Giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II - Chương 4

Tài liệu tham khảo Giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II - Chương 4 Sản xuất axit amin

6 Xử lí nấm men: Tuỳ theo yêu cầu sản phẩm (ướt khơ) mà q trình xử lí khác ðể thu nhận nấm men ướt tiến hành rửa sinh khối ñã thu ñược ñem ép Nấm men ướt khó bảo quản thời gian bảo quản khơng lâu ðể bảo quản lâu cần phải sấy khô nấm men Khi sấy nấm men ý khơng để nhiệt độ sấy vượt q 300C 3.2.3 Sản xuất men nước: Nguyên liệu: bột, malt chế phẩm amylaza nấm mốc Môi trường nhân giống: bột trộn nước (tỉ lệ 1:3) nấu chin làm nguội 48-50oC bổ sung chế phẩm amylaza (3% malt 0,8 ÷ 1% chế phẩm enzym nấm mốc Asp.awamori Asp.oryzae dịch giống vi khuẩn Giữ 8-14 giờ, mơi trường đạt tới 11 ÷ 12o axít (1o=1ml NaOH 1N/100ml) đưa vào cấy nấm men Dịch giống vi khuẩn: lấy nước malt có nồng độ 12oBx thêm CaCO3 Cấy vi khuẩn Lactobacterium Delbruckii giữ nhiệt độ 50 ÷ 52oC 1÷2 ngày Trước ñưa vào sử dụng phải nhân giống tiếp Cấy nấm men: mơi trường sau axít hố làm nguội đến 28o 30 C tiếp giống nấm men ni cấy trước vào (tỉ lệ 5÷10%), giữ nhiệt độ 14÷15 khơng sục khí sục khí gián đoạn Ở nhiệt độ vi khuẩn lactic ngừng tích tụ axít Nấm men sử dụng đường axít để tăng trưởng sinh khối Trong mơi trường có axít nấm men phát triễn tốt hạn chế vi sinh vật lạ CHƯƠNG IV: SẢN XUẤT AXIT AMIN Axit amin thường bổ sung vào thức ăn cho người gia súc Với mục đích người ta cần đến axit amin khơng thay Trong đó, quan trọng axit amin L-lyzin, L-triptophan, L-methionin, L-treonin Phần lớn loại protein ñược khai thác từ thực vật ñó thiếu axit amin axit amin khác Vì thế, việc bổ sung axit amin vào thực phẩm làm tăng giá trị protein Ngồi ra, axit amin cịn có tính chất làm tăng mùi vị sản phẩm thực phẩm 4.1 Các phương pháp sản xuất axit amin: 4.1.1 Phương pháp tổng hợp hoá học: Phương pháp dùng ñể sản xuất số axit amin như: glyxin, alanin, metyonin, triptophan Phương pháp tổng hợp hoá học thường cho hỗn hợp dạng ñồng phân L- D-axit amin Trong dạng có dạng L-là thích hợp cho dinh dưỡng Do việc tách dạng khó khăn trở nên tốn 4.1.2 Phương pháp trích ly từ dịch thuỷ phân: Phương pháp thường dùng ñể thu nhận L-cystein, L-cystin, L-leuxyn, L-asparagin, L-tyrozin ðể sản xuất axit amin theo phương pháp này, ñầu tiên phải tiến hành thuỷ phân nguyên liệu giàu protein sau dùng phương pháp khác để trích ly axit amin cần sản xuất khỏi dung dịch thuỷ phân 4.1.3 Phương pháp tổng hợp nhờ vi sinh vật: Phương pháp có phương án: Lên men trực tiếp: axit amin ñược tạo thành từ nguyên liệu rẻ tiền nhờ vi sinh vật Chuyển hoá tiền chất axit amin nhờ vi sinh vật Sự lên men trực tiếp có ý nghĩa lớn hồn chỉnh cơng nghệ để sản xuất hàng loạt axit amin 4.2 Sản xuất axit amin nhờ vi sinh vật: 4.2.1 Sự tổng hợp axit amin tế bào vi sinh vật: Hystidin Glucoza Ribozo-5- P Glucozo-6- P Sixtein Eritrozo-4- P 3-P-glyxerat Serin Triptophan Tirozin Semilalanin Pyruvat CH3COCOOH Glyxin α-xetoizovalerat Alanin Valin Lơxin +CO2 Oxalatxetat (HOOCCOCH2COOH) Asparagin Aspartat Fumarat Xitrat α -xetoglutarat Lyzin Treonin Methionin Izolơxin Glutamat Glutanin Prolin Arginin Sơ ñồ 2: Sơ ñồ tổng hợp axit amin tế bào vi sinh vật Các axit amin tế bào vi sinh vật ñược tạo thành trình trao đổi cacbon nitơ Việc tổng hợp axit amin trải qua hàng loạt phản ứng phức tạp với xúc tác nhiều loại enzym khác nhau, qui loại phản ứng amin hoá chuyển amin: Phản ứng amin hố: gồm giai đoạn: • Giai đoạn 1: tạo iminoaxit Giai đoạn khơng có tham gia enzym NH R-CO-COOH + NH3 R-C-COOH + H2O • Giai ñoạn 2: chuyển iminoaxit thành aminoaxit nhờ enzym dehydrogenaza NH NH2 R-C-COOH + H2O dehydrogen   naza → R-C-COOH NADH2 NAD NADH2: nicotinamitadenin dinucleotit dạng khử Phản ứng chuyển amin: phản ứng xảy nhờ xúc tác enzym aminotransferaza NH2 R1 R2 R1-CO-COOH + R2-CH-COOH CH-NH2 + CO COOH COOH 4.2.2 Qui trình cơng nghệ: Ngun liệu xử lí chuẩn bị mơi trường dung dịch cấy vi sinh vật nuôi vi sinh vật giống sản phẩm  xử lí sản phẩm  lên men 1.Nguyên liệu: bảo ñảm cung cấp nguồn cacbon, nitơ nguyên tố khác ñể vi sinh vật phát triển tổng hợp ñược nhiều sản phẩm - Cung cấp nguồn cacbon: dùng rỉ ñường, nguyên liệu giàu tinh bột số loại nguyên liệu khác - Nguồn nitơ: thường dùng urê, dùng loại muối amoni - Các hợp chất khoáng: KH2PO4, MgSO4, MnSO4… - Các chất kích thích sinh trưởng: vitamin, axit amin 2.Xử lí: - Làm - Thuỷ phân 3.Chuẩn bị mơi trường dinh dưỡng: - Có nồng độ thành phần thích hợp phụ thuộc vào chủng vi sinh vật giống sản xuất - ðiều chỉnh pH cho môi trường trùng môi trường 4.Chuẩn bị giống a.Chủng vi sinh vật: ðể sản xuất axit amin người ta sử dụng nhiều chủng vi sinh vật khác nhau, nhiên ñể sản xuất người ta phải tạo biến chủng loại bỏ ức chế sản phẩm cuối vi sinh vật b.Nuôi giống: ðể ñủ lượng giống cho sản xuất người ta phải tiến hành nuôi cấy qua nhiều bước Các chủng vi sinh vật dùng sản xuất axit amin phần lớn ñột biến cấy chuyền nhiều lần gặp thể hồi biến ảnh hưởng ñến sức sản xuất Trong sản xuất axit amin không ñược dùng sinh khối mẻ trước làm giống cho mẻ sau 5.Lên men: Thường sử dụng phương pháp lên men chìm Trong trình lên men cần ý ñiều chỉnh thông số kỹ thuật: nhiệt ñộ lên men, pH mơi trường, thơng khí, bổ sung chất dinh dưỡng, phá bọt số yếu tố khác 6.Thu nhận sản phẩm: Tuỳ thuộc vào loại sản phẩm mục đích sử dụng mà q trình thu nhận sản phẩm khơng giống nhau: • Dùng để chế biến thức ăn gia súc: - Thu nhận dạng canh trường: Hỗn hợp sau lên men cô ñặc bột khô - Tách sinh khối cô ñặc sản phẩm • Dùng chế biến thực phẩm y học: Phải tinh chế qua nhiều cơng đoạn để thu nhận chế phẩm kỹ thuật tinh khiết 4.3 Kỹ thuật sản xuất số axit amin: 4.3.1 Sản xuất L-lyzin: Chủng vi sinh vật: Chủng sản xuất thể ñột biến cần homoxerin Corynebacterium glutamicum (cịn gọi Micrococus glutamicus) Dưới điều kiện lên men thích hợp chủng sản xuất tới 50g lyzin/lit môi trường Nguyên liệu thường dùng glucoza hay mật rỉ với nồng độ 150g/lit Phương trình lên men tổng quát: raffe 22   → 35C6H14N2O2 + 16C8H13O4 + 262CO2 100C6H12O6+219O2+86NH3 Brevib + 380H2O + 1669KJ Cơ chế: Glucoza Pyruvat Oxalaxetat Aspactat β-Aspactyl-photphat Aspactat-β-semialdehyt Lyzin Homoxerin Treonin Methionin Izoleuxin Sơ ñồ 3: Cơ chế tổng hợp lyzin Corynebacterium glutamicum -Enzym aspactokinaza; -Enzym homoxerindehydrogenaza;3 -Enzym dihydropicolinat-syntetaza Lyzin axit amin thuộc họ aspactat ñược tổng hợp qua ñường trao ñổi chất phân nhánh mà qua ñó homoxerin, metionin, treonin, izolơxin ñược tạo thành Những ñường chấm chấm biểu diễn ức chế sản phẩm cuối Ở chủng hoang dại lyzin treonin gây ức chế phối hợp (E) ñối với aspactokinaza(1) Do khuyết homoxerindehydrogenaza(2) mà khơng có tạo thành treonin Dihydropicolinat-Syntetaza(3) không mẫn cảm dị lập thể nên ức chế sản phẩm cuối bị triệt tiêu có tổng hợp thừa lyzin (50g/l) Lên men : Nguồn hydratcacbon thích hợp cho tổng hợp lyzin glucose, fructose, maltose saccarosse Các ñường lactose, rafinose, pentose chủng sinh lyzin khơng đồng hố Cho nên người ta thường sử dụng loại nguyên liệu rỉ ñường, dịch thuỷ phân từ tinh bột (ngơ, sắn) để làm mơi trường sản xuất lyzin Nồng ñộ ñường môi trường lên men khoảng 10-12% Trong q trình lên men, nhằm để tăng hiệu suất thu hồi lyzin bổ sung thêm đường để nâng cao nồng ñộ ñường lên tới 25% (nhưng thận trọng có hiệu suất sinh lyzin khơng tăng mà cịn ảnh hưởng xấu đến vi sinh vật làm tăng áp suất thẩm thấu môi trường) Nguồn nitơ hay dùng urê, NH3 muối amon Tỉ lệ C:N đóng vai trị quan trọng, ảnh hưởng ñến hiệu suất tổng hợp lyzin Thường bổ sung muối amon với hàm lượng khoảng 2% Ngoài cịn phải bổ sung vào mơi trường chất cung cấp nguồn phốtpho KH2PO4 K2HPO4 (bảo ñảm lượng phơtpho đạt 0,0080,02mg/lít; nồng độ lên đến 1,6-2mg/lít tạo thành lyzin bị ngừng) Do khơng nên dùng photphat amon để làm nguồn cung cấp nitơ photpho Phải bổ sung muối có chứa nguyên tố Mg, Fe, Cu, Mn (thường bổ sung MgSO4-0,03%; cịn Fe, Cu, Mn có rỉ đường cao ngơ) Các chất kích thích sinh trưởng: + Biotin: cần khoảng 8-15mg/lít, q (1-2mg/l) sản phẩm chủ yếu axit glutamic, (biotin B1 có cao ngơ, đặc biệt rỉ đường mía có nhiều biotin) + Thiamin(B1): khơng có tạo thành alanin + Treonin: khơng có, kìm hãm phát triễn vi sinh vật dư dẫn tới ức chế sản phẩm cuối Hàm lượng thích hợp khoảng 200-800mg/l + Methionin: ảnh hưởng tới sinh trưởng vi sinh vật, hàm lượng thích hợp: 150-250mg/l Có thể dùng homoxerin để thay cho treonin methionin Bảo đảm mơi trường có pH=7-7,6 phải trùng Lượng giống cho vào ñể lên men 5-10% Nhiệt ñộ lên men 30-32oC, cung cấp O2 2-4g/1l.h; trình lên men dùng urê nước NH3 ñể ñiều chỉnh pH Tổng thời gian lên men 50-72h 5.Thu nhận sản phẩm: Tuỳ vào dạng chế phẩm (dịch ni cấy, dịch đặc, bột tinh thể) mà q trình thu nhận sản phẩm có khác - Dịch nuôi cấy chế phẩm thu ñược sau lên men dùng trực tiếp pha vào thức ăn gia súc - Dung dịch cô ñặc: ñể chống hư hỏng dịch sau lên men axít hố HCl đến pH=5 bổ sung dung dịch NaHSO3 25% (tỉ lệ 0,4% so với dịch lên men) đem chân khơng ñạt nồng ñộ chất khô 35-40% Chế phẩm dùng chăn ni - Bột: từ dịch đặc bổ sung thêm chất ñộn (bột xương, cám…) sấy khơ nghiền nhỏ Hoặc dịch đặc ñem sấy phun ñể thu chế phẩm dạng bột - ðể thu nhận tinh thể lyzin phải sử dụng nhiều phương pháp tiến hành qua nhiều bước: Hỗn hợp sau lên men lọc (li tâm) sinh khối dung dịch nhả hấp phụtrao ñổi ion Dùng dung dịch NH4OH 2-3,5% để nhả hấp phụ Dùng HCl axit hố ñến pH=5 cô ñặc ñến ñạt nồng ñộ 30-50% làm lạnh 10-12oC để trợ tinh ðể có chế phẩm tinh khiết đem tinh thể kết tinh lần kết tinh lại nhiều lần (hoà tan vào cồn) 4.3.2 Sản xuất L-treonin: Cho ñến treonin chưa ñược sản xuất qui mơ lớn đường vi sinh vật việc gây tạo thể đột biến tổng hợp thừa L-treonin gặp nhiều khó khăn so với lyzin Có thể đạt sản xuất thừa treonin nhờ bước đột biến sau: - Mất tính mẫn cảm dị lập thể homoxerindehydrogenaza mẫn cảm với treonin - Trợ dưỡng izolơxin - Trợ dưỡng metionin 4.3.3 Sản xuất L-triptophan: Nhờ vào tổng hợp vi sinh vật, L-triptophan thu nhận hai ñường: chuyển tiền chất triptophan thành triptophan nhờ giúp ñỡ hệ enzym vi sinh vật; thu nhận triptophan nhờ ñột biến thiếu tirozin fenilalanin chủng vi sinh vật 4.3.3.1 Phương pháp chuyển tiền chất: Tiền chất: Nhờ vi sinh vật thu nhận triptophan từ tiền chất khác Hiệu suất thu hồi sản phẩm từ tiền chất khác không giống Một số tiền chất hay sử dụng: Axit antranilic hiệu suất thu hồi 98,8% Indol 87,2% Indol + Cerin (1:2) 92,5% Indol + Cistein (1:2) 89,5% Indol + Alanin (1:4) 87,0% Chủng vi sinh vật: ðể chuyển tiền chất người ta sử dụng nhiều chủng vi sinh vật khác Riêng ñối với axit antranilic người ta hay dùng nấm men Candida utilis Hansunella 3 Cơ chế: Khi sử dụng axit antranilic làm tièn chất chế trình sau: COOH NH2 NH indol axit antranilic COOH CH2─CH─COOH+H2O  NH2 piridoxalfotfat HOCH2─CHNH2+ serin NH NH Triptophan Sơ ñồ 4: Cơ chế chuyển axit antranilic thành triptophan Kỹ thuật lên men: Q trình sản xuất chia làm hai giai đoạn: thu nhận sinh khối chuyển hoá tiền chất nhờ giúp ñỡ sinh khối ñã thu nhận ñược Giai đoạn đầu khơng khác so với q trình ni cấy loại vi sinh vật giống khác Tức q trình từ ống giống gốc ống nghiệm bình tam giác…lượng sinh khối thu phụ thuộc vào phương pháp nuôi cấy giống Họ thấy lượng giống đưa vào lên men lớn mức độ chuyển hố axít antranilic lớn Nguồn cung cấp cacbon cho giống phát triễn sacaroza mật rỉ (với hàm lượng từ 6,3-20%), nguồn cung cấp nitơ urê với lượng từ 0,5-1% Ngồi cịn bổ sung thêm (%): K2HPO4-0,01, MgSO4-0,005,CaCl2-0,01 Bảo đảm mơi trường có pH=7,5÷8 vơ trùng Tiến hành ni giống nhiệt độ 28÷300C, thời gian ni cấp khơng q 24 u cầu giống đạt 3÷5 gam sinh khối khơ/1lít mơi trường Giai đoạn hai thực thiết bị lên men ðầu tiên chuẩn bị môi trường nuôi giống thiết bị lên men chuyển men giống ñã nuôi giai ñoạn vào Tiếp tục nuôi giống 24 nhiệt độ 28÷300C thơng khí khơng 7g O2/l.h Nếu q trình ni giống có xuất bọt phải dùng dầu phá bọt Sau 24 nuôi giống cho vào thiết bị lên men dung dịch axít antranilic 5% rượu dung dịch amoniac 50% ñể lên men Lúc thơng khí bảo đảm cung cấp 3÷4 gam O2/l.h Sau cho dung dịch axít vào 3-4 bổ sung thêm dung dịch rỉ ñường 25% Tiếp theo, sau 12 bổ sung dung dịch rỉ ñường, sau bổ sung dung dịch ammoniac axit antranilic lần Tổng thời gian giai đoạn 120÷140 Q trình lên men (giai ñoạn 2) thực pH môi trường ≈ 8,0 nhiệt ñộ lên men khoảng 300C Thu nhận sản phẩm: Dung dịch sau lên men có chứa 7,8÷12,5% chất khơ, có 0,3÷0,5% triptophan Phần lớn triptophan (85÷88%) nằm pha lỏng Do để thu nhận chế phẩm tinh khiết phải tinh chế dịch lọc Cịn dùng cho chăn ni sử dụng dạng đặc có sinh khối nấm men ðể làm thức ăn gia súc dịch sau lên men đem đặc cịn lại 1/3 thể tích, sau ñem sấy thiết bị sấy phun (to=110÷120oC) ñể thu nhận bột dùng bổ sung cho thức ăn gia súc Trong thành phần bột gồm có: - Chất khơ 90% - Protein 48÷54% - Triptophan 1÷3% - Vitamin (mg/kg): + B1 : 15÷18,5 + B2 : 24,5÷32,5 + PP : 620÷680 - Axit amin khác 6% Trong có chứa nhiều axit amin như: lyzin, histidin, treonin, xerin, glutamate, prolin, glyxin, valin, tirozin, phenilalanin, acparagin, acginin… ðể thu nhận chế phẩm triptophan tinh khiết phái qua bước sau: - Tách sinh khối li tâm - Dùng HCl axit hố đến pH = tách kết tủa - Tiến hành trao ñổi ion - Nhả hấp phụ nhờ dung dịch ammoniac 5% - Cơ đặc dung dịch nhiệt độ 60÷700C - Làm lạnh đến 4÷60C để trợ tinh - Tách tinh thể triptophan - Rửa tinh thể rượu etylic - Sấy tinh thể nhiệt ñộ 600C Các phế liệu q trình tinh chế dùng cho chăn ni 4.3.3.2 Thu nhận nhờ chủng đột biến: Sự thu nhận triptophan tirozin phenilalanin thực chủng đột biến E coli Bacillus subtilis Quá trình tổng hợp tirozin, triptophan phenilalanin ñi theo sơ ñồ sau: Glucose Axit fotfoenol pyruvic Eritrozo-4- P Axit skimic Axit corismic Axit antranilic Triptophan Axit prephenic Axit phenylpyruvic Axit hydroxyphenylpyruvic Phenylalanine Tirozin Sơ ñồ 5: Cơ chế tổng hợp triptophan, phenilalanin, tirozin tế bào vi sinh vật ðể tổng hợp thừa triptophan người ta dùng chủng e coli trợ dưỡng tirozin phenylalanine CHƯƠNG V: SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYM 5.1 Những tính chất ưu việt enzyme Enzym chất xúc tác sinh học Nó có đầy đủ tính chất chất xúc tác hố học, ngồi cịn có ưu việt sau: Có tính chun hố cao (tính đặc hiệu): enzyme tác dụng lên chất định theo ý muốn mà khơng gây nên biến đổi khác Ví dụ: amylaza thuỷ phân tinh bột, proteaza thuỷ phân protein.v.v Cường lực xúc tác lớn: với lượng nhỏ enzyme làm xúc tác để chuyển hố lượng chất lớn Ví dụ: 1g pepxin có khả thuỷ phân 50kg trứng, 1g rennin làm đơng tụ 72 sữa, 1mol catalaza làm chuyển hoá 5x106mol H2O2 giây Tác dụng ñiều kiện êm dịu: phần lớn enzyme hoạt động nhiệt độ khơng cao, pH thường trung tính áp suất thường Enzym khơng độc hại: tất loại enzyme có nguồn gốc từ sinh vật nên khơng độc hại sức khỏe người Chính ưu việt mà năm gần chế phẩm enzyme sử dụng rộng rãi ngành cơng nghiệp enzyme phát triển khơng ngừng 5.2 Nguồn ngun liệu để thu nhận enzyme: Enzyme thu nhận từ nhiều nguồn nguyên liệu khác như: ñộng vật, thực vật vi sinh vật  ... R1 R2 R1-CO-COOH + R2-CH-COOH CH-NH2 + CO COOH COOH 4. 2.2 Qui trình cơng nghệ: Ngun liệu xử lí chuẩn bị mơi trường dung dịch cấy vi sinh vật nuôi vi sinh vật giống sản phẩm  xử lí sản phẩm ... bào vi sinh vật: Hystidin Glucoza Ribozo- 5- P Glucozo- 6- P Sixtein Eritrozo- 4- P 3-P-glyxerat Serin Triptophan Tirozin Semilalanin Pyruvat CH3COCOOH Glyxin α-xetoizovalerat Alanin Valin Lơxin +CO2... - Tách sinh khối đặc sản phẩm • Dùng chế biến thực phẩm y học: Phải tinh chế qua nhiều cơng đoạn để thu nhận chế phẩm kỹ thuật tinh khiết 4. 3 Kỹ thuật sản xuất số axit amin: 4. 3.1 Sản xuất L-lyzin: