình bày phần 2.3.3, kết 39 tổng số 81 chủng nghiên cứu khẳng định thuộc lồi kustaki thơng qua phản ứng ngưng kết với typ huyết H3a, 3b, 3c Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết chủng TC 2.5 (2) chủng đối chứng 4D4(1) 3.2 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) chủng Bacillus thiringiensis phân lập Các chủng Bt phân lập pha loãng tới nồng độ 1x105 1x107 bt/ml nước cất vô trùng Thử nghiệm theo phương pháp nhúng đĩa Thiery Frachon trình bày phần vật liệu phương pháp nghiên cứu Chúng tơi lựa chọn thử hoạt tính cho chủng Bt var kustaki phân lập Tỷ lệ sâu chết theo dõi ngày Kết thử nghiệm trình bày bảng sau: 32 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính diệt sâu tơ sau ngày thử nghiệm STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%) Đối chứng 105 bào tử/ml 107 bào tử/ml TrC 1.3 76,66 83,33 TC2.7 86,66 93,33 TC 2.5 100 100 TD 1.8 70 83,33 TD 1.6 86,66 100 Từ bảng 3.2 cho thấy: sau ngày thử nghiệm hoạt tính diệt sâu chủng nghiên cứu cao Ở nồng độ 107 baò tử, tỷ lệ sâu chết từ tất chủng thí nghiệm 80% Có hai chủng đạt tỷ lệ diệt sâu 100% chủng TC 2.5 diệt 100% số sâu thí nghiệm nồng độ 105 b tử Từ kết thí nghiệm lựa chọn chủng TC 2,5 để tiến hành nghiên cứu tạo chế phẩm diệt sâu sinh học 3.3 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt phịng thí nghiệm 3.3.1 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh trưởng chủng TC2.5 3.3.1.1 Ảnh hưởng pH Vi khuẩn Bacillus thuringiensis giống tất vi sinh vật khác, có cấu trúc bé nhỏ đơn giản nên chịu tác động trực tiếp yếu tố ngoại cảnh, đó, pH tác nhân ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng hình thành sản phẩm lên men vi sinh vật Để xác định pH thích hợp cho sinh trưởng Bacillus thuringiensis, thí nghiệm tiến hành sau: dịch lên men, điều chỉnh độ pH: 5,0; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 9,0 Tiến hành thí nghiệm bình nón 500 ml với dung 33 tích mơi trường 100 ml, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút Kết nghiên cứu thể bảng 3.5 Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng chủng TC 2.5 5,0 Mật độ tế bào (CFU/ml) 2,3 x106 6,0 1,5 x108 6,5 2,2x108 7,0 2,4 x108 7,5 4,5x108 8,0 1,1 x107 9,0 5,5 x106 Độ pH môi trường Kết nghiên cứu bảng 3 cho thấy chủng TC 2.5 sinh trưởng tốt mơi trường trung tính Ở thí nghiệm có pH ban đầu thấp (pH5) pH cao (pH9) khả sinh trưởng TC 2.5 không tốt, mật độ tế bào đạt 106 CFU/ml, tương đương với mật độ cấp giống ban đầu, thấp hàng trăm lần so với mật độ tế bào đạt thí nghiệm có pH trung tính Ở thí nghiệm có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 mật độ tế bào đạt dịch canh trường sau 48 lên men tương đương Như vậy, vi khuẩn Bacillus thuringiensis sinh trưởng tốt môi trường có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 3.3.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Trong tự nhiên tuỳ thuộc nhóm vi sinh vật, mà nhiệt độ sinh trưởng khác Ở nhiệt độ thích hợp, vi sinh vật sinh trưởng mạnh, tạo nhiều sinh khối sản phẩm phụ Ngược lại, nhiệt độ khơng thích hợp gây ức chế phát triển tiêu diệt vi sinh vật Do vậy, cần xác định nhiệt độ tốt ưu cho q trình lên men Thí nghiệm thực nhiệt độ: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC, 45oC Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng TC 2.5 34 Nhiệt độ lên men Mật độ tế bào (oC) (CFU/ml) 20 6,5 x 107 25 2,8 x 108 30 5,49 x 108 35 4,3 x 108 40 8,5 x 107 45 2,3 x 106 Kết nghiên cứu bảng 3.4 cho thấy: nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến sinh trưởng chủng TC 2.5 Chủng TC 2.5 sinh trưởng mạnh khoảng nhiệt độ từ 25 – 35oC, nhiệt độ mật độ tế bào, bào tử đạt 4,19x108 CFU/ml Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu Ngơ Đình Bính cộng ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng Bacillus thuringiensis Theo đó, nhiệt độ sinh trưởng tốt vi khuẩn Bacillus thuringiensis 28±1oC (Ngơ Đình Bính,2011; Tien et al., 2013; Trang et al., 2012) Ở nhiệt độ 20oC vi khuẩn B thuringiensis sinh trưởng chậm, 40oC bắt đầu ức chế sinh trưởng 3.3.2 Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm Sau nghiên cứu sơ yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men tiến hành lên men sản xuất tạo chế phẩm điều kiện PH=7, nhiệt độ: 30oC, lắc 200 vòng/phút thời gian 72 Sau kết thúc lên men thu sinh khối đặt tủ âm tiến hành đông khô, thu chế phẩm dạng bột 35 Hình 3.4 Chế phẩm Bt dạng bột sau lên men 3.3.3 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ chế phẩm Bt – TC2.5 Để đánh giá hoạt tính sinh học chế phẩm Bt-TC 2.5 chúng tơi tiến hành thí nghiệm thử hoạt tính diệt sâu tơ chế phẩm Các thí nghiệm tiến hành điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thơng thường, bố trí thí nghiệm trình bày chương (Vật liệu phương pháp nghiên cứu) Q q trình thử hoạt tính cho thấy, 100% sâu chết sau ngày nghiên cứu sau ăn có chứa chế phẩm BT- TC2.5 Như vậy, chủng TC2.5 sau lên men tạo chế phẩm điều kiện giữ hoạt tính diệt sâu cao 36 A B (A): Sâu tơ chết ăn tẩm dịch chế phẩm Bt – TC25 (B): Sâu tơ sống lô đối chứng dương với ngâm nuớc cất Hình 3.5 Thử hoạt tính diệt sâu tơ với chế phẩm Bt-TC2.5 sau ngày thí nghiệm 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1) Đã thử nghiệm hoạt tính diệt sâu chủng Bt var kustaki Kết cho thấy, nồng độ 107 bào tử/ml hoạt tính diệt sâu cao chủng TC 2.5 có khả diệt 100% sâu thử nghiệm nồng độ 105 Chủng TC 2.5 lựa chọn để lên men tạo chế phẩm diệt sâu tơ 2) , Đã xác định khoảng nhiệt độ 28±1oC độ pH từ 6,5 – 7,5 thích hợp cho lên men chế phẩn Bt thử nghiệm 3) Đã thành công việc tạo chế phẩm Bt-TC2.5 có hoạt tính diệt sâu tơ cao Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu sâu chủng TC 2.5 tối ưu hố quy trình lên men sản xuất chế phẩm Bt quy mô công nghiệp 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quang Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu 2001 -2002, Viện Công nghệ Sinh học, trang 296 – 302 Ngơ Đình Bính (2005),Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngơ Đình Bính (2004), Nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuẩn Bacillus thuringiensis Việt Nam Báo cáo khoa học, nghiên cứu Khoa học sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004, NXB KHKT trang 59 – 62 Nguyễn Lân Dũng (1981), Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng, NXB KHKT Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, NXB giáo dục Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình trùng học nơng nghiệp tập 2, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 122 – 167 Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh Di truyền học, tập 1, NXB Đại học Sư Phạm, trang 49 – 53 Khuất Hữu ( 2003), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen NXBKHKT Trang137 – 140, 206 – 210 10 Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (1999), Thiết kế lại cấu trúc gen Bt để chuyển vào hai mầm, Báo cáo Hội nghị sinh học toàn quốc, trang 1371-1376 39 Tài liệu Tiếng Anh 11 Attathom T, Chanpaisang J, and Hongrattanameteekul W Bacillus thuringiensis Isolation, Indentification, and Bioasay 1994 In Bacillus thuringiensis, Biotechology and Environmental Benefits, pp70 – 86 12 Barjac D H and Bonnefoi A (1962), Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B Bacillus thuringiensis Entomophaga, 7, pp – 31 13 Barjac D H (1981), Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis 36 – 42 Burges H.D (edited), In microbial control of pests and plant Diseasis 1970 – 1980 14 Barjac D H & Frachon E (1990), Classification of Bacillus thuringiensis strains, Entomophaga 35, pp 233 – 240 16 Cheng X Y, Sardana R, Kaplan H et al (1998), Agrobacterium transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer Pp: 154-172 17 Chicott, C N., Wigley, P J 1993 Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crytal protein Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting P 43-52 17 Dams A, L.F., T.E Visick, ADN H.R.Whiteley (1989), A20 – Kilodaltonprotein is required for efficient production of the Bacillus thuringiensis var israelensis 27 – Kilodalton crystal protein in E coli J Bacteriol 171, pp 521 – 30 18 Didier, L.D Ameller, ADN M.Marguerite (1993), Lecadet Diverst ty of Bacillus thuringiensis toxin ADN Genes Pp 34 -45 19 Dwu, XL Cao, Y.Y Bai, ADN AI Aronson (1991), Sequensing of an operon containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis FEMS microbial Lett 81 – 31 20 Ereclus D, Deléclese A and Lecadet M Diversity of Bacillus thuringiensis 40 toxin and genes (1993), In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice Dited by P F Entwistle, J S Cory, M J Bailey and S Higgs, pp 37 – 60 21 Federici, B.A., Park, H.W & Bideshi, D.K 2010 Overview of the Basic Biology of Bacillus thuringiensis with Emphasis on Genetic Engineering of Bacterial Larvicides for Mosquito Control The Open Toxinology Journal., 3, 83-100 22 Frankenhuyzen V K The challenge of Bacillus thuringiensis In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide: Theory and Practice Edited by P F Entwistle, J S Cory, M J Bailey and S Higgs 1993, pp – 23 23 http://www.thainguyen.gov.vn 24 http://www.en.wikipedia.org/wiki/Lepidoptera # cite_note-cgillott-5 25 J Li, D J Derbyshire, B Promdonkoyt and D J Ellart (2001), Structural - endotoxin fromimplicatios for ransformation of Bacillus thuringiensis.water –soluble to membrane –inserted forms, Biochemical Society: pp 571- 577 26 Http: //web.utk.edu 27 Navon, A (2000), Bacillus thuringiensis insecticides in crop protectionreality and prospects, Crop Protection, 19, pp 669-676 28 Lacey, L.A., Frutos, R., Kaya, H.K & Vail, P (2001), Insect pathogens as biological control agents: Do they have a future? Biological Control, 21, pp: 230-248 29 Bauce, E., Carisey, N., Dupont, A & van Frankenhuyzen (2004), Bacillus thuringiensis subsp kurstaki aerial spray prescriptions for balsam fir stand protection against spruce.pp: 621-630 30 Crickmore (2006), Beyond the spore - past and future developments of Bacillus thuringiensis as a biopesticide Journal of Applied Microbiology, 101, pp: 616-619 41 31 Hernstadt, C., Soares, G.G., Wilcox, E.R & Edwards, D.L (1986), A new strain of Bacillus thuringiensis with activity against coleopteran insects Bio/Technology, 4, pp 305-308 32 Barton, K.A., Whiteley, H.R & Yang, N.S (1987) Bacillus thuringiensis delta-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to Lepidopteran insects Plant Physiology, 85, pp:1103-1109 32 Perlak, F.J., Deaton, R.W., Armstrong, T.A., Fuchs, R.L., Sims, S.R., Greenplate, J.T & Fischhoff, D.A (1990) Insect resistant cotton plants Bio-Technology, 8, 939-943 33 Fujimoto, H., Itoh, K., Yamamoto, M., Kyozuka, J & Shimamoto (1993), Insect resistant rice generated by introduction of a modified deltaendotoxin gene of Bacillus thuringiensis Bio-Technology, 11, pp 11511155 34 Yezza A., Tyagi R D., Valero J R and Surampalli R Y (2005) Bioconversion of industrial wastewater and wastewater sludge in Bacillus Thuringiensis based biopesticides in pilot fermentor, Bioresource Technology 97, pp 1850-1857 35 Yu, H.Y., Li, Y.H & Ming Wu, K.M ( 2011), Risk Assessment and Ecological Effects of Transgenic Bacillus thuringiensis Crops on NonTarget Organisms Journal of Integrative Plant Biology, 53, pp 520–538 36 James, C 2010 Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops (2010), ISAAA Briefs 37 James, C (2013), Global status of commercialized biotech/GM crops: 2013 ISAAA Briefs 38 Capinera, J.L ( 2001), Handbook of Vegetable Pests Academic Press pp 729 ... 2.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho trình lên men chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập. .. sâu tơ cao Thái Nguyên 2.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho q trình lên men chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis. .. tài“ Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập Thái Nguyên” Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Tuyển chọn số chủng Bacillus thurigiensis có hoạt tính diệt sâu