Giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II - Chương 5

Tài liệu tham khảo Giáo trình công nghệ sinh học thực phẩm II - Chương 5 Sản xuất chế phẩm enzym

Glucose Axit fotfoenol pyruvic Eritrozo-4- P Axit skimic Axit corismic Axit antranilic Triptophan Axit prephenic Axit phenylpyruvic Axit hydroxyphenylpyruvic Phenylalanine Tirozin Sơ ñồ 5: Cơ chế tổng hợp triptophan, phenilalanin, tirozin tế bào vi sinh vật ðể tổng hợp thừa triptophan người ta dùng chủng e coli trợ dưỡng tirozin phenylalanine CHƯƠNG V: SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYM 5.1 Những tính chất ưu việt enzyme Enzym chất xúc tác sinh học Nó có đầy đủ tính chất chất xúc tác hố học, ngồi cịn có ưu việt sau: Có tính chun hố cao (tính đặc hiệu): enzyme tác dụng lên chất định theo ý muốn mà khơng gây nên biến đổi khác Ví dụ: amylaza thuỷ phân tinh bột, proteaza thuỷ phân protein.v.v Cường lực xúc tác lớn: với lượng nhỏ enzyme làm xúc tác để chuyển hố lượng chất lớn Ví dụ: 1g pepxin có khả thuỷ phân 50kg trứng, 1g rennin làm đơng tụ 72 sữa, 1mol catalaza làm chuyển hố 5x106mol H2O2 giây Tác dụng ñiều kiện êm dịu: phần lớn enzyme hoạt động nhiệt độ khơng cao, pH thường trung tính áp suất thường Enzym khơng độc hại: tất loại enzyme có nguồn gốc từ sinh vật nên khơng độc hại sức khỏe người Chính ưu việt mà năm gần chế phẩm enzyme ñược sử dụng rộng rãi ngành cơng nghiệp enzyme phát triển khơng ngừng 5.2 Nguồn ngun liệu để thu nhận enzyme: Enzyme thu nhận từ nhiều nguồn nguyên liệu khác như: ñộng vật, thực vật vi sinh vật 5.2.1 ðộng vật: Enzyme nằm quan nội tạng ñộng vật: - Tuỵ tạng: chứa nhiều enzyme amylaza, maltaza, proteaza, esteraza, lipaza.v.v - Dạ dày chứa nhiều enzyme pepxin, enzyme tiêu hoá (trong ngăn thứ tư dày bị có loại vi khuẩn có khả sinh tổng hợp xenlulaza), dày bê nghé có chứa enzyme rennin làm đơng tụ sữa - Ruột: chứa chủ yếu enzyme enterokinaza có khả phá vỡ liên kết peptit - Gan: quan chứa nhiều enzyme Không thể thu enzyme từ động vật qui mơ cơng nghiệp thời gian ni động vật q dài nên khơng kinh tế 5.2.2 Thực vật: Người ta thu số enzyme thực vật thượng ñẳng thu papain từ ñu ñủ, bromelain từ dứa, amylaza từ malt, plazmin (cả papain) từ họ ficus (sung, vả) Trong họ ñậu có enzyme ureaza Trong thuốc có chứa enzyme amylaza, esteraza, pectinaza, proteaza Trong chè có chứa nhiều enzyme oxy hoá khử polyphenoloxydaza Trong rau chứa nhiều loại enzyme khác Thu enzyme từ thực vật khơng kinh tế muốn có nhiều thực vật phải trồng nên phải có đất chi phí tốn việc chăm bón 5.2.3 Vi sinh vật: So với động vật thực vật việc thu nhận enzyme từ vi sinh vật có nhiều lợi - Từ vi sinh vật thu nhận ñược nhiều enzyme khác nhau, ñó có loại khơng thể thu nhận từ động vật thực vật - Bằng cách thay đổi điều kiện ni cấy dùng tác nhân điều chỉnh người ta ñiều khiển trình sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật theo ý muốn - Vi sinh vật có khả sinh sản phát triển nhanh, tổng hợp enzyme với tốc ñộ lớn thời gian ngắn Chính việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật tốn thời gian - Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính mạnh, vượt xa enzyme từ nguồn sinh vật khác - Vi sinh vật có khả sinh sản, phát triển tổng hợp enzyme môi trường dinh dưỡng đơn giản, dễ kiếm rẽ tiền (có thể phế liệu ngành sản xuất khác nhau) Cho nên việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật kinh tế Chính lợi nên nguồn enzyme từ vi sinh vật đưa vào ngành sản xuất chế phẩm enzyme công nghiệp Bảng 1: Khả sử dụng loại enzyme từ vi sinh vật Loại enzyme Vi sinh vật Sử dụng Amylaza Bacillus Subtilis, Bacillus Bia rượu (phân huỷ tinh bột Stearotherophilus thành ñường lên men, sản xuất nha) Asp.niger Sản xuất bánh mì, bánh α-amylaza Asp.oryzac (thuỷ phân phần tinh bột) Glucoamylaza Asp.niger Sản xuất glucoza, bia (làm Asp.oryzac giảm hàm lượng dextrin) Endomycopsis bispora Pectnaza Asp.niger Sản xuất làm dịch quả, Asp.oryzac chế phẩm rau cho dinh Sclerotinia libertina dưỡng trẻ sơ sinh Các xenluloza Trichoderma viride CN thực phẩm (làm tan thành tế bào thực vật rau), rượu (thu nhận ñường từ xenluloza) ðextranaza Penicillium funiculorum Sản xuất dexran với kích thước phân tử ñịnh Chất bổ sung cho thuốc ñánh Invectaza Sacch.Cerevisiac Dịch hố đường để làm keo, sản xuất mật ong nhân tạo Các proteaza Bacil.Subtilis, Bacil.Cereus Bổ sung vào bột giặt ñể loại Bacil.Stearotheroopilus, protein, làm mềm thịt, chất trợ Streptomyces griseus, tiêu hố, dùng cơng nghệ Asp.oryzac làm phim Enzym làm đơng Mucor pusillus Sản xuất fomat sữa Keratinaza Streptomyces fradiac Ngành da (khử lông) Bảo quản thực phẩm (loại O2) β-galactozidaza Asp.niger, Pen.notatum Xác ñịnh glucoza (chẩn ñoán bệnh ñái ñường) Streptokinaza Streptococcus, ðiều trị (tiêu cục nghẽn) Spec.chotridium ðiều trị vết thương, vết histolyticum bỏng L-asparaginaza Eschericha coli, Erivinia ðiều trị bệnh bạch cầu aroidac Penixilinazylaza Escherichia coli SX penixilin bán tổng hợp 5.3 Sản xuất enzym từ vi sinh vật: Q trình sản xuất gồm giai đoạn: - Tuyển chọn vi sinh vật cải tạo giống - Nuôi cấy vi sinh vật - Tách tinh chế enzym 5.3.1 Tuyển chọn vi sinh vật cải tạo giống: Tuyển chọn: Khả tạo enzym vi sinh vật ña dạng phong phú Mỗi loại enzym thu nhận từ nhiều chủng vi sinh vật khác ngược lại chủng vi sinh vật có khả sinh nhiều loại enzym Ví dụ: Aspergillus oryzae Amylaza thu nhận nhờ Bacillus Subtilis Bac.Stearothermophilus α-Amylaza Asp.niger Asp.oryzae Asp.awamori Glucoamylaza Asp.oryzae, niger Endomycopsis, awamori Asp.niger Pectinaza Asp oryzae Asp.awamori Asp.oryzae Proteaza Bac.Subtilis Streptomyces griseus Proteinaza Asp.awamori, flavus, Candidus Bac.mesentericus, Bac.Subtilis Xenlulaza Trichoderma viride Asp.terreus Khả sinh enzym chủng vi sinh vật không giống khác chủng Vì vậy, tuyển chọn vi sinh vật phải tiến hành tìm kiếm, phân lập, lựa chọn hàng chục, hàng trăm chí đến hàng nghìn giống vi sinh vật khác có chủng vi sinh vật có hoạt lực cao việc tạo enzym cần thiết Cải tạo giống: ðể nâng cao sức sản xuất enzym vi sinh vật làm tăng cường hoạt tính enzym người ta phải sử dụng phương pháp khác ñể cải tạo giống, ñặc biệt phương pháp gây ñột biến Bằng phương pháp ñột biến nhiều nước ñã thu ñược chủng vi sinh vật có đặc tính tốt, tổng hợp vài ba enzym ñều có hoạt tính cao so với chủng ngun thuỷ ban ñầu 5.3.2 Nuôi vi sinh vật: 5.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng tới tổng hợp enzym: Ảnh hưởng thành phần môi trường dinh dưỡng: Là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến phát triển tổng hợp enzym vi sinh vật Cùng loại vi sinh vật nuôi cấy mơi trường có thành phần dinh dưỡng khác mức ñộ tạo thành enzym thành phần enzym ñược tạo thành khác Ví dụ: ni Asp.oryzae phương pháp bề mặt mơi trường cám đại mạch tạo nhiều enzym, có loại enzym có hoạt tính cao amylaza, proteaza, maltaza, pectinaza, invectaza, ribonucleaza Nhưng nuôi môi trường Kzapek cải tiến với nitrat tinh bột tạo thành chủ yếu α-amylaza, enzym khác tạo thành với lượng khơng đáng kể Hiện tượng ñược giải thích lý thuyết sinh tổng hợp cảm ứng enzym Hiện tượng cảm ứng thấy vi sinh vật khơng thấy động thực vật Khi mơi trường có chất khó đồng hố vi sinh vật phải tiết vào mơi trường enzym tương ứng để phân huỷ thành chất đồng hố Cho nên thêm chất cảm ứng vào môi trường dinh dưỡng khả sinh tổng hợp enzym vi sinh vật tăng lên gấp nhiều lần so với trường hợp bình thường ðịnh nghĩa: Một trình sinh tổng hợp gọi cảm ứng xảy mức ñộ ñáng kể mơi trường có chất đặc hiệu enzym chất trao đổi có cấu trúc tương tự chất Các enzym thuộc loại gọi enzym cảm ứng, chất kích thích q trình tổng hợp gọi chất cảm ứng Muốn tổng hợp ñược enzym cảm ứng cần có ñiều kiện: - Thứ nhất: Có gen tương ứng nhiễm sắc thể - Thứ hai: Có ngun liệu đầy đủ để xây dựng phân tử enzyme (các axit amin, hợp phần coenzyme) -Thứ ba: Có lượng cần thiết cho việc tổng hợp enzyme - Thứ tư: Có chất cảm ứng Nếu có đủ điều kiện thiếu chất cảm ứng enzyme khơng tạo thành Trong công nghệ sản xuất enzyme cần phải lựa chọn chất cảm ứng thích hợp xác định nồng độ tối ưu mơi trường để có hiệu suất sinh tổng hợp cao Ảnh hưởng độ ẩm: Trong phương pháp ni cấy bề mặt, độ ẩm mơi trường có vị trí đặc biệt quan trọng Khi ñộ ẩm thấp vi sinh vật bị rơi vào tình trạng bất lợi cho hoạt động sống nên có khuynh hướng tạo bào tử hạn chế tổng hợp enzyme Khi độ ẩm q cao độ tơi xốp thống khí canh trường bị giảm, tổng hợp enzyme khó khăn ðộ ẩm cho phép vi sinh vật tổng hợp enzyme tốt thường từ 53÷65%, phụ thuộc vào đặc điểm sinh lí vi sinh vật, vào cấu trúc học mơi trường điều kiện ẩm mơi trường nuôi cấy pH môi trường: So với phương pháp ni chìm phương pháp bề mặt chịu ảnh hưởng pH mơi trường đến q trình sinh tổng hợp enzyme q trình ni pH mơi trường ổn định Với phương pháp ni cấy chìm pH mơi trường biến đổi rõ rệt q trình ni gây ảnh hưởng lớn tới tổng hợp enzyme Do đó, người ta thường điều chỉnh pH ñể thu ñược enzyme với hiệu suất cao Mỗi loại enzyme thường ñược tổng hợp mạnh vùng pH xác ñịnh ñối với loại vi sinh vật Ví dụ: amylaza pectinaza nấm mốc tổng hợp mạnh mơi trường có pH=4,5÷5, cịn proteaza mơi trường có pH=6÷6,5 Nhiệt độ: Phần lớn vi sinh vật có khả tổng hợp mạnh enzyme thuộc loại ưa nhiệt trung bình, có nhiệt độ tối thích 22÷320C Với vi khuẩn có loại thích nhiệt độ cao (35÷550C) chúng có khả tổng hợp enzyme có độ bền nhiệt cao Khi nâng nhiệt độ mơi trường tới q mức thích hợp khả sinh tổng hợp enzyme bị giảm rõ rệt Oxy: ðể vi sinh vật sinh trưởng phát triển phải có oxy Do đó, thời kỳ tích luỹ sinh khối phải cung cấp ñầy ñủ oxy cho môi trường Thời gian nuôi: Thời gian ni cấy thích hợp loại vi sinh vật ñược xác ñịnh thời gian cho phép tích tụ enzyme tối đa Thời gian phụ thuộc vào chủng vi sinh vật phụ thuộc vào enzyme chúng tổng hợp 5.3.2.2 Lựa chọn môi trường nuôi cấy: Thành phần môi trường dinh dưỡng yếu tố có ảnh hưởng định đến hoạt ñộng sống vi sinh vật khả sinh tổng hợp enzyme chúng ðể bảo ñảm yêu cầu tối thiểu cho vi sinh vật phát triển tổng hợp enzyme mơi trường cần có chất chứa cacbon, nitơ, hydro, oxy chất khoáng Mg, Ca, P,Sự, Fe, K v.v - Nguồn cung cấp cacbon thường dùng gluxit Khi sử dụng ñường cần nhớ số ñường có tác dụng kìm hãm sinh tổng hợp số enzyme thuỷ phân Ví dụ: đường glucose kìm hãm sinh tổng hợp số enzyme hệ amylaza Ngoài gluxit sử dụng nguồn cacbon khác mỡ, dầu, axit hữu cơ, rượu Trong số axit hữư axit lactic vi sinh vật hấp thụ dễ dàng Axit có nhiều nước chiết ngơ Cho nên cao ngơ dùng vừa nguồn bổ sung ñạm vừa nguồn cung cấp cacbon cho vi sinh vật phát triển - Nguồn cung cấp nitơ hợp chất hữu vơ Các hợp chất hữu hợp chất giàu đạm cao ngơ, bột đậu tương, khơ đậu, khô lạc… Nguồn nitơ vô urê, NH3, muối amơn Ngồi ra, số axit amin, bazơ purin (adenine, guanine…), pyrimidin bổ sung vào mơi trường ni cấy Các axit amin có tác dụng khác ñối với vi sinh vật việc sinh tổng hợp enzyme Nhiều axit amin có khả tăng cường sinh tổng hợp enzyme, số khác lại kìm hãm khơng có ảnh hưởng rõ rệt - Các ngun tố khống có ảnh hưởng rõ rệt đến q trình sinh tổng hợp enzyme Các nguyên tố bao gồm nguyên tố ña lượng vi lượng Vi lượng sắt, kẽm, ñồng, coban Các nguyên tố thường có nước thành phần hữu khác mơi trường (bột, cao ngơ) không cần bổ sung bổ sung dạng vết Nồng ñộ nguyên tố tăng kìm hãm mạnh phát triển vi sinh vật Các nguyên tố ña lượng ñược ñưa vào dạng muối vơ cần tính hàm lượng chúng có sẵn thành phần mơi trường Trong nguyên tố cần lưu ý ñến P S nguyên tố thành phần cấu tạo nhiều chất quan trọng, nucleotit, lipit, vitamin… - Các yếu tố sinh trưởng: vitamin chủ yếu dùng để kích thích sinh trưởng vi sinh vật Tuy nhiên cần nhớ rằng, nhiều trường hợp mơi trường thích hợp cho sinh trưởng vi sinh vật chưa thích hợp để sinh tổng hợp enzyme Có mơi trường kìm hãm tích luỹ sinh khối tế bào tăng cường sing tổng hợp enzyme ðể xác ñịnh thành phần mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho vi sinh vật tiến hành lựa chọn sở kinh nghiệm dùng phương pháp toán học qui hoạch thực nghiệm Khi lựa chọn nguyên liệu ñể chuẩn bị môi trường cần ý rằng, nguyên liệu tự nhiên có chứa nhiều chất khác nhau, kể ngun tố khống đa lượng vi lượng có yếu tố sinh trưởng Do vậy, nhiều trường hợp không cần bổ sung thêm loại muối vô Mặt khác, nguyên liệu rẻ tiền thường dùng cơng nghiệp để sản xuất chế phẩm enzyme từ vi sinh vật Các nguyên liệu tự nhiên thường dùng ñể chuẩn bị môi trường cám gạo, bột ngô, bột ñậu tương, khô lạc phế liệu men bia, rỉ đường… Trong ngun liệu cám gạo bột ngơ nguồn cacbon tốt Cịn nấm men bia tự phân, khô lạc nguồn nitơ tốt Khi chuẩn bị mơi trường cịn cần phải ý đến chất có tác dụng điều hồ sinh tổng hợp enzyme, ñặc biệt chất cảm ứng ðối với loại enzyme có nhiều chất cảm ứng phải lựa chọn chất cảm ứng có hiệu Ví dụ chất cảm ứng sinh tổng hợp amylaza tinh bột, dextrin; proteaza protein có trọng lượng phân tử nhỏ Sử dụng chất cảm ứng thường làm tăng ñáng kể lượng enzyme ñược tổng hợp Tuy nhiên, lựa chọn chất cảm ứng cần tính tốn cẩn thận giá thành 5.3.2.3 Các phương pháp ni cấy vi sinh vật: Có nhiều phương pháp khác ñể nuôi vi sinh vật tổng hợp enzyme Phương pháp bề mặt: Phương pháp thích hợp để ni loại nấm mốc khả phát triển nhanh, mạnh nên tạp nhiễm • Qui trinh cơng nghệ: Mơi trường phối trộn làm ẩm hấp đánh tơi làm nguội gieo mốc giống vào thiết bị ni vào phịng ni ni mốc canh trường Các chất dinh dưỡng thường nguyên liệu tự nhiên chất thải công nghệ thực phẩm hỗn hợp nhiều chất Trong môi trường cần thêm chất cảm ứng cần thiết cho tổng hợp enzym bổ sung thêm chất dinh dưỡng nguồn nitơ, photpho nước chiết ngô, khoai tây, dịch tự phân nấm men…ðể bảo đảm độ xốp mơi trường cần có chất làm xốp trấu (10÷20%) Trước gieo cấy cần trùng mơi trường để đảm bảo khơng bị nhiễm vi sinh vật lạ Q trình ni cấy kéo dài từ 33÷48h Có tượng: - Thải nhiệt, cần giữ to=28÷32oC - Giảm ẩm, giữ ϕphịng=96÷100% - Cung cấp O2: trình mốc phát triển lấy O2 thải CO2 cần cung cấp khơng khí vơ trùng • Ưu nhược ñiểm phương pháp: Ưu: - Cho nồng ñộ enzym cao so với phương pháp bề mặt - Có thể sấy khơ nhanh chóng mơi trường (dạng thơ) mà khơng ảnh hưởng đến hoạt lực enzym - Tránh nhiễm trùng toàn khối canh trường - Tốn điện Nhược: - Khó giới hố, tự động hố - Năng suất thấp - Tốn nhiều lao ñộng - Tốn nhiều mặt Phương pháp ni cấy chìm: • Với phương pháp vi sinh vật phát triển mơi trường lỏng có sục khí khuấy ñảo liên tục Nguồn cacbon sử dụng phương pháp tinh bột, chất thải có ñường rỉ ñường nguyên liệu khác Nguồn nitơ hay dùng chất hữu cao ngô, dịch men bia, dịch thuỷ phân, khơ lạc…Ngồi thành phần môi trường cần bổ sung thêm chất khống Mơi trường cần trùng cách sục trực tiếp to=121÷125oC thời gian 60÷90 phút mơi trường chứa ngun liệu bột, đạm thơ 20÷30 phút với loại mơi trường có chứa đường Trong q trình ni cấy chìm cần phải sục khí vơ trùng khuấy đảo liên tục Nếu có bọt phải dùng dầu phá bọt Thời gian từ 1÷4 ngày tuỳ chủng Phải ý điều chỉnh pH • Ưu, nhược: + Ưu: - Tiết kiệm diện tích - Dể giới hố, tự động hố - Sử dụng hợp lí chất dinh dưỡng, tránh lãng phí - Thu enzym tạp chất - ðảm bảo vệ sinh, vơ trùng nên nhiễm vi sinh vật lạ + Nhược: - Nồng ñộ enzym thấp, cần làm ñặc canh trường trước tách nên giá thàcao - Tốn ñiện sục khí - Nếu khơng đảm bảo vơ trùng nhiễm hàng loạt Phương pháp ni chìm bước: - Bước 1: vi sinh vật nuôi thiết bị ñể phát triển tối ña - Bước 2: chuyển sinh khối sang thiết bị khác ñể sinh tổng hợp enzym 5.3.3 Tách tinh chế enzym: Trong thực tế enzym ñược sử dụng nhiều dạng khác Một số lĩnh vực sử dụng dạng canh trường khơ mà chất lượng sản phẩm khơng thay đổi (như sản xuất rượu, công nghệ thuộc da) ða số ngành công nghiệp (chủ yếu thực phẩm cơng nghiệp nhẹ) địi hỏi phải sử dụng chế phẩm enzym (gọi chế phẩm kỹ thuật) Còn y học phải sử dụng chế phẩm enzym tinh khiết Tuy nhiên, chưa tìm phương pháp chung để tách enzym mà phải phối hợp nhiều phương pháp khác Quá trình làm enzym gồm giai đoạn chiết enzym tách enzym 5.3.3.1 Chiết enzym: Mục đích cơng đoạn tách enzym khỏi canh trường sau lên men Quá trình phụ thuộc vào loại enzym (ngoại bào hay nội bào) môi trường lên men (lỏng rắn) mà tiến hành khác ðối với enzym ngoại bào nằm canh trường lỏng tiến hành tách sinh khối để thu dung dịch có chứa enzyme Nếu enzym ngoại bào nằm canh trường rắn (xốp) dùng nước vơ trùng dung dịch đệm thích hợp để chiết enzym ðể thu enzym nội bào phải tiến hành phá vỡ tế bào phương pháp sau: - Phương pháp đồng hố (nghiền máy đồng hố) - Nghiền với bột thuỷ tinh, cát… - Tự phân - Làm lạnh đơng tan giá lặp lặp lại nhiều lần - Nhờ tác ñộng siêu âm - Dùng áp suất thẩm thấu cao - Phương pháp khuyếch tán Sau phá vỡ tế bào dùng nước cất dung dịch muối loãng dung dịch ñệm thích hợp ñể chiết enzym 5.3.3.2 Tách enzym: Mục ñích giai ñoạn làm tách enzym khỏi hỗn hợp phụ thuộc vào mức ñộ tinh chế phẩm enzym mà trình tách khác Thu nhận chế phẩm kỹ thuật: Chế phẩm enzym kỹ thuật chế phẩm enzym tinh chế sơ chứa vài enzym chủ yếu ðể thu chế phẩm enzym kỹ thuật phải đặc dung dịch enzym nhiệt ñộ 30oC cho ñến ñạt nồng độ 20g/lit Sau tiếp tục nhiệt độ 40oC cho đạt nồng độ 30÷50g/lit Khi cho thêm chất bảo quản chất ổn ñịnh Tiếp theo đem sấy phun với nhiệt độ khơng vượt q 70oC Ngồi để thu chế phẩm enzym kỹ thuật người ta kết tủa dung mơi hữu muối trung tính sau cho chất ổn định vào sấy khơ nghiền Dung môi hữu thường dùng rượu etylic, izopropylic, axeton…kết tủa dung môi hữu dựa nguyên tắc thêm dung mơi vào dung dịch enzym lực hút phân tử protein-enzym tích điện phân tử nước bao quanh chúng bị giảm Khi nồng ñộ dung môi thêm vào ñạt ñến mức làm cho lượng hydrat hoá phân tử nước protein nhỏ lượng liên hợp phân tử protein-enzym lúc phân tử proteinenzym liên hợp lại tạo kết tủa Tuỳ theo tính chất enzym dung môi hữu mà loại enzym kết tủa nồng độ dung mơi khác Ví dụ proteaza kết tủa etanol 76÷78%, α-amylaza kết tủa etanol 70%, glucoamylaza kết tủa etanol 45% axeton 70% Dùng dung môi hữu có ưu điểm cất thu hồi Nhưng dung môi dễ làm cho enzym bị vô hoạt ðể khắc phục nhược điểm phải tiến hành kết tủa enzym nhiệt ñộ thấp (5oC) thời gian ngắn Các muối trung tính thường dùng để kết tủa enzym là: (NH4)2SO4, NaCl…tuỳ theo tính chất loại enzym mà người ta dùng nồng độ muối khác Ví dụ amylaza thường kết tủa (NH4)2SO4 nồng ñộ 0,75% độ bão hồ; glucoamylaza nồng độ 0,8÷0,9% độ bão hồ Phương pháp dùng muối trung tính kết tủa cịn gọi diêm tích Phương pháp dựa nguyên tắc ion muối có tác dụng phá vỡ lớp hydrat bao quanh phân tử protein hút phân tử trái dấu phía Kết làm phân tử protein bị nước đơng tụ Sau kết tủa phải loại muối trung tính khỏi enzym phương pháp thẩm tích ðể thực người ta cho enzym vào màng bán thấm (xenlofan) cho vào dung dịch đệm thích hợp ngâm 24 sau thử lại loại hết muối đưa xử lí tiếp Thu nhận chế phẩm tinh khiết: ðể thu nhận chế phẩm tinh khiết phải kết hợp nhiều phương pháp qua nhiều giai ñoạn ðầu tiên phải tiến hành loại bỏ protein khơng hoạt động phương pháp biến tính chọn lọc Các protein biến tính tách cách lọc ly tâm Sau enzym kết tủa dung mơi hữu muối trung tính Tiếp theo dùng sắc kí (sắc kí trao đổi ion, hấp phụ, phân bố, gel phân tử v.v ) để thu phân đoạn enzym có hoạt lực cao Sau tinh chế xong phải dùng phương pháp ñiện di ñể kiểm tra mức ñộ ñồng enzym 5.4 ðánh giá chất lượng enzym: 5.4.1 Phương pháp ñánh giá: Chất lượng enzym ñược ñánh giá mức ñộ hoạt ñộng tức hoạt ñộ enzyme Thực tế người ta ño hoạt độ enzym thơng qua việc xác định lượng chất ñi hay lượng sản phẩm ñược tạo thành phản ứng Về nguyên tắc chia làm nhóm phương pháp xác định hoạt độ enzym: ðo lượng chất bị ñi hay lượng sản phẩm ñược tạo thành thời gian ñịnh với nồng ñộ enzym xác ñịnh ðo thời gian cần thiết ñể thu ñược lượng biến thiên ñịnh chất hay sản phẩm ứng với nồng ñộ enzym ñịnh ðo nồng ñộ enzym cần thiết ñể làm biến ñổi lượng chất hay thu nhận lượng sản phẩm ñịnh thời gian ñịnh 5.4.2 ðơn vị: ðể ño hoạt ñộ enzym người ta dùng ñơn vị hoạt ñộ - ðơn vị enzym quốc tế (kí hiệu UI): lượng enzym có khả xúc tác làm chuyển hóa micromol chất sau phút ñiều kiện tiêu chuẩn (ở pHopt, toopt ñối với enzym cần xác ñịnh) - ðơn vị Katal (Kat): lượng enzym có khả xúc tác làm chuyển hố mol chất giây điều kiện tiêu chuẩn 1UI= -6 × 10 Kat=16,67 nKat (nanoKat) 60 - Hoạt ñộ riêng chế phẩm enzym: số ñơn vị UI số ñơn vị Kat ứng với 1ml chế phẩm (nếu dung dịch) 1mg chế phẩm (nếu bột) Nếu enzym ñã tinh hoạt độ biểu thị số UI số Kat 1mg enzym - Hoạt ñộ phân tử: số phân tử chất chuyển hố phân tử enzym ñơn vị thời gian 5.4.3 Những ý ñánh giá chất lượng enzym: ðể đánh giá xác độ hoạt động enzym xác định hoạt độ cần ý: - Nồng ñộ chất phản ứng phải giới hạn thích hợp đủ thừa để bão hồ enzym khơng q cao đến mức kìm hãm enzym - Với enzym cần có chất hoạt hố chất làm bền phải cho chất vào enzym trước cho chất vào phản ứng - Xác ñịnh hoạt ñộ cần tiến hành pHopt cố ñịnh pH thường thay ñổi phụ thuộc vào chất thành phần dung dịch ñệm - Nhiệt ñộ dùng xác ñịnh hoạt ñộ phải nhỏ nhiệt độ tối ưu enzym để đề phịng kìm hãm enzym nhiệt ñộ cao - Thời gian xác định hoạt độ thường 5÷30 phút Nhưng có trường hợp kéo dài ñến 24 hoạt ñộ enzym thấp Trong thời gian dài phải cho thêm chất diệt khuẩn ñể tránh tượng tạp nhiễm 5.5 Enzym khơng tan: Enzym khơng tan hay cịn gọi enzym cố ñịnh enzym nằm không gian bị giới hạn Sự giới hạn linh hoạt enzym đạt cách đưa vào pha cách li, tách rời khỏi pha dung dịch tự có khả tiếp xúc ñược với phân tử chất Pha chứa enzym thường khơng tan nước polymer cao phân tử ưa nước 5.5.1 Ưu nhược ñiểm enzym khơng tan: Ưu điểm: - Giảm giá thành sử dụng lặp lại nhiều lần lượng enzym xác định - Enzym khơng lẫn sản phẩm tránh ảnh hưởng khơng tốt sản phẩm - Có thể làm ngừng nhanh chóng phản ứng cần thiết - Enzym khơng tan bền enzym tan kết hợp tận dụng yếu tố nhiệt ñộ, pH… - Dùng enzym cố định dễ dàng thay trình lên men phản ứng enzym ngồi tế bào Nhược điểm: Enzym khơng tan có hoạt độ riêng nhỏ enzym tan 5.5.2 Phương pháp sản xuất enzym khơng tan: Gồm có phương pháp: 5.5.2.1 Gắn liên kết đồng hố trị: ða số enzym khơng tan sản xuất phương pháp Nó chia làm hai phương pháp gắn enzym vào chất khơng hồ tan gắn phân tử enzym với ñể tạo thành ñại phân tử khơng hồ tan Gắn phân tử enzym vào chất mang khơng hồ tan: • u cầu chất mang: - Có độ hồ tan thấp bền vững với tác động cơ, nhiệt hố học - Các chất mang khơng gây tác động kìm hãm enzym - Khơng hấp phụ phi chọn lọc protein - Nên háo nước chất mang kỵ nước gây ức chế với enzym ñược mang - Việc gắn có hiệu chất mang enzym có điện tích trái dấu • Những chất mang thường dùng: + Chất mang hữu cơ: polypeptit, polysaccarit, dẫn xuất xenlulo (DEAE-xenlulo: dietyl animoetyl xenlulo, CM-xenlulo: cacboxyl metyl xenlulo), dẫn xuất dextran (DEAE-sephadex, CM-sephadex) agaroza (aga khác với agaroza, thành phần agaroza có gốc sunfat) Chất mang thơng dụng detran có liên kết ngang gọi sephadex agaroza dạng hạt gọi sepharoza Nói chung loại có cấu trúc lỗ xốp làm cho phân tử lớn xâm nhập vào gel cách dễ dàng Ngồi cịn có polymer tổng hợp khác polyacrylamit, polysterol, polyamit + Chất mang vơ cơ: so với chất mang hữu chất mang vô bền nhiệt, học, hố học, vi sinh vật khơng thay đổi cấu hình khn thay đổi tính chất môi trường xung quanh Các chất mang vô như: silicagen, pentonit, nhôm hydroxyt … Gắn enzyme với Người ta gắn enzyme lại với nhờ tác nhân ña hay lưỡng chức để tạo thành đại phân tử enzyme khơng hồ tan Với phương pháp thu ñược nhiều dẫn xuất enzyme khơng tan, ví dụ thu dẫn xuất tripxin khơng tan cách dùng andehyt glutaric (OHC-(CH2)3-CHO) 1% ñể liên kết phân tử enzyme Phương pháp có ưu điểm: - Ít tổn thất enzyme giải phóng môi trường - Tăng khả chống chịu enzyme ñối với yếu tố biến tính nên ñưa vào sản xuất ñược Nhược ñiểm phương pháp số enzyme cố định 5.5.2.2 “Gói”enzyme khn gel Phải tiến hành trùng hợp hố gel đồng thời với có mặt enzyme Sau enzyme giữ lại gel gel có enzyme làm nhỏ cách nghiền máy đồng hố ép qua lỗ rây đem sấy khơ nhiệt độ khơng q 400C Có thể “gói” enzyme phương pháp sau: - Các gel hình thành polymer hoá tổng hợp - Các enzyme bị nhốt lỗ nhỏ sợi tổng hợp - Gói bao vi thể - Phương pơháp tiền polymer 5.5.2.3 Phương pháp hấp phụ vật lí Phương pháp hấp phụ vật lí khơng thơng qua liên kết hố trị gắn enzyme chất mang Q trình thực hấp phụ ñơn giản: chất hấp phụ enzyme ñược trộn lẫn với khoảng thời gian cho phép hấp phụ xảy nhờ tương tác liên kết ion, kị nước, hydrogen lực Van der Wals Phương pháp có nhược ñiểm trình giải hấp phụ enzyme dễ dàng xảy thay ñổi pH, nhiệt ñộ thành phần ion 5.5.3 Một số tính chất enzyme khơng tan: - Enzyme khơng tan có hoạt đọ riêng nhỏ enzyme tan - Enzyme không tan tuân theo ñịnh luật Michaelis Menten (sự ảnh hưởng nồng ñộ chất ñến hoạt tính enzyme) Tuy nhiên có tượng cạnh tranh chất chất mang, tượng khuyếch tán nên có sai khác ñáng kể tốc ñộ phản ứng enzyme: chất mang chất tích điện cùnh dấu Khơngm khơng tan > Km tan, tích ñiện trái dấu ngược lại (Km - Hằng số Michaielis) - Enzyme khơng tan có tính bền nhiệt cao enzyme tan - Enzyme khơng tan có dịch chuyển pH tối ưu sang miền kiềm axit so với enzyme tan - Enzyme khơng tan có thời gian bảo quản lâu bền với chất kìm hãm tác nhân gây biến tính CHƯƠNG VI: SẢN XUẤT AXIT HỮU CƠ Axit hữu ñược sử dụng rộng rãi chế biến bảo quản thực phẩm công nghệ vi sinh vật Chính mà axit hữu ñược nghiên cứu sả xuất rộng rãi 6.1 Các phương pháp sản xuất axít hữu cơ: ðể sản xuất axít hữu người ta dùng nhiều phương pháp khác như: - Phương pháp tổng hợp hoá học - Phương pháp chiết tách từ nguyên liệu thực vật - Phương pháp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật Trong phương pháp phương pháp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật có ý nghĩa trình sản xuất nhanh, sử dụng nguyên liệu sẵn có rẻ tiền tạo nhiều loại axít hữu khác 6.2 Kỹ thuật sản xuất số axít hữu nhờ vi sinh vật: 6.2.1 Sản xuất axít axetic: Axit axetic thu nhận cách lên men đường oxy hố rượu etylic Sau xét q trình sản xuất axit axetic từ rượu etylic Chủng vi sinh vật: ðể oxy hố rượu etylic thành axít axetic người ta sử dụng nhiều loại vi khuẩn khác Nhưng sử dụng nhiều chủng vi khuẩn: Bacterium schuzenbachi, Bacterium curvum Các loại vi khuẩn có khả oxy hóa lớn Phương trình lên men: CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O + Q Kỹ thuật lên men: Có thể sử dụng phương pháp lên men liên tục gián đoạn ðể q trình lên men tiến triển tốt cần ý ñiểm sau: - Nguyên liệu hỗn hợp dinh dưỡng: sử dụng cồn thơ cồn tinh chế ñể làm môi trường Theo kinh nghiệm cho thấy sản xuất từ cồn thơ ... khác như: - Phương pháp tổng hợp hoá học - Phương pháp chiết tách từ nguyên liệu thực vật - Phương pháp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật Trong phương pháp phương pháp sinh tổng hợp nhờ vi sinh vật... + Ưu: - Tiết kiệm diện tích - Dể giới hố, tự động hố - Sử dụng hợp lí chất dinh dưỡng, tránh lãng phí - Thu enzym tạp chất - ðảm bảo vệ sinh, vơ trùng nên nhiễm vi sinh vật lạ + Nhược: - Nồng... xuất rượu, cơng nghệ thuộc da) ða số ngành công nghiệp (chủ yếu thực phẩm cơng nghiệp nhẹ) địi hỏi phải sử dụng chế phẩm enzym (gọi chế phẩm kỹ thuật) Còn y học phải sử dụng chế phẩm enzym tinh