Tài liệu tham khảo Giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II - Chương 2 Những vấn đề kỹ thuật và phương pháp chung trong công nghệ vi sinh vật
Nếu mơi trường có mặt nhiều chất trước hết xảy tổng hợp enzym xúc tác phân huỷ chất dễ sử dụng Sự tổng hợp enzym khác bị ức chế kiềm chế dị hố Thơng thường glucoza chất thích hợp 1.3.2 Những sai hỏng di truyền điều hồ trao đổi chất Các chế điều hồ trao đổi chất bị thay ñổi ñột biến dẫn tới tổng hợp thừa chất trao ñổi chất Những enzyme dị lập thể ngồi vị trí phản ứng với chất, chúng cịn vị trí khác sản phẩm cuối (hình 2) Vị trí thứ gọi trung tâm dị lập thể Hai vị trí tách biệt không gian khác cấu trúc Một đột biến dẫn đến kết làm protein enzyme dị lập thể bị thay ñổi cách ñi khả phản ứng với chất hiệu ứng cịn hoạt tính xúc tác Một protein bị biến đổi cịn hoạt động có mặt sản phẩm cuối dẫn ñến tổng hợp thừa sản phẩm cuối tương ứng (hình phía bên phải) Trong kiềm chế tổng hợp enzym xảy phản ứng liệt phạm vi thông tin di truyền, phiên âm (hình 3) Sự điều hồ tổng hợp enzym bị rối loạn đột biến khác Những đột biến đụng chạm đến gen kiềm chế dẫn tới sai hỏng chất kiềm chế làm biến nó; hay đụng chạm đến gen ñiều khiển làm cho gen khả tác dụng với chất kiềm chế (bên phải hình 3) Tồn sai hỏng tương ứng biểu cảm ứng enzyme Nhờ sai hỏng mà enzyme cảm ứng trở thành enzyme cấu trúc, nghĩa chúng tồn tế bào không phụ thuộc vào chất kiềm chế dị hố bị CHƯƠNG II: NHỮNG VẤN ðỀ KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP CHUNG TRONG CÔNG NGHỆ VI SINH VẬT Sản xuất sinh khối sản phẩm trao đổi chất q trình lên men có nhiều điểm giống phương pháp kỹ thuật Việc áp dụng kỹ thuật phương pháp tuỳ ñối tượng vi sinh vật mục tiêu sản phẩm cuối Trên sở áp dụng mục tiêu phương pháp riêng Chính khơng thể có phương pháp chung cho tất sản phẩm Việc áp dụng kỹ thuật phương pháp sở nguyên tắc chung kỹ thuật phương pháp ñã trình bày Vì thế, chương giới thiệu nguyên tắc chung kỹ thuật phương pháp ñược áp dụng rộng rãi ngành vi sinh cơng nghiệp Các ngun tắc chung bao gồm việc tuyển chọn giống vi sinh vật, giữ giống vi sinh vật, trình thiết bị lên men bản, số kỹ thuật phương pháp để thu nhận sản phẩm lên men 2.1 Giống vi sinh vật 2.1.1 Yêu cầu giống vi sinh vật công nghiệp Các chủng vi sinh vật muốn ñem vào sản xuất lớn phải bảo ñảm tiêu chuẩn sau ñây: - Phải cho sản phẩm mong muốn với suất cao, chất lượng tốt, có ý nghĩa kinh tế sản xuất sản phẩm phụ khơng mong muốn - Sử dụng nguyên liệu sẳn có, rẽ tiền - Thời gian lên men ngắn - Dễ tách sinh khối hay sản phẩm sau lên men - Vi sinh vật phải chủng, khơng chứa vi sinh vật lạ, đặc biệt không chứa bacteriophage ký sinh - Chủng vi sinh vật phải khoẻ, phát triển dễ dàng nhanh chóng, cho nhiều tế bào dinh dưỡng bào tử hình thức tái sinh khác - Có khả chống, chịu điều kiện bất lợi mơi trường - Dễ bảo quản, tồn ổn ñịnh đặc tính sinh lí, sinh hóa suốt thời gian sử dụng - Có khả thay đổi ñặc tính kỹ thuật ñột biến, kỹ thuật gen để khơng ngừng nâng cao suất chất lượng sản phẩm 2.1.2 Nguồn giống vi sinh vật 2.1.2.1 Phân lập tự nhiên Thiên nhiên nguồn cung cấp giống vô tận cho công nghiệp vi sinh vật Các vi sinh vật sử dụng công nghiệp thực phẩm dễ dàng phân lập chúng từ loại thức ăn, nước uống sản xuất theo phương pháp cổ truyền: từ bánh men thuốc bắc, mốc tương, sữa chua… Vi sinh vật sử dụng công nghiệp sản xuất kháng sinh thường ñược phân lập ñất, nước vùng khác ðể phân lập ñược chủng vi sinh vật mong muốn từ quần thể hỗn hợp vi sinh vật tự nhiên phải thực bước sau: thu mẫu, hồ lỗng, cấy lên môi trường, nuôi, khiết, kiểm tra… Các cơng việc giống nghiên cứu ñối tượng vi rút, vi khuẩn, nấm, tảo, nguyên sinh động vật, động vật khơng xương sống loại nhỏ ðể hồ lỗng mẫu người ta thường sử dụng nước muối sinh lí (0,85% dung dịch NaCl) nước cất ðối với số loài dễ chết nước cất nước muối sinh lí Pseudomonas dùng dung dịch peptone 0,1% để làm lỗng Sau pha lỗng đem cấy rỉa mơi trường thạch ñem nuôi tủ ấm 1-3 ngày Tiếp theo tách khuẩn lạc điển hình làm tinh khiết số lần mơi trường thạch để tách riêng khuẩn lạc ðối với nhóm vi sinh vật yếm khí cấy môi trường thạch hộp Petri người ta phải cho thêm chất khử hay gắn kín parafin ni mơi trường khơng có oxy ðể phân lập chủng sản xuất kháng sinh kháng kháng sinh người ta thường dùng phương pháp nhanh: hồ lỗng mẫu 10 100 lần, sau lấy 1ml dung dịch hồ lỗng cấy lên mơi trường thạch ñã có sẳn vi sinh vật cần tiêu diệt chất cần phân giải Sau nuôi 1-3 ngày tủ ấm đem xem xét khuẩn lạc có đặc tính mà mong muốn tiến hành phân lập khiết chủng có hoạt lực cao ðể phân lập ñược chủng vi sinh vật mong muốn phải tiến hành làm giàu số lượng vi sinh vật đó, tức phải sử dụng mơi trường điều kiện ni cấy để chọn lọc chủng mong muốn ức chế chủng không mong muốn 2.1.2.2 Thu nhận từ trung tâm giữ giống Ngày có nhiều trung tâm giữ giống giống giới cung cấp cho giống vi sinh vật phục vụ cho công tác nghiên cứu, giảng dạy, sản xuất Một số trung tâm giữ giống như: - Mỹ: ABBOTT, ATCC, NRRL - Canada: CANAD-212 - Nhật: FERM, HIR - Úc: CC - Trung quốc: IMASP 2.1.3 Cải tạo giống vi sinh vật Trừ số ngành công nghệ thực phẩm người ta có sử dụng vi sinh vật kiểu dại cịn hầu hết ngành cơng nghiệp khác sản xuất kháng sinh, vitamin, enzyme v.v người ta ñều dùng biến chủng 2.1.3.1 Ưu nhược ñiểm sử dụng biến chủng * Ưu ñiểm: - Cho suất cao - Thời gian lên men ngắn tạo bọt lên men - Ít tạo sản phẩm phụ q trình lên men - Tạo nhiều sản phẩm q mà chủng kiểu dại khơng có được, ví dụ như: insulin, kháng nguyên Hbs (chống vim gan B) v.v - Khả chống, chịu ñiều kiện bất lợi mơi trường cao * Nhược: - ðịi hỏi cơng nghệ cao - Trong q trình sản xuất xuất hiện tượng hồi biến 2.1.3.2 Phương pháp tạo giống ðể tạo giống vi sinh vật người ta sử dụng nhiều phương pháp khác nhau: - ðột biến nhân tạo chọn lựa: cơng việc phịng thí nghiệm trung tâm nghiên cứu nhằm tìm chủng vi sinh vật có suất cao sản xuất sản phẩm mà mong muốn - Tái tổ hợp gen: sử dụng khả biến nạp, tiếp hợp, tải nạp, lai tế bào chất vi sinh vật kỹ thuật gen ñể thực việc tạo cá thể với gen theo ý muốn - Lựa chọn thường xuyên: cơng việc thường thực phịng thí nghiệm nhà máy nhằm giữ ñược cá thể tốt quần thể vi sinh vật Khi kiểm tra loại bỏ đột biến ngẫu nhiên khơng cho suất cao có biểu bất lợi giữ cá thể thích nghi tốt điều kiện sản xuất 2.1.4 Giữ giống vi sinh vật 2.1.4.1 Ý nghĩa nhiệm vụ công tác giữ giống Giữ giống vi sinh vật cơng việc có ý nghĩa vơ lớn Nó giúp cho giữ đặc tính q (khơng bị thối hố) vi sinh vật bảo ñảm cung cấp giống cho q trình sản xuất Nhiệm vụ cơng tác giữ giống sử dụng kỹ thuật cần thiết để giữ cho vi sinh vật có tỷ lệ sống cao, đặc tính di truyền khơng bị biến ñổi không bị tạp nhiễm vi sinh vật lạ 2.1.4.2 Các phương pháp giữ giống Có nhiều phương pháp giữ giống vi sinh vật Tuỳ theo trang thiết bị loại vi sinh vật cần giữ mà sử dụng phương pháp sau: - Giữ giống môi trường thạch nghiêng - Giữ giống lớp dầu khoáng - Giữ giống cát - Giữ giống ñất -Giữ giống silicagen -Giữ giống loại hạt ngũ cốc (lúa, ngô, kê ) -Giữ giống giấy lọc -Giữ giống miếng gelatin -Giữ giống phương pháp lạnh ñông -Giữ giống phương pháp ñông khô 2.2 Dinh dưỡng môi trường nuôi cấy vi sinh vật 2.2.1 Quá trình nhu cầu dinh dưỡng tế bào vi sinh vật Trong trình sống tế bào vi sinh vật khơng ngừng trao đổi chất với mơi trường xung quanh Tế bào vi sinh vật nhỏ hấp thu chất dinh dưỡng thải sản phẩm trao đổi chất qua tồn bề mặt tế bào cường ñộ trao ñổi chất chúng lớn Các chất dinh dưỡng qua màng vào tế bào chuyển hố để tạo thành chất riêng biệt cần thiết cho việc xây dựng tế bào Nhờ q trình đồng hố tế bào sinh trưởng, phát triển tăng sinh khối, ñồng thời sinh sản phẩm trao ñổi chất Sự biến ñổi chất dinh dưỡng bao gồm nhiều phản ứng hoá sinh khác nhờ hệ enzym theo ñường trao ñổi chất ñể: Tạo chất có thành phần tế bào Sản lượng sinh học cần thiết cho hoạt ñộng sống Những chất dinh dưỡng ñã hợp chất có phân tử nhỏ qua màng tế bào vi sinh vật tham gia vào loai phản ứng: - Biến đổi dị hố làm xuất sản phẩm có cấu trúc đơn giản Những biến đổi dị hố cung cấp cho vi sinh vật lượng chuyển hoá dạng ATP hợp chất giàu lượng khác Một số sản phẩm dị hố thải đi, số khác làm vật liệu làm tiền chất cho phản ứng đồng hố - Biến đổi đồng hố, đảm bảo tổng hợp thành phần có cấu trúc phức tạp phân tử lượng cao - gọi trình sinh tổng hợp Các chất dinh dưỡng vi sinh vật chủ yếu lấy môi trường xung quanh Cho nên thành phần môi trường dinh dưỡng bảo ñảm cung cấp nguyên tố C, H, O, N, P, S, Ca, Fe nguyên tố vi lượng 2.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 2.2.2.1 Phân loại môi trường Phân loại theo thành phần có mơi trường: + Mơi trường tự nhiên: có thành phần khơng xác định, chế tạo từ động hay thực vật + Mơi trường tổng hợp: gồm chất hố học tinh khiết lấy với nồng độ cho trước + Mơi trường bán tổng hợp Phân loại theo trạng thái vật lí: + Mơi trường lỏng: dùng để tăng sinh, tích luỹ sản phẩm trao đổi chất, phát đặc tính sinh lí, sinh hố, để giữ giống bảo quản nhiều loại vi sinh vật khơng phát triễn mơi trường đặc + Mơi trường đặc: dùng để phân lập thu khuẩn lạc rời, nghiên cứu ñịnh danh, giữ giống, đếm số lượng vi sinh vật + Mơi trường xốp: dùng công nghệ vi sinh vật 2.2.2.2 Nguyên liệu dùng chuẩn bị môi trường công nghệ vi sinh vật Nguyên liệu cung cấp nguồn cacbon Cacbon chiếm phần lớn tế bào vi sinh vật, hợp chất chứa cacbon có ý nghĩa hàng ñầu sống vi sinh vật Nguồn thức ăn cacbon chủ yếu vi sinh vật hydratcacbon Các hợp chất có phân tử thấp số đường vi sinh vật đồng hố trực tiếp Cịn hợp chất cao phân tử (tinh bột, xenlulo…) ñược phân huỷ nhờ enzyme vi sinh vật tiết Trong hydratcacbon thi glucose nguồn cacbon vạn ñối với vi sinh vật Q trình biến đổi glucose tế bào vi sinh vật diễn đường: chu trình Embden-Meyerhof-Parnas (EMP); pentoza; Entner-Dondoroff Tất dẫn tới tạo thành axít pyruvic từ ñi vào trình khác Các enzym CO2, rượu, sản phẩm kỵ khí khác Tinh bột → glucose amylaza Qt ngoại bào Các enzym CO2, H2O, axít hữu sản phẩm trao đổi hiếu khí Ngồi vi sinh vật đồng hoá số cacbuahydro: CH3-(CH2)n-CH3 CH3-(CH2)n-CH2OH CH3-(CH2)n-CHO CH3-(CH2)n-COOH Ankan alkanol alkanal axít béo Axetyl-CoA ðối với chất béo: Chất béo triglycerit axít béo palmityl-CoA axetyl-CoA Nguyên liệu cung cấp nguồn nitơ Vi sinh vật cần nitơ ñể xây dựng tế bào tất thành phần quan trọng tế bào có chứa nitơ (protein, axít nucleic, enzym…) Axít amin tạo protein Các axit amin tế bào vi sinh vật ñược tạo thành q trình trao đổi cacbon nitơ Nitơ khơng khí phong phú bền vững mặt hố học có vi sinh vật cố định nitơ có khả đồng hố chúng Cịn nguồn nitơ dùng lên men công nghệ vi sinh vật hợp chất nitơ vô hữu Các axit amin thường khơng vi sinh vật sử dụng trực tiếp mà phải qua loại phản ứng: khử amin khử cacboxil Khử amin: deza aza R-CH-COOH + O2 E → R-C-COOH + NH3 NH2 O Như vậy, có vi sinh vật có khả khử amin có khả sử dụng axit amin Q trình thường xảy vùng pH=6,5 ÷ 7,5 Khi pH vùng axít xảy phản ứng khử cacboxyl: E R-CH-COOH → R-CH2-NH2 + CO2 NH2 (Sản phẩm decacboxyl số axit amin có độc tố, ví dụ: từ lizin cadaverin) Nguồn nitơ hữu thường hợp chất phức tạp nên ñầu tiên vi sinh vật phải tiết vào môi trường enzym proteaza ñể thuỷ phân Các nguồn nitơ vô - Urê: (NH2)2CO + H2O ureaza → 2NH3 + CO2 - HNO3: 4AH2 + HNO3 NH3 + 3H2O AH2 - chất khử có mơi trường Hoặc : HNO3 HNO2 (HNO)2 NH2OH NH3 Quá trình nhờ hệ enzym nitratreductaza Tất loại vi sinh vật đồng hố muối amơn Nhưng để sử dụng nitơ vi sinh vật ñều phải tách NH3 Nguyên liệu cung cấp chất khoáng * Các hợp chất photpho: Ảnh hưởng lớn q trình trao đổi chất tế bào vi sinh vật Trong tế bào vi sinh vật thường gặp hợp chất polyphotphat, chúng có chức tham gia vận chuyển glucose qua màng tế bào dẫn đến q trình photphoril hố glucose Nguồn photpho vơ có loại nguyên liệu hữu Vi sinh vật sử dụng nhanh hợp chất photpho vơ hồ tan, cịn photpho hữu sử dụng chậm Tuy nhiên nhu cầu photpho phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, dư ảnh hưởng xấu * Các chất khoáng khác: Mg, Na, Fe, K, Al, Li, Rb, Mn…lấy từ môi trường dinh dưỡng Các chất có ý nghĩa khác vi sinh vật: có số kim loại tham gia vào cấu tạo phân tử làm thay ñổi hoạt lực enzym Tuy nhiên nồng ñộ chất nằm giới hạn Các chất kích thích sinh trưởng: - Cao ngô - Cao nấm men - Dịch ép trái Chất béo công nghệ vi sinh vật - Dầu béo (lạc, đậu tương, ngơ, lanh…): thường dùng làm cất phá bọt - Mặt khác vi sinh vật có khả tiết enzym lypaza phân huỷ chất béo ñến axetyl-CoA ñồng hố tiếp Chú ý: khơng dùng q nhiều dầu phá bọt ảnh hưởng xấu đến q trình lên men: ñộ nhớt lớn, tạo nhũ tương hạt xà phịng Nước Trong cơng nghệ vi sinh vật nước sử dụng nhiều với nhiều mục đích khác Chất lượng nước có ảnh hưởng đến tiến trình cơng nghệ chất lượng sản phẩm Do đó, tuỳ vào mục đích sử dụng mà phải bảo ñảm yêu cầu tiêu chất lượng nước như: độ cứng, độ oxy hố, vi sinh… 2.3 Các phương pháp lên men Có nhiều cách để phân loại phương pháp lên men Dựa vào cách nạp liệu thu hồi bán thành phẩm sau lên men người ta chia lên men gián ñoạn, liên tục bán liên tục Lên men gián ñoạn thực theo mẻ nên thường có suất thấp chu kì sản xuất bị kéo dài Lên men liên tục ngược lại, nguyên liệu liên tục vào sản phẩm sau lên men liên tục ñi Lên men bán liên tục hình thức kết hợp hai phương pháp Dựa vào thành phần ñồng hay khơng đồng canh trường người ta chia lên men bề mặt (nổi), lên men bề sâu (chìm) bán rắn Trong lên men bề mặt, vi sinh vật phát triển bề mặt môi trường ni cấy lấy khơng khí từ mặt thống mơi trường Phương pháp thường sử dụng để sản xuất axit citric số enzyme Nhược ñiểm lớn phương pháp tốn bề mặt Tuy nhiên, đầu tư nên chừng mực sử dụng Lên men bán rắn phương pháp trung gian lên men bề mặt bề sâu Hàm lượng nước môi trường chiếm khoảng 70% chất khơ Một số enzyme sản xuất theo phương pháp Người ta cải tiến phương pháp thiết bị thùng quay nhằm cung cấp đủ oxy cho q trình lên men thực ln khâu sấy khơ sau lên men ðiều khó khăn truyền nhiệt chất ñộn nên khó thực tốt khâu trùng Lên men chìm phương pháp sử dụng nhiều Nó cho phép kiểm sốt tồn q trình lên men cách thuận lợi, tốn mặt Do hệ thống khuấy trộn tốt nên tồn mơi trường ni cấy hệ thống 2.4 Thu hồi sản phẩm ðể thu hồi sản phẩm phải qua nhiều bước Số lượng bước phụ thuộc vào nguyên liệu ban ñầu, nồng ñộ ban ñầu, ổn ñịnh mặt sinh học sản phẩm mức ñộ yêu cầu ñộ tinh khiết sản phẩm Bước ñầu việc thu hồi sản phẩm tách tế bào sản phẩm khơng hồ tan khỏi dịch lên men cách lọc lắng ðể trích li sản phẩm bên tế bào phải phá vỡ tế bào phương pháp vật lí (siêu âm, ép, lạnh đơng tan giá…) phương pháp hố học (xử lí axit, trích li axeton…) phương pháp sinh học (dùng enzyme) Nếu sử dụng axit sản phẩm phải bền vững môi trường axit Các sản phẩm lên men có mơi trường phải làm ñậm ñặc Các phương pháp thường dùng ñể tách sản phẩm như: lọc, ly tâm, lắng, trích li, sắc kí, đặc, kết tủa, kết tinh, tuyển nổi, sấy khơ, nghiền… CHƯƠNG III: SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT 3.1 Sản xuất protein ñơn bào 3.1.1 Ưu, nhược ñiểm sản xuất protein đơn bào Ưu: - Ít tốn diện tích - Tốc độ sinh trưởng cao: gấp 100 ÷ 1000 lần so với đại gia súc Ví dụ: ñể sản xuất 1t protein cần: + Trồng 4ha đậu tháng + Ni bị 15 ÷ 18 tháng + Ni 300m3 vi sinh vật 24h - Khơng phụ thuộc vào khí hậu - Thành phần giá trị dinh dưỡng sinh khối điều chỉnh cách thay đổi thành phần mơi trường, điều kiện nuối cấy tạo giống - Sử dụng nguyên liệu sẵn có, rẻ tiền Nhược: - Trong sinh khối vi sinh vật chứa nhiều axít nucleic (10 ÷ 20%) khơng có lợi cho sức khoẻ người - Protein vi sinh vật có hương vị chưa cao 3.1.2 Các yêu cầu việc sản xuất protein ñơn bào ðể ñạt ñược hiệu kinh tế cao việc sản xuất sinh khối vi sinh vật cần phải bảo ñảm yêu cầu sau: Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền với thu hoạch cao ðể ñạt ñược suất cao cần lưu ý đến hiệu suất chuyển hố ngun liệu vi sinh vật Các dạng nguyên liệu ñược quan tâm nhiều: - Cacbuahydro: vi sinh vật có khả chuyển hố 100% để tạo thành sinh khối - Hydratcacbon (rỉ ñường, dịch kiềm sunfit, xenluloza, tinh bột, cặn sữa…): vi sinh vật có khả chuyển hố 50% vật chất khơ sang sinh khối Tốc độ sinh trưởng cao: nói chung tốc độ sinh trưởng vi sinh vật lớn, thời gian nhân đơi chúng ngắn Vi khuẩn 0,3-2 Nấm men tảo 2-6 Nấm sợi khoảng 10 ... cacbuahydro: CH 3-( CH2)n-CH3 CH 3-( CH2)n-CH2OH CH 3-( CH2)n-CHO CH 3-( CH2)n-COOH Ankan alkanol alkanal axít béo Axetyl-CoA ðối với chất béo: Chất béo triglycerit axít béo palmityl-CoA axetyl-CoA Nguyên... - Urê: (NH2)2CO + H2O ureaza → 2NH3 + CO2 - HNO3: 4AH2 + HNO3 NH3 + 3H2O AH2 - chất khử có mơi trường Hoặc : HNO3 HNO2 (HNO )2 NH2OH NH3 Quá trình nhờ hệ enzym nitratreductaza Tất loại vi sinh. .. như: - Mỹ: ABBOTT, ATCC, NRRL - Canada: CANAD -2 1 2 - Nhật: FERM, HIR - Úc: CC - Trung quốc: IMASP 2. 1.3 Cải tạo giống vi sinh vật Trừ số ngành công nghệ thực phẩm người ta có sử dụng vi sinh vật