Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật: Phần 1 trình bày những nguyên tắc của nuôi cấy mô, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, các phương pháp nuôi cấy mô. Tham khảo nội dung phần 1 giáo trình để hiểu về nhân giống In Vitro.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT F7G GIÁO TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GS.TS MAI XUÂN LƯƠNG 2005 Công nghệ Sinh học thực vật -1- MỤC LỤC MỤC LỤC - PHẦN I NHÂN GIỐNG IN VITRO - MỞ ĐẦU - CHƯƠNG I NHỮNG NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ - TRONG CÔNG TÁC VI NHÂN GIỐNG - I GIỚI THIỆU CHUNG - II TÁI SINH CÂY CON TRONG NUÔI CẤY MÔ - Nhân giống từ hạt điều kiện vô trùng - Nuôi cấy phoâi - Nuôi cấy tế bào trứng - III NHÂN GIỐNG CÂY CON BẰNG BIỆN PHÁP NUÔI CẤY MÔ - 1.Giai đoạn I Kiến lập ổn định mẫu cấy - 2.Giai đoạn 2: nhân giống - 3.Giai đoạn 3: hình thành rễ - 4.Giai đoạn Làm cho tái sinh thích nghi khí hậu - 10 IV SƠ LƯC LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT.- 11 CHƯƠNG II PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT - 15 I BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG .- 15 Ý nghóa cuả vô trùng nuôi cấy mô thực vật - 15 Nguồn nhiễm tạp - 15 Vô trùng dụng cu ïthủy tinh, nút đậy môi trường - 15 Vô trùng mô cấy - 16 Vô trùng nơi thao tác cấy tủ cấy vô trùng .- 17 II CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG .- 17 Đường - 18 Caùc muối khoáng đa lượng - 18 Các muối khoáng vi lượng - 19 4.Caùc vitamin - 19 Các chất kích thích sinh trưởng (phytohormone) .- 20 Các chất hữu khác - 21 Chuẩn bị dung dịch đậm đặc dung dịch làm việc - 21 Vấn đề lựa chọn môi trường - 23 III CHỌN VÀ XỬ LÝ MÔ CAÁY - 23 IV PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT .- 24 1.Cách bố trí phòng thí nghiệm nuôi cấy mô - 24 Các thiết bị chủ yếu phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật .- 24 CHƯƠNg III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ - 26 I NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG - 26 1/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng khoai tây .- 27 2/ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng địa lan - 29 II NHÂN GIỐNG BẰNG CON ĐƯỜNG PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH - 32 III NHÂN GIỐNG BẰNG CÁCH TẠO MÔ SẸO (CALLUS) - 34 IV NHÂN GIỐNG BẰNG NUÔI CẤY LÁT MỎNG - 36 - GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật -2- V ỨNG DỤNG KỸ THUẬT VI GHÉP TRONG NHÂN GIỐNG - 38 VI NUÔI CẤY TÚI PHẤN - 41 1.Chọn vật liệu khởi nguyên .- 41 2.Tạo tổ hợp gen phương pháp lai hữu tính .- 41 3.Nuôi cấy túi phấn lai - 42 VII NUÔI CẤY VÀ DUNG HP PROTOPLAST Ở THỰC VẬT - 45 Tách nuôi cấy protoplast thực vật .- 46 Dung hợp protoplast - 48 VIII CHUYỂN GEN THỰC VẬT - 51 Agrobacterium - 51 Chuyển gen nhờ Agrobacterium - 52 PHẦN II NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRONG VƯỜM ƯƠM - 54 CHƯƠNG I YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG CỦA NHÂN GIỐNG - 54 I CÁC YẾU TỐ CƠ BẢN VỀ VI KHÍ HẬU CỦA MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG - 54 1.Aùnh saùng - 54 Nước độ ẩm - 55 Nhiệt độ .- 55 Khí trao đổi khí .- 55 Dinh dưỡng khoáng .- 55 II KHAY, CHAÄU TRỒNG CÂY - 56 1.Khay phẳng đáy - 56 Chaäu ñaát nung - 56 Chaäu plastic .- 56 Chậu sợi .- 56 Chaäu giaáy - 57 Tuùi polyethylene - 57 Khay trồng gỗ - 57 III QUẢN LÝ CÁC YẾU TỐ THỔ NHƯỢNG TRONG NHÂN GIỐNG VÀ SẢN XUẤT CÂY GIỐNG - 57 CHƯƠNG II KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG MỘT SỐ CÂY PHỔ BIẾN .- 63 I KÍCH THÍCH TẠO RỄ - 63 II SỬ DỤNG PHYTOHORMONE KÍCH THÍCH CÀNH CHIẾT RA RỄ .- 64 III NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG TỪ RỄ - 65 IV NHÂN GIỐNG TỪ VẢY CỦ - 69 V NHAÂN GIỐNG TỪ LÁ - 70 VI NHÂN GIỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÀNH .- 72 VII NHÂN GIỐNG CÂY ĐỖ QUYÊN - 73 VIII GHÉP CÀNH - 74 - GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật -3- PHẦN I NHÂN GIỐNG IN VITRO MỞ ĐẦU Giống khâu quan trọng sản xuất nông nghiệp Công tác giống chủ yếu bao gồm khâu thu thập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo, tuyển chọn, thử nghiệm giống nhân giống Nhờ phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nên ngày phần lớn công việc thực cách thuận lợi nhanh chóng Sự hình thành phát triển phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật kết phát sau lónh vực sinh lý thực vật di truyền học phân tử: Tính toàn thể (potipotency) mô tế bào thực vật cho phép tái sinh hoàn chỉnh từ mô, chí từ tế bào nuôi tách rời; Khả tạo đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, từ tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối nhờ rút ngắn chu trình lai tạo; Khả hấp thu ADN ngoại lai vào tế bào thực vật khả chuyển gen để gây biến đổi (transformation) thực vật ADN ngoại lai nhờ công nghệ gen (genetic engineering); Khả nuôi cấy tế bào thực vật nuôi cấy vi sinh vật dẫn đến khả ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao để phục vụ cho công tác tạo giống; Kỹ thuật nuôi cấy protoplast khả dung hợp protoplast, tái sinh hoàn chỉnh từ protoplast lai (cybrid); Khả loại trừ virus phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tạo dòng vô tính bệnh nhân giống vô tính; Khả dùng chồi nách, thể chồi protocorm vào nhân giống vô tính với tốc độ cực nhanh số trồng; Khả sử dụng phương pháp nuôi cấy phôi để khắc phục tượng bất thụ lai xa; Khả bảo quản nguồn gen nuôi cấy ống nghiệm; 10 Khả tồn trữ tế bào thực vật sống thời gian dài nhiệt độ thấp mà không tính toàn thể tế bào Nuôi cấy mô tế bào thực vật không góp phần giải cách có hiệu công tác giống trồng mà mở chân trời nghiên cứu di GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật -4- truyền thực vật, chế sinh tổng hợp thực vật, sinh lý phát triển, vai trò phytohormone đời sống thực vật nhiều vấn đề sinh học khác Nuôi cấy mô tế bào thực vật công cụ để thu nhận chất có hoạt tính sinh học (alcaloid, steroid ) qua nuôi cấy mô tế bào thuốc quy mô lớn GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật -5- CHƯƠNG I NHỮNG NGUYÊN TẮC CỦA NUÔI CẤY MÔ TRONG CÔNG TÁC VI NHÂN GIỐNG I GIỚI THIỆU CHUNG Khả kiến lập trì quan mô thực vật (phôi, đỉnh sinh trưởng, rễ, hoa tế bào, callus, tế bào trần) nhân giống vô trùng để tái sinh từ chúng kết nghiên cứu nghiên cứu ứng dụng phòng thí nghiệm thực vật học, bệnh học di truyền học từ cuối kỷ 19 Công việc gọi chung nuôi cấy mô quan, nuôi cấy ống nghiệm, vi nhân giống thuật ngữ công nghệ sinh học Các quy trình công nghệ sinh học bao gồm tái sinh chồi, tái sinh con, tạo callus tạo phôi vô tính Vi nhân giống khác với phương pháp nhân giống truyền thống chỗ trình chia thành nhiều giai đoạn để kiểm khía cạnh trình tái sinh phát triển Mỗi bước trật tự công việc thao tác (hoặc lập chương trình) cách chọn mẫu cấy kiểm tra môi trường nhân giống Nhìn sâu vào chế sinh học trình vi nhân giống tìm thấy khả ứng dụng phương pháp nhân giốngcây phục vụ sản xuất đại trà Trong chương mô tả công việc nêu xác định sở hình thái, sinh lý di truyền trình sinh trưởng phát triển nuôi cấy mô Trước hết nắm vững ý nghóa số thuật ngữ quan trọng • Nuôi cấy mô Thuật ngữ dùng cho trật tự thao tác dùng để trì sinh trưởng mô thực vật (tạo callus, tế bào, tế bào trần), quan nuôi cấy vô trùng Kỹ thuật dùng để nhân giống, cải biến genotype (tức tạo giống mới), sản xuất sinh khối chứa sản phẩm hóa sinh học, nghiên cứu bệnh học thực vật, bảo quản phôi nghiên cứu khoa học Tất thao tác gọi chung công nghệ sinh học • Vi nhân giống Thuật ngữ dùng để ám công việc nhân giống thực vật ống nghiệm Có giai đoạn phát triển đặc trưng công việc kiến lập, nhân chồi, tạo rễ làm cho tái sinh thích nghi với khí hậu • Mẫu cấy Đó mẫu thực vật dùng để nhân giống Mẫu cấy đoạn cành cắt, lát mỏng, chồi hạt • Tạo phôi vô tính Sự hình thành phôi từ tế bào sinh dưỡng từ hợp tử sau thụ phấn • Callus Sự hình thành tế bào không phân hóa (thường từ tế bào nhu mô) GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật -6- II TÁI SINH CÂY CON TRONG NUÔI CẤY MÔ Phương pháp nhân giống ống nghiệm sử dụng có hiệu hàng loạt kiểu thao tác cho nẩy mầm tái sinh có biện pháp bảo vệ để tránh nhiễm tạp trở ngại mang tính di trưyền mẫu cấy khắc phục Nhân giống từ hạt điều kiện vô trùng Thành công phương pháp nhân giống từ hạt đạt hạt hoa lan Hạt hoa lan bé, không chứa chất dinh dưỡng dự trữ nói chung phụ thuộc vào quan hệ cộng sinh với số loại nấm đặc hiệu để tiếp nhận chất dinh dưỡng Người ta tính khoảng 30.000 hạt Catleya Năm 1922 Levis Knudson thông báo kết nuôi cấy thành công hoa lan môi trường nuôi cấy không cộng sinh có cung cấp muối khoáng đường saccharose Cơ sở thành công phát calcium hypochloride sử dụng để khử trùng bề mặt mà không gây độc cho phôi nẩy mầm Quy trình rút ngắn đáng kể thời gian nhân giống Hiện sử dụng nẩy mầm hạt lai Nuôi cấy phôi Nuôi cấy phôi bao gồm tách phôi từ hạt cho nẩy mầm môi trường vô trùng Công dụng chủ yếu kỹ thuật “cứu” phôi nẩy mầm bên hạt trước chín Rất nhiều lai loài bước đầu nhân giống phương pháp có kết phôi bị hỏng trình phát triển (hiện tượng bất thụ phôi vô tính) Những dòng chín sớm nhiều loại ăn có xu hướng cho chín trước phôi chúng phát triển đầy đủ Trong điều kiện tự nhiên phôi dễ bị hỏng tách chúng nuôi chúng môi trường nuôi cấy thích hợp làm cho chúng nẩy mầm Ứng dụng thứ hai nuôi cấy phôi kích thích nẩy mầm hạt chín ngủ để rút ngắn chu trình nhân giống Nuôi cấy tế bào trứng Hệ thống bao gồm nuôi cấy vô trùng trứng tách rời, noãn (đã thụ phấn chưa thụ phấn), thực giá noãn gắn bên tế bào trứng Mặc dù kỹ thuật sử dụng lần để nghiên cứu vấn đề ăn phát triển hạt, quy trình thích hợp sử dụng nhân giống, đặc biệt việc làm hoàn thiện gen Tế bào trứng chưa thụ tinh tách cấy môi trường dinh dưỡng với phấn hoa sau cho thụ phấn ống nghiệm Quy trình sử dụng có hiệu có nhiều loại tế bào trứng Phấn hoa đặt trực tiếp vào thực giá noãn để ống phấn phát triển trực tiếp vào tế bào trứng GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật -7- Tế bào trứng nuôi cấy có hiệu việc cứu phôi non chúng chưa bị tách khỏi mẹ Đây kỹ thuật đơn giản nhiều so với nuôi cấy phôi Các tế bào trứng khử trùng dễ dàng nói chung sinh trưởng dễ dàng môi trường có chứa muối khoáng, đường cần thêm số phytohormone Kỹ thuật nuôi tế bào trứng phổ biến có nhu cầu dinh dưỡng khoáng thay đổi Đối với đa số loài môi trường muối khoáng vô đường quan trọng, auxin cần sử dụng để kích thích sinh trưởng III NHÂN GIỐNG CÂY CON BẰNG BIỆN PHÁP NUÔI CẤY MÔ Vi nhân giống phần lớn trồng bao gồm giai đoạn chủ yếu thực môi trường khác chịu biện pháp kiểm tra khác nhau: - Giai đoạn I: Kiến lập, tức tạo điều kiện cần thiết để tái sinh từ mẫu cấy; Giai đoạn II: Nhân giống Giai đoạn III: Tạo rễ; Giai đoạn IV: Làm cho tái sinh thích nghi khí hậu 1.Giai đoạn I Kiến lập ổn định mẫu cấy Mục tiêu giai đoạn I đặt thành công mẫu cấy vào môi trường vô trùng cách tránh bị nhiễm tạp chuẩn bị đầy đủ môi trường ống nghiệm để tái sinh cách ổn định Giai đoạn bao gồm nội dung sau: 1/ Chọn mẫu cấy Sự lựa chọn trì nguồn thực vật yếu tố quan trọng đảm bảo thành công vi nhân giống Có khía cạnh đòi hỏi phải đặc biệt quan tâm: a/ Đặc điểm di truyền phát sinh cá thể nguồn thực vật dùng để nhân giống b/ Kiểm tra nguồn gây bệnh c/ Điều kiện sinh lý cho phép sử dụng nhân giống Trước hết, xác định đặc điểm di truyền quan trọng nhầm lẫn giai đoạn làm nẩy sinh vấn đề phức tạp gây nên thiệt hại đáng kể kinh tế trước tìm đường chuyển sang giai đoạn Trong số loài giống trồng khác có biến động đáng kể khả tái sinh điều kiện nhân giống khác Cần phải thực nghiên cứu cách có hệ thống để có kiến thức kinh nghiệm cần thiết loại Cần phải dành thời gian để xác định nhu cầu giống chưa quen thuộc, mặc dù, nói chung, tìm thông tin giống tài liệu xuất Nói chung, thực vật dễ nhân giống biện pháp thông thường đễ thực vi nhân giống Ví dụ loại thảo mộc vừa dễ nhân giống thông thường vừa dễ thực vi nhân giống Trong loại gỗ khó GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật -8- tái sinh nhiều đễ nhân giống chúng cần phải tìm phương pháp thích hợp Thành công vi nhân giống loài gỗ phụ thuộc vào đặc điểm non dùng để nhân giống Vi nhân giống mọc từ hạt dễ nhiều so với trưởng thành, chủng khác loài trồng thường có yêu cầu đặc trưng riêng vi nhân giống Nói chung, yếu tố hạn chế vi nhân giống hình thành rễ tăng sinh trưởng rễ hình thành Các thao tác nhằm thu nhận giống trẻ hóa bao gồm lựa chọn phận trẻ phần gốc sinh từ hạt để tạo chồi bất định phối hợp cách ghép chồi bất định với sinh trưởng từ hạt Mục đích vi nhân giống tạo giống trẻ hóa có đầy đủ khả rễ Sự tiến khả rễ song song với biến đổi sức khỏe hình thái ghi nhận số loài gỗ 2/ Khử trùng mẫu cấy Các yếu tố gây nhiễm vi nhân giống bao gồm: a/ Nhiễm nấm, nấm mốc, nấm men vi khuẩn bề mặt mẫu cấy; b/ Nhiễm virus thể tương tự virus; c/ Các nguồn bệnh bên Trong số trường hợp yếu tố gây nhiễm không làm ức chế sinh trưởng rễ thu nhận vi nhân giống mà trì tác dụng ức chế sau trồng thu nhận vườn ươm Các yếu tố gây nhiễm có mặt khắp nơi Để diệt trừ chúng thường hay sử dụng chất hóa học mà thông dụng Calcium hypochloride Natrium hypochloride Những chất gây tác dụng độc cho vi sinh vật gây nhiễm độc trồng nhân giống ống nghiệm 3/ Điều kiện sinh lý xử lý mẫu cấy để việc nuôi cấy dễ thành công Có điều kiện sinh lý quan trọng là: a/ Mẫu cấy lấy từ trồng thùng chứa nuôi nhà kính với kiểm tra môi trường chặt chẽ; b/ Phải tạo giống khỏe mạnh; c/ Xử lý phytohormone 4/ Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy thường dùng môi trường nửa rắn có chứa agar sản phẩm thương mại tương tự, muối khoáng dinh dưỡng đa lượng vi lượng, nguồn lượng mà chủ yếu đường saccharose số vitamin cần thiết Ngoài ra, phần lớn môi trường có chứa loại phytohormone thuộc hai nhóm auxin cytokinin với tỷ lệ thích hợp loại Tốc độ tái sinh môi trường tùy thuộc vào loại trồng 5/ Dịch rỉ vi nhân giống Một tượng không mong muốn thường xảy tiến hành vi nhân giống tượng dịch rỉ từ mẫu cấy thoát Gây tác GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật -9- hại nhiều hợp chất phenol khác Khi chúng bị oxy hóa làm cho môi trường ngã sang màu nâu, ức chế tái sinh sinh trưởng Để hạn chế tác hại loại dịch rỉ cần phải có biện pháp xử lý mà chủ yếu sử dụng chất chống oxy hóa, kể bổ sung chất hấp phụ vào môi trường polyvinylpyrrolidone than hoạt tính 6/ Làm ổn định mẫu cấy Các mẫu cấy đòi hỏi phải cắt cấy chuyền nhiều lần để tạo đồng sinh trưởng tốt Phần lớn năm thảo mộc ổn định nhanh chóng sau số lần cấy, gỗ đòi hỏi nhiều lần cấy hơn, chí khó đạt tính ổn định Sự khó khăn việc làm ổn định mẫu cấy thường gằn liền với trạng thái sinh trưởng mẫu cấy: mẫu cấy non dễ ổn định Mùa vụ sinh trưởng mẫu cấy liên quan với ổn định 2.Giai đoạn 2: nhân giống Mục đích giai đoạn trì việc vi nhân giống trạng thái ổn định nhân nhiều theo yêu cầu Môi trường giai đoạn giống giai đoạn 1.Tốc độ vi nhân giống nhanh chóng sản phẩm thương mại đòi hỏi tối ưu hóa nguyên tố vô mà yếu tố khác môi trường Điều thực cách thử cách hệ thống nồng độ khác nguyên tố sử dụng phối hợp với yếu tố khác Các chất điều hòa sinh trưởng dùng để trì mức độ sinh trưởng phản ứng phát triển nhân giống Cytokinin số nồng độ có tác dụng mạnh việc kích thích tạo chồi Nói chung, nồng độ tối thiểu cytokinin kích thích tạo chồi lựa chọn trình nhân giống Nồng độ cao cytokinin kích thích tạo chồi ức chế trình sinh trưởng chồi theo chiều dài Vì vậy, xác định xác nồng độ cytokinin cần thiết Auxin thường dùng với nồng độ thấp không sử dụng giai đoạn Tỉ lệ nhân giống số thu lần vi nhân giống Nói chung, tỉ lệ nhân giống từ chối bất định lớn so với từ chồi nách Tuy nhiên, tỉ lệ nhân giống từ số loại chồi đặc biệt thường cao chồi bất định Vì vậy, tỉ lệ nhân giống cao không thiết phải đáng ao ước để trì chất lượng thu được.Tần số nhân giống kéo dài từ hai đến tám tuần Kỹ thuật cấy chuyền cần tối ưu hoá loại trồng, bao gồm kích thước tính mùa vụ mẫu cấy, phương pháp cắt hướng đặt mẫu cấy lên môi trường 3.Giai đoạn 3: hình thành rễ Chức giai đoạn tạo rễ cho mẫu cấy chuyền để sau mang chúng trồng môi trường vô trùng vườn ươm Việc tạo rễ thực bên bên ống nghiệm bao gồm cách sau: Tạo rễ ống nghiệm GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 39 - gốc hoang dã với ưu điểm suất phẩm chất cành ghép Tuy nhiên,trong ghép theo kỹ thuật truyền thống thời gian trồng gốc ghép kéo dài kích thước mắt ghép lớn nên bệnh virus dễ lây truyền Để khắc phục nhược điểm trên,kỹ thuật ghép đỉnh sinh trưởng (shoot apex grafting), hay gọi tắt vi ghép (micrografting) thử nghiệm mang lại kết tốt Về nguyên tắc, vi ghép nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thông qua dinh dưỡng tự nhiên gốc ghép Đỉnh sinh trưởng làm mắt ghép có kích thước 0,2 – 0,5 mm tách từ búp non sinh trưởng mạnh mẹ trưởng thành; gốc ghép mầm giá nảy từ hạt giống hoang dại Toàn ghép nuôi dưỡng điều kiện ống nghiệm vô trùng Những ghép thu phương pháp hoàn toàn bệnh mang đặc điểm di truyền mẹ cho mắt ghép Phương pháp vi ghép loại có muối (bưởi, cam, chanh, quýt ) tiến hành sau: a/ Gieo hạt lấy mầm làm gốc ghép: Tách hạt từ chín, rửa để khô phòng 24 Cất giữ tủ lạnh 4oC để dùng dần Khi gieo bóc vỏ trấu, vỏ lụa, khử trùng 5-10 phút dung dịch HgCl2 0,1%, gieo môi trường khoáng MS chứa 2% saccharose,0,8% aga; để mẫu cấy tối 25oC Sau 10 ngày mầm dài 5-8 cm chọn làm gốc ghép b/ Tách đỉnh sinh trưởng làm mắt ghép: Chọn mẹ trưởng thành có suất phẩm chất tốt Hái búp non dài 1,5 – 3,0 cm, cho vào lọ túi nilon kín đem phòng thí nghiệm Cắt bỏ bớt lá, khử trùng hypochlorit natri 0,5% phút Dùng kim nhọn gạt bỏ non, sau dùng lưỡi dao cạo bẻ nhọn để tách đỉnh sinh trưởng kích thước khoảng 0,5mm, để nguyên lưỡi dao để chuyển vào vị trí ghép c/ Tiến hành ghép: Dùng dao cạo cắt bỏ đầu rễ, thân trụ mầm, để lại phần rễ chừng 23cm phần thân chừng 2cm Có cách ghép: - Ghép lên mặt cắt: Đặt mắt ghép trực tiếp lên bề mặt lát cắt, vòng tượng tầng; - Ghép chữ T ngược: Dùng đầu nhọn lưỡi dao cắt lỗ ghép hình chữ T ngược, chân chữ T mặt cắt để dễ bộc lộ vùng tượng tầng; Đặt mắt ghép cho mặt cắt tiếp xúc với tượng tầng; GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 40 - - Ghép hàm ếch: Khoét thân mầm cách mặt cắt 5mm vết lõm hình hàm ếch, chiều sâu vết lõm bề dày lớp vỏ Đặt mắt ghép vào đáy hàm ếch (hình 4) Hình Vị trí mắt ghép kiểu vi ghép d/ Nuôi ghép: Cây ghép đặt vào ống nghiệm lớn (25 x 200 mm) chứa 6ml môi trường MS lỏng có chứa 7,5% đường Để không chạm vào thành ống nghiệm, dùng mảnh giấy sắc ký 4,5 x 4,4 cm gấp thành hình lượn sóng để làm giá đỡ cho mẫu Nuôi mẫu 25oC, chiếu sáng 16 giờ/ngày Trong tuần mắt ghép đạt kích thước 1,5 – 2,0 mm sau tuần chồi ghép có kích thước 15 – 20 mm; rễ gốc ghép mọc thêm rễ phụ Cây ghép đem trồng đất vườn ươm Điều quan trọng kỹ thuật vi ghép tạo tiếp xúc mắt ghép tế bào tượng tầng Chỉ – ngày sau ghép quan sát thấy vòng mô sẹo phát sinh từ tượng tầng Đó điều kiện để mắt ghép gốc ghép liên kết với Thí nghiệm cho thấy: - Kiểu ghép T ngược có hiệu nhất; - Thích hợp cam ghép lên bưởi gốc ghép 14 ngày tuổi; - Mặc dù mắt ghép lớn có tỷ lệ thành công cao, song để đảm bảo tính bệnh virus không nên dùng mắt ghép lớn 0,5mm Cũng cần ý nách mầm gốc ghép có chồi ngũ, bình thường bị ưu ức chế Khi ghép ta khử nên chồi ngủ đánh thức nhanh, làm ức chế phát triển mắt ghép Để tránh tình trang cần khử mắt ngủ cách khoét vào thân khử mầm để loại trừ mắt ngủ Chồi phụ phát sinh từ tượng tầng mặt cắt gốc ghép Cần loại bỏ chúng phát để tạo điều kiện cho chồi ghép phát triển nhanh GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 41 - Cây ghép ống nghiệm có rễ tự nhiên khỏe dễ sống đưa trồng đất Cần lưu ý rửa dung dịch nuôi giàu đường để rễ không bị nấm Đất phân làm bầu nên khử trùng để tránh lây nhiễm bệnh Những ghép nguyên liệu đầu dòng nên cần trồng chúng khu vực cách ly tốt VI NUÔI CẤY TÚI PHẤN Từ năm 1924 Blackelee chứng minh dòng nhị bội đồng hợp tử thu cách nhị bội hóa thể đơn bội Nhờ rút ngắn nhiều thời gian tạo dòng so với phương pháp cổ điển dựa tự thụ phấn Vấn đề tương tự ta muốn có dòng đa bội đồng hợp (homozygous polyploids) Do tính trội lặn thể đơn bội, kiểu hình (phenotype) phản ánh trung thưc kiểu gen (genotype) Vì vậy, chúng nguyên liệu lý tưởng để sử dụng chọn giống phương pháp đột biến Thể đơn bội giúp cho di truyền học hiểu vai trò ADN nhân ADN tế bào chất, xác định tính trạng liên quan nhiều đến di truyền tế bào chất Chúng sử dụng trực tiếp trồâng trọt, ví dụ số cảnh có hoa nhỏ thời gian sống lâu thể nhị bội có tính bất dục Phương pháp nuôi cấy túi phấn hạt phấn đời làm giảm hẵn thời gian công sức để thu nhạân thể đơn bội Ngày nhiều loại trồng thành công nuôi cấy túi phấn hạt phấn Nhiều giống trồng tạo phương pháp Ta làm quen với phương pháp nuôi cấy túi phấn qua đối tượng lúa mà nhà khoa học Phân viện Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh thực nhằm mục đích cải tạo giống lúa Việt Nam Phương pháp gồm bước sau đây: 1/ Chọn vật liệu khởi nguyên; 2/ Tạo tổ hợp gen phương pháp lai hữu tính; 3/ Nuôi cấy túi phấn lai; 4/ Nhị bội hóa đơn bội từ túi phấn; 5/ Tạo đánh giá dòng đơn bội kép 1.Chọn vật liệu khởi nguyên Vật liệu khởi nguyên chọn dựa tính trạng suất cao, chịu phèn, chịu mặn, kháng rầy, chín sớm Một số tính trạng đơn gen (do gen định), tính kháng rầy nâu, tính chịu phèn; số khác đa gen (do tập hợp nhiều gen định), suất 2.Tạo tổ hợp gen phương pháp lai hữu tính Do gen quy định tính trạng nói thường nằm rải rác giống lúa khác nhiều chịu tác động gen ức chế nên lai hữu tính cần thiết để tạo tổ hợp gen mong muốn, tập hợp tính trạng tốt thể, đồng thời góp phần khử tác động gen ức chế GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 42 - Kỹ thuật lai: Cây mẹ khử nhị chấm phấn hoa bố nở lên đầu nhụy Cắt bỏ hoa không lai bọc gié lai túi giấy dầu màu sáng Hạt lai tổ hợp trồng thành F1 Dùng túi phấn F1 để nuôi cấy 3.Nuôi cấy túi phấn lai • Kỹ thuật nuôi cấy túi phấn Túi phấn nuôi cấy cho đơn bội chứa hạt phấn giai đoạn phát triển thích hợp Ở lúa giai đoạn phát triển túi phấn thích hợp cho nuôi cấy tương ứng với lúc khoảng cách tai đòng thứ hai khoảng – cm bóc vỏ đòng lúc thấy đầu vỏ hạt lúa có màu xanh mạ nhạt; túi phấn bên vỏ màu vàng nhạt chiếm 1/3 chiều dài hạt lúa Dùng gié lúa lúa, nơi túi phấn phát triển tương đối đồng đều, để làm mẫu vật nuôi cấy Đòng lúa sau chọn bọc bao nilon kín để giữ ẩm để 10 C tối từ 48 đến 72 trước nuôi cấy Khác với nụ hoa thông thường khử trùng dung dòch hypochlorit canxi – 5% – 15 phút, lúa bọc kín đòng, bị nhiễm bẩn nên cần rửa nước lau qua đòng cồn 70o Bóc vỏ bẹ đòng, chọn gié lúa thích hợp khử trùng chúng dung dịch hypochlorit canxi 2% phút đủ Có thể dùng chất khử trùng khác HgCl2 0,2%, H2O2 tăng hiệu khử trùng chất có hoạt tính bề mặt tween-80, fotoflo, teepol, nồng độ 0,2% Môi trường dụng cụ nuôi cấy khử trùng nồi hấp Tất công việc thực buồng cấy vô trùng o Sau khử trùng hoa lúa rửa kỹ – lần nước cất vô trùng Dùng kéo cong cắt đầu cạnh vỏ hoa lúa cho lộ rõ túi phấn đặt nhẹ lên môi trường thạch nghiêng ống nghiệm Chú ý tránh làm tổn thương túi phấn để không làm giảm khả phát sinh mô sẹo hạn chế gây nhiễm Sau cấy dùng parafin dán kín nắp ống nghiệm Nên dùng loại ống nghiệm 25 x 100mm có nắp thủy tinh để cấy khoảng 18 túi phấn ống nghiệm Môi trường thích hợp cho việc tạo mô sẹo lúa môi trường N6 cải tiến với thành phần trình bày bảng Tùy theo yêu cầu loại cây, người ta chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp Thông thường túi phấn nuôi nhiệt độ 24 – 27oC, ánh sáng 2000 lux với chu kỳ chiếu sáng 14h/ngày Ở lúa loài tạo qua mô sẹo, nói chung, thời kỳ tạo mô sẹo nuôi tối, qua giai đoạn tái sinh từ mô sẹo thiết phải chiếu sáng đầy đủ Thông thường người ta sử dụng đèn ánh sáng trắng cường độ 2000lux, chu kỳ chiếu sáng 9h/ngày GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 43 - Bảng Môi trường N6 cải tiến dùng để tạo mô sẹo từ túu phấn lúa Thành phần Đa lượng Nộng độ (mg/l) KNO3 (NH4)2SO4 KH2SO4 MgSO4.7H2O CaCl2.2H2O FeSO4.7H2O Na2EDTA 2830 463 400 185 166 557 745 Vi lượng MnSO4.4H2O H3BO3 ZnSO4.7H2O KI 4,4 1,6 1,5 0,8 Thành phần Vitamine Glycine Thiamine HCl (B1) Pyridoxin HCl (B6) Acid nicotinic (PP) Các chất hữu Dịch chiết nấm men Saccharose Agar Than hoạt tính Phytohormone IAA Kinetin NAA pH = 5,8 Nộng độ (mg/l) 2,0 1,0 0,5 0,5 1g/l 50g/l 9g/l 1g/l 0,5 1,0 8,0 Sau – ngày nuôi cấy hạt phấn nuôi cấy phát triển theo hai hướng sau đây: - Phần lớn hạt phấn tiếp tục phát triển phân chia bình thường, tạo thành nhân sinh dưỡng sinh sản Nhân sinh dưỡng to, nhân sinh sản nhỏ, nằm sát vách tế bào - Một số hạt phấn phát triển và phân chia thành hai nhân nhau; sau – ngày chúng tiếp tục phân chia để tạo nên – nhân; vào khoảng 10 ngày sau tiền phôi dạng cầu có kích thước lớn với 32 nhân hình thành Sau cấy 20 – 30 ngày từ số túi phấn xuất mô sẹo hình cầu nhỏ màu trắng Chúng phá vỡ túi phấn thường phát triển nhanh Mô sẹo đạt 0,5 – 1,0 mm (tương ứng 10 – 15 ngày tuổi) đem cấy chuyền sang bình tam giác chứa 60ml môi trường tái sinh với thành phần gồm khoáng đa lượng, vi lượng vitamin N6, 1g/l dịch chiết nấm men,30g/l saccharose, 9g/l agar, 1g/l than hoạt tính,0,2mg/l IAA, 1mg/l kinetin, pH = 5,8 Trên môi trường tái sinh kích thước mô tăng nhanh Sau vài tuần số mô xuất điểm xanh, từ chúng hình thành chồi từ phát triển thành cây, đồng thời rễ trắng xuất ăn sâu vào môi trường thạch Một mô cho nhiều Những mô không cho sau thời gian đen dần chết Khi cao khoảng – 10 cm cấy chuyền sang môi trường White tiếp tục nuôi thêm thời gian trước chuyển trồng vườn ươm Thời gian tăng trưởng nhanh nên trồng vào ống nghiệm 25 x 200mm với cường độ chiếu sáng cao (3000 lux) Những nhỏ nuôi tiếp môi trường tái sinh GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 44 - Cây cao 15 – 20cm chuyển vườn ươm trồng chậu đất, ngày đầu che bớt ánh nắng để quen dần với điều kiện tự nhiên • Nhị bội hóa đơn bội từ túi phấn Không phải tất từ nuôi cấy túi phấn đơn bội Về hình thái phát đơn bội theo vài tính trạng chúng thấp, nhỏ, màu nhạt nhị bội Theo dõi kiểm tra nhiễm sắc thể từ túi phấn thấy tỉ lệ gia bội tự nhiên chúng cao, khoảng 20 – 50% đơn bội Thường thu lúa có mức bội thể khác (từ 1n đến 4n) Sự gia bội tự nhiên không xảy tế bào mô sẹo mà tế bào soma tái sinh, chí xuất khảm với đám tế bào với mức bội thể khác Ví cần thiết phải kiểm tra phát kịp thời đơn bội để có biện pháp nhị bội hóa + Phương pháp kiểm tra mức bội thể Các sau đưa chậu 20 – 30 ngày có chừng 10 – 15 nhánh Lấy ngẫu nhiên – nhánh, cắt bỏ hết bẹ ngoài, lấy đoạn non đánh dấu thứ tự cho Mẫu cố định theo Carnua (75ml cồn tuyệt đối + 25ml acid acetic đậm đặc) từ đến 12 Rửa mẫu dung dịch carmin 2% carbon fuchsin theo Kao Dung dịch carbon fuchsin pha sau: Dung dịch A: Hòa 3g fuchsin basic 100ml cồn 70o Dung dịch B: 1ml dung dịch A + 90ml phenol 5% Dung dòch C: 45ml ddB + 6ml acid acetic + 6ml formaldehyde 37% Éùp mẫu acid acetic 45%; kiểm tra mức bội thể kính hiển vi + Phương pháp nhị bội hóa Cây lúa đơn bội sau kiểm tra nhiễm sắc thể xử lý colchicin 2% 24 để tạo nhị bội đồng hợp tử phương pháp tiến hành sau: - Nhổ, rửa ngâm rễ lúa dung dịch colchicin bắt đầu đẻ nhánh mạnh, sau rửa cấy lại - Cắt bỏ phần lúa (sát đòng non) bao chỗ cắt phần tẩm dung dịch colchicin - Dùng dao lam rạch nhẹ từ xuống đoạn dọc theo thân khoảng 2cm lúa chưa trổ thành khe nhỏ đặt vào miếng tẩm dung dịch colchicin - Đối với hai phương pháp sau để tránh bay nhanh pha colchicin dung dịch 2% glycerin Cây đơn bội chứa nhiễm sắc thể cặp nên meios bị rối loạn, tạo nên giao tử sức sống – có toàn hạt lép có kích thước xấp xỉ 1/2 hạt lúa bình thường Những qua xử lý colchicin GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 45 - số không qua xử lý colchicin nhờ nhị bội hóa tự nhiên cho những hạt lúa bình thường Ngoài thu thể khảm, nhánh đơn bội (là chủ yếu) có nhánh nhị bội cho từ đến 10 hạt Có cho toàn hạt Những hạt có sức nẩy mầm cao ký hiệu hạt H0 Do thu nhờ nuôi cấy túi phấn lai, chúng tiền thân dòng đơn bội kép mang nhiều tổ hợp gen khác từ bố mẹ, có tổ hợp có ý nghóa kinh tế tính đồng hợp tử cao qua đơn bội Mỗi hạt lai khởi thủy dòng lai H0, từ chúng tạo dòng đơn bội kép H1 cách lai dòng tổ hợp lai H0 khác VII NUÔI CẤY VÀ DUNG HP PROTOPLAST Ở THỰC VẬT Protoplast tế bào thực vật vỏ cellulose tác dụng số loại enzyne thuộc nhóm cellulase, lại màng sinh chất (plasmodesma) bao quanh chất nguyên sinh Protoplast có khả dung hợp (fusion) với để tạo thành thể lai vô tính tác dụng polyethylen glycol (PEG), có khả hấp thu trực tiếp phần tử virus, vi khuẩn, quan tử đại phân tử ADN, ptotein Dung hợp qúa trình kết hợp hai protoplast thành một, gọi lai vô tính (somatic hybridization) Nhờ đặc tính trên, kỹ thuật protoplast giúp cho việc cải tạo nhanh chóng máy di truyền tế bào thông qua tái sinh thể lai vô tính từ protoplast lai, dung hợp protoplast không tương đồng giới tính (sexual incompatible) có họ hàng xa, tăng khả quang hợp tính kháng sâu bệnh cách chuyển ty thể lục lạp vào có hệ thống quang hợp yếu tính kháng yếu, nuôi cấy protoplast phục vụ cho nghiên cứu tính di truyền biến tính định hướng… Gần nhiều phòng thí nghiệm giới tiến hành nghiên cứu chuyển trực tiếp ADN lạ vào protoplast thuộc họ Hòa thảo lúa mà không cần hỗ trợ Agrobacterium tumefaciens qua vi khuẩn trung gian khác Cho đến kỹ thuật tách, nuôi cấy tái sinh protoplast hoàn thiện hai mầm cổ điển thuốc mà giải đối tượng khó tái sinh khoai lang mầm quan trọng lúa Ngoài việc phục vụ trực tiếp cho công tác giống, protoplast mô hình lý tưởng cho nghiên cứu di truyền, tính chống chịu kháng sinh, chống chịu sâu bệnh, tính chịu phèn, chịu mặn v.v… Trong nuôi cấy dung hợp protoplast cần nắm vững kỹ thuật sau: - Kỹ thuật tách, nuôi cấy tái sinh protoplast có giá trị kinh tế; - Dung hợp protoplast để tạo thể lai vô tính tái sinh thể lai thành hoàn chỉnh; GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - - 46 - Sử dụng protoplast cho nghiên cứu di truyền (như chuyển gen lạ quan tử vào protoplast Tách nuôi cấy protoplast thực vật Có thể tách protoplast từ tất phần rễ, thân, lá, nốt sần rễ, mầm, vỏ quả, tràng hoa, tế bào mẹ hạt phấn, từ mô sẹo hay huyền phù tế bào Ở làm quen với phương pháp tách protoplast từ tế bào tương đối đồng có ưu điểm không tích lũy rối loạn di truyền tế bào mô sẹo Qúa trình tách protoplast gồm bước: - Khử trùng mẫu (đối với nuôi trồng điều kiện vô trùng không cần); Cắt mẫu; Xử lý enzyme; Làm protoplast đưa vào môi trường nuôi cấy a/ Tách nuôi cấy protoplast từ thuốc (Nicotiana tabacum) • Nguyên liệu: Cây thuốc nuôi in vitro môi trường MS chứa vitamin Morel,20g/l saccharose, 8g/l agar Chọn phát triển đầy đủ 20 – 30 ngày tuổi (5 – lá) • Xử lý enzyme Hỗn hợp enzyme cellulase Onozuka R10 1% Macerozym 0,5% pha môi trường Kao cải tiến có chứa sacchrose 0,4M (137g/l), pH 5,8 Dịch enzyme lọc vô trùng qua lọc milipore (Có thể thay hỗn hợp enzyme Driselase 1%) Lá thuốc cắt thành sợi nhỏ ngâm vào hỗn hợp enzyme 12 giờ, để tối, nhiệt độ 28 – 30oC Cứ 1g tươi cần 10ml hỗn hợp enzyme Sau xử lý lắc nhẹ để protoplast rời khỏi Tất thao tác thực điều kiện vô trùng Sau dịch enzyme chứa protoplast lọc qua lưới lọc để loại bỏ mảnh mô Dịch lọc ly tâm 500 vòng/phút phút Sau ly tâm protoplast lên bề mặt lớp màu xanh; dùng pipet Pasteur hút nhẹ lớp protoplast chuyển sang ống nghiệm ly tâm khác có chứa môi trường Kao Ly tâm lại hai lần hút lớp protoplast để chuyển sang môi trường nuôi cấy • Nuôi protoplast 4ml huyền phù protoplast nuôi đóa Petri φ 60 với môi trường K1 cải tiến có chứa 0,1mg/l 2,4D, 0,2mg/l BA 1mg/l NAA cho đảm bảo mật độ protoplast đạt 2000/ml môi trường Bao paraphin đặt tối hộp giữ ẩm Sau 4-5 ngày vỏ cellulose hình thành lại protoplast bắt đầu phân chia Sau 10 ngày hình thành cụm có từ 4-10 tế bào Thêm vào đóa Petri 2ml môi trường GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 47 - K2 (nồng độ NAA giảm xuống 0,2mg/l, đường giảm xuống 100g/l) Sau hút 1,5ml dịch tế bào gieo mặt đóa thạch chứa môi trường K3 (K2 có thêm thạch 7g/l) Sau ngày quan sát kính hiển vi mặt thạch hình thành cụm tế bào lớn Cắt lớp thạch thành miếng0,5 x 0,5 cm đặt môi trường tạo mô sẹo (Môi trường MS chứa 1mg/l 2,4D, 0,5mg/l kinetin), nuôi đóa Petri đặt tối • Tạo chồi tái sinh Sau 15 ngày cấy chuyền, mặt thạch hình thành cụm mô sẹo lớn màu trắng Cấy chuyền sang môi trường tạo chồi (môi trường khoáng MS, vitamin Kao, 50mg/l đường, 7g/l thạch,2mg/l BA, 0,5mg/l IAA) Các bình chồi chiếu sáng 2.000 lux giớ/ngày Sau 10 ngày đám mô sẹo chuyển thành màu xanh hoàn toàn xuất chồi sau 15 ngày Sau chuyển sang môi trường tạo rễ (khoáng MS, đường 20g/l) Rễ hình thành sau 10 ngày b/ Tách protoplast từ mô thịt khoai lang (Ipomoea batatas) • Nguyên liệu: Tế bào đơn khoai lang tách cách nghiền mô cối Potter Do khoai lang có tế bào mô dậu vách dày có độ bền cao tác động giới, việc tạo huyền phù tế bào đơn từ mô khó khăn Các tế bào đơn nuôi môi trường Lin Staba với nồng độ BA 0,1mg/l, 2,4D 0,1mg/l, saccharose 100g/l Chọn tế bào phân chia lần thứ để tách protoplast • Tách nuôi protoplast Cho vào đóa Petri có tế bào đơn nuôi mặt thạch 3ml hỗn hợp enzyme lọc qua milipore gồm cellulase Onozuka R10 2%, pectinase maceroenzyme 1%, manitol 0,6M, pH 5,8 Dùng que cấy gạt nhẹ tế bào khỏi mặt thach chuyển toàn dịch enzyme chứa tế bào sang đóa Petri khác, để tối nhiệt độ 28oC thời gian 24 giờ, lắc nhẹ Sau xử lý enzyme rót tất dịch enzyme chứa protoplast vào ống nghiệm ly tâm x 12 cm, ly tâm 400 vòng/phút cho protoplast lắng xuống đáy Dùng pipet hút bỏ dịch enzyme, sau rửa protoplast cách ly tâm lần với manitol 0,6M lần với môi trường nuôi cấy Protoplast treo môi trường lỏng với mật độ 3.105 protoplast 1ml Lấy 0,5ml protoplast nuôi mặt thạch đóa Petri chứa 2ml môi trường LS có 20g/l saccharose manitol 0,6M Gắn parafin giữ ẩm đặt tối 28oC Trên môi trường LS sau 10 ngày nuôi cấy phần lớn protoplast sống khỏe mạnh có thay đổi hình dạng, chứng tỏ tế bào hình thành bắt đầu phân chia Việc kết hợp phương pháp học để tách tế bào đơn xử lý enzyme cho phép thu nhận số lượng lớn protoplast khỏe mạnh c/ Tách protoplast từ mô lúa Oryza sativa GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật • - 48 - Nguyên liệu Ngâm hạt lúa – ngày cho nẩy mầm, sau gieo vào chậu đất Chọn mạ 13 – 20 ngày tuổi làm nguyên liệu • Tách nuôi protoplast Cây lúa rửa sạch, cắt bỏ rễ phiến Lấy đoạn bẹ dài – cm khử trùng cồn 70o phút, sau hypochlorit canxi 7% 20 phút Rửa nhiều lần nước cất vô trùng Sau khử trùng bóc lấy phần bẹ non màu trắng hay vàng nhạt bên trong, cắt ngang thành mảnh nhỏ ngâm vào hỗn hợp enzyme gồm cellulase Onozuka R10 1% vaø pectinase 0,5%, manitol 0,6M, pH 5,8 12 nhiệt độ 28-30oC, tỉ lệ gam tươi 10ml dung dịch enzyme Trong ủ lắc nhẹ loại bỏ mảnh không bị enzyme phân hủy, dịch lỏng rót vào ống ly tâm đáy nhọn, ly tâm 500 vòng/phút phút để protoplast lên Dùng pipet hút cho vào môi trường nuôi cấy mật độ 104 – 105/ml Các đóa Petri gắn parafin đặt vào chỗ tối nhiệt độ 25oC Dung hợp protoplast Sự kết hợp hai protoplast làm gọi dung hợp (fusion) hay lai vô tính Hiện tượng Power Cocking phát năm 1971 thí nghiệm dung hợp loài khác loài protoplast tách từ chóp rễ ngô yến mạch Từ tiếp tục có nhiều công trình nghiên cứu thành công việc dung hợp protoplast nhiều loài khác song với tần số thấp Năm 1974 Kao Michaylus phát polyethylen glycol (PEG) gây kết dính dung hợp tốt protoplast thực vật tìm điều kiện để đạt tần số dung hợp cao Trong năm gần phòng thí nghiệm đại dùng phương pháp dung hợp điện (electrofusion) để tiến hành dung hợp protoplast nhiều loại Người ta dùng thiết bị xung điện (electroprorator) để làm tăng tầng số dung hợp protoplast cho qua cực máy xung điện Bằng phương pháp nhận lai vô tính Solanum melongena L Solanum torvum Sw., giống khoai tây nhị bội BF 15 (H1), Aminca (H6) Cardinal (H3) Chúng ta làm quen với phương pháp dung hợp protoplast với dòng thuốc bạch tạng SRA dòng thuốc xanh Nicotiana tabacum Nia 63 hoạt tính nitrat reductase Dòng Nicotiana tabacum Nia 63 dòng đột biến bị hỏng phần apoenzyme nitrat reductase nên khả khử nitrat hấp thụ nitơ nitrat mà hấp thụ nitơ dạng amôn Về hình thái, dòng Nia 63 tồn dạng mô sẹo, khả tái sinh hoàn chỉnh GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 49 - Phép lai tiến hành dòng Nia 63 với dòng bạch tạng SRA (bị hỏng chế tổng hợp diệp lục) để tạo lai màu khảm xanh có khả hấp thụ nitơ nitrat (hình 5) Quá trình lai tiến hành sau: 1/ Nguyên liệu; - Cây thuốc bạch tạng SRA nuôi môi trường MS có chứa 2mg/l BA, 0,5ml/ NAA, 20g/l saccharose, 8g/l agar, pH = 5,6 điều kiện ánh sáng yếu, 15 ngày cấy chuyền lần X Protoplast dòng Nia 63 hoạt tính nitratreductase Protoplast dòng bạch tạng SRA khả tạo diệp lục Cây lai khảm xanh có hoạt tính nitratructase Hình Sơ đồ lai vô tính hai dòng thuốc Nia 63 SRA - Lấy g mô sẹo Nia 63 nuôi bình tam giác chứa 50ml môi trường lỏng khoáng đa lượng MS với nguồn nitơ succinat amôn, vi lượng B5, 10mg/l thiamin HCl,0,1mg/l GA3, 0,1mg/l BA, 0,4mg/l 2,4D, 30g/l saccharose, pH = 5,6 Các bình tam giác lắc liên tục máy lắc điều kiện ánh sáng yếu Khoảng 3-4 ngày cấy chuyền lần 2/ Hóa chất a/ Enzyme dùng để tạo protoplast - Dung dịch enzyme 1: Cellulase Onozuka R10 2%, Maceroenzyme 1% pha saccharose 0,4M, pH = 5,6 dùng để tạo protoplast từ thuốc bạch tạng SRA; - Dung dịch enzyme 2: Callulase Onozuka R10 2%, Macerozyme 1%, Driselase 1% pha saccharose 0,4M, pH = 5,6 dùng để tạo protoplast từ dòng Nia 63 Các dung dịch enzyme lọc vô trùng qua lọc milipore b/ Các hoá chất dùng cho dung hợp: - Dung dòch 1: 0,5M glucose,, 3,5mM CaCl2.2H2O, 0,7mM KH2PO4.H2O 1000ml nước cất pH = 5,6 GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 50 - - Dung dòch 2: 50mM glycine,50mM CaCl2.2H2O, 0,3 M glucose 1000 ml nước cất, pH = 10,5 (chỉnh NaOH 0,1N) - PEG: Chuẩn bị PEG 40%: 8g PEG (MW 1500 – 6000), 2,5mg KH2PO4.H2O, 31mg CaCl2.2H2O, 1,2 g glucose pha nước cất thành 20ml Chỉnh pH tới 5,6 3/ Phương pháp dung hợp - Tạo protoplast từ thuốc bạch tạng SRA: lấy 1g bạch tạng, cắt nhỏ ngâm vào 10ml dung dịch enzyme 1, ủ tối 12 nhiệt độ thường - Tạo protoplast từ tế bào nuôi cấy dịch lỏng dòng Nia 63 Lọc dịnh huyền phù tế bào qua phễu lọc sắt ngăn 2000µ, 500µ37µ để loại bỏ tế bào to Ly tâm dịch lỏng chứa tế bào tốc độ 500 vòng/phút phút để thu nhận tế bào, sau xử lý dung dịch enzyme Ủ 12 tối nhiệt độ thường Dịch enzyme chứa protoplast lọc ly tâm lần với saccharose 0,4M để rửa enzyme, sau ly tâm với dung dịch để làm lắng protoplast - Dung hợp: Trộn hai loại protoplast với theo tỷ lệ 1:1 dung dịch với mật độ 5.10 /ml Nhỏ giọt dịch hỗn hợp protoplast lên chỗ đóa Petri nhựa (đường kính 6cm), để yên 15 phút cho protoplast lắng xuống đáy đóa Nhỏ nhẹ nhàng giọt PEG lên đỉnh giọt dịch chứa protoplast cho lớp protoplast dính chặt vào đáy đóa không bị bong lên Ủ protoplast dịch PEG 30 phút nhiệt độ phòng Thêm cách nhẹ nhàng lần cách 15 phút, lần 0,5 ml dung dịch để làm tăng khả kết dính protoplast Sau rửa protoplast lần, lần 2ml môi trường nuôi cấy cách dùng pipet Pasteur hút nhẹ dịch rửa Sau rửa PEG, cho vào đóa 2ml môi trường nuôi cấy có chứa đạm amon tế bào phục hồi sau trình tách dung hợp (nếu cho vào môi trường có đạm nitrat vào môi trường tế bào dòng Nia 63 vốn khả khử nitrat tế bào lai chết) Sau – ngày tế bào bắt đầu phân chia Cấy chuyền sang môi trường K1a có đạm nitrat Trên môi trường đạm nitrat tế bào dòng Nia 63 chết dần Sau 10 ngày nuôi cấy tế bào phân chia thành cụm tế bào Cấy chuyền sang môi trường K2a (giống môi trường K1a đường giảm xuống 100g/l, 2,4D 0,1mg/l, BA 0,2mg/l NAA 0,2mg/l Sau 10 – 15 ngày quan sát thấy hình thành cụm tế bào to Cấy chuyền sang môi trường tạo mô sẹo (MS có đạm nitrat, IAA 1mg/l, kinetin 0,5mg/l, thạch 8g/l saccharose 30g/l Sau 15 ngày cấy chuyền, để bình mô sẹo ánh sáng 2000 lux Có hai loại tế bào mô sẹo: loại mô màu xanh nhạt, loại màu trắng vàng Tiếp tục cấy chuyền – lần môi trường đạm nitrat mô xanh dòng Nia 63 bị chết, mô màu trắng vàng phát triển mạnh GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 51 - Cấy chuyền mô sẹo trắng vàng môi trường tạo chồi chứa BA 2mg/l/ IAA 0,5mg/l, đặt ánh sáng 2000 lux Sau 15 ngày chồi xuất Giữa chồi hoàn toàn trắng thấy xuất nhiều chồi màu vàng khảm xanh (chiếm tỉ lệ ¼ chồi trắng) Chọn chồi có khảm xanh cấy môi trường chất sinh trưởng rễ Việc lai vô tính thành công kỹ thuật dung hợp protoplast mở đường cho việc ứng dụng kỹ thuật tạo giống trồng VIII CHUYỂN GEN THỰC VẬT Ngày nhờ phát triển nhanh chóng công nghệ sinh học người ta chuyển gen xác định vào thể thực vật để làm cho chúng có tính chất cần thiết Những gen lấy từ quan hệ học hàng từ động vật, côn trùng, nấm, vi khuẩn v.v Agrobacterium Việc chuyển gen thực nhiều cách khác nhau, nhiên, đa số thực hệ thống chuyển gen Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens loại vi khuẩn hình que, gram âm, có nhiều đất, thuộc họ Rhizobiaceae, có khả gây u thực vật, A Rhizogenes gây bệnh rễ tóc (hairy root) Agrobacterium tumefaciens có plasmid dài 120-150 kb, định đặc tính gây u, gọi plasmid Ti (tumer inducing) A rhizogenes có plasmid với kích thước tương tự, kích thích tạo rễ tóc, gọi plasmid Ri (root inducing) Một phần ADN plasmid Ti Ri gọi ADN T, tức ADN vận chuyển, gắn vào gen gen thực vật, làm xuất khối u rễ tóc Nhờ đặc tính người ta sử dụng plasmid Ti Ri làm vectơ chuyển gen để thay đổi tính trạng di truyền thực vật theo ý muốn Plasmid Ti Ri có chứa nhiều gen lạ đưa trở lại vào Agrobacterium tumefaciens vi khuẩn chuyển gắn chúng vào gen tế bào thực vật GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 52 - Cấu tạo plasmid Ti Ri mô tả hình Hình Sơ đồ cấu tạo plasmid Ti Ri Agrobacterium Vùng T: Vùng phát sinh ADN vận chuyển (ADN T) Các gen chuyển vào biểu nhân thực vật; Vùng B: Vùng chức vi khuẩn; Rhiz: Các gen tham dự vào hình thành rễ; Onc: Các gen gây ung thư tham dự vào hình thành khối u; Bg Bd: Bờ trái bờ phải giới hạn vùng T; OPS: Các gen tổng hợp opin; OPC: Các gen dị hóa opin; ORI: Nguồn gốc chép Agrobacterium; VIR: Các gen mà biểu chúng liên quan đến mối tương tác vi khuẩn gây bệnh tế bào thực vật, theo theo vận chuyển vùng T Sự thiết lập mối quan hệ Agrobacterium bắt đầu vết thương thực vật Các tế bào thực vật bị thương sản sinh hợp chất phenol acetosyringon có tác dụng gây cảm ứng tương tác vi khuẩn tế bào thực vật, giúp cho gen ADN T vi khuẩn hoà nhập dễ dàng vào gen tế bào thực vật Sau hòa nhập vào gen tế bào thực vật, gen ADN T biểu tế bào thực vật: chúng mã hóa cho tổng hợp phytohormone dẫn đến tạo khối u rễ tóc Khi phần ADN T chứa gen liên quan đến chức tạo khối u cắt bỏ khỏi plasmid Ti, chúng giữ nguyên khả chuyển gen lạ vào thực vật Các plasmid gọi plasmid lành (disarmed plasmid) dùng nhiều vào việc chuyển gen không kèm theo khối u Chuyển gen nhờ Agrobacterium Protoplast, đóa thể nuôi cấy mô khác nuôi chung với Agrobacterium với plasmid Ti có ngậm gen lạ Sau vi khuẩn loại bỏ cách GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 53 - dùng kháng sinh đặc hiệu carnebicilin, cefotaxin Các nguyên liệu thực vật sau chuyển đến môi trường tái sinh Các tái sinh nuôi vườn ươm trồng đất Việc chuyển gen xác định thành công nhờ hệ thống gen đánh dấu gắn kèm gen kháng với kháng sinh, gen mã hóa cho enzyme có phản ứng màu biểu hiện, gen mã hóa cho luciferase, enzyme đom đóm giúp mô chuyển gen phát sáng tối v.v… Gen đánh dấu sử dụng nhiều gen mã hóa cho enzyme β-glucuronidase (được gọi gen GUS A) Enzyme có thực vật điều kiện tự nhiên Nếu đưa gen GUS vào gen thực vật gen biểu mô thực vật xuất enzyme β-glucuronidase Nó xúc tác cho phản ứng màu đặc trưng (xanh da trời) với chất X-gluc (5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-galactopyranoside) Plasmid pBI 121 hãng Chonetech Laboratories (Mỹ) bán dạng chuyển vào Agrobacterium tumefasiens (chủng LBA 4404) có chứa gen GUS A dùng nhiều để chứng minh chuyển gen thành công đối tượng thực vật định Để đưa gen có ý nghóa kinh tế gen mã hóa vỏ protein virus, gen độc tố Bacillus thuringensis v.v… gắn gen vào pBI 121 dùng gen GUS để kiểm tra GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học ... GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật -4 - truyền thực vật, chế sinh tổng hợp thực vật, sinh lý phát triển, vai trò phytohormone đời sống thực vật nhiều vấn đề sinh học. .. hypochloride 9 -1 0 %, natrium hypochloride 9 -1 0 % 5-3 0 phút nước brôm 12 % từ 2 -1 0 phút Ngoài ra, hydro peroxide 10 -1 2 % 5 -1 0 phút chlorua thủy ngân 0 , 1- 1,0% 2 -1 0 phút cho kết tốt loại mô cấy - Bóc nhẹ... kích thích sinh trưởng thực vật IAA, năm 19 39 Gautheret sử dụng thành công chất vitamin GS.TS Mai Xuân Lương Khoa Sinh học Công nghệ Sinh học thực vật - 12 - nhóm B nói để kích thích sinh trưởng