Söï hình thaønh caùc phöùc heä enzyme-cô chaát nhö nhöõng chaát trung gian trong caùc phaûn öùng enzyme ñaõ ñöôïc phaùt hieän baèng nhöõng bieän phaùp khaùc nhau, bao goàm phaân tích ñ[r]
(1)MỞ ĐẦU
Enzyme chất xúc tác hệ thống sinh học Chúng có khả xúc tác đặc biệt, thường mạnh nhiều so với chất xúc tác tổng hợp Tác dụng xúc tác chúng mang tính đặc hiệu cao chất, làm tăng đáng kể tốc độ phản ứng hóa học xảy mơi trường nước điều kiện nhiệt độ pH êm dịu
Enzyme chìa khóa để hiểu biết trình hoạt động sống tế bào Hoạt động trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định đường trao đổi chất mà nhờ chất dinh dưỡng bị phân hủy, lượng hóa học lưu giữ biến đổi, đại phân tử sinh học tạo từ chất tiền thân đơn giản Một số enzyme tham gia trình trao đổi chất enzyme điều hịa, chịu trách nhiệm tín hiệu trao đổi chất khác cách thay đổi hoạt tính xúc tác chúng cách thích hợp Thơng qua hoạt động enzyme điều hịa hệ thống enzyme phối hợp chặt chẽ với để tạo mối quan hệ hài hòa hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho việc trì sống
(2)I BẢN CHẤT PROTEIN CỦA ENZYME
Phần lớn lịch sử hố sinh học lịch sử nghiên cứu enzyme Các chất xúc tác sinh học lần phát mô tả vào năm 1800 nghiên cứu tiêu hóa thịt chất tiết dày biến đổi tinh bột thành đường nước bọt dịch chiết thực vật khác Trong năm 1850 Louis Pasteur kết luận trình lên men đường thành rượu nấm men xúc tác “ferment” Ông cho men này, mà sau gọi enzyme, chất không tách rời khỏi cấu trúc tế bào nấm men sống, quan điểm tồn nhiều năm Cho đến năm 1897 Eduard Buchner xác định dịch chiết nấm men lên men đường thành rượu chúng tách khỏi cấu trúc tế bào nấm men Phát thúc đẩy nhà sinh hóa tìm cách tách chiết nhiều enzyme khác nghiên cứu hoạt tính xúc tác chúng
Cơng trình tách chiết tinh chế urease James Sumner năm 1926 thúc đẩy nghiên cứu tính chất enzyme đặc hiệu Sumner phát tinh thể urease cấu tạo hoàn toàn từ protein từ ơng cho tất enzyme protein Ý tưởng qua ví dụ khác tiếp tục tranh cải thêm nhiều năm sau Chỉ đến năm cuối thập kỷ 1930, sau John Northrop cộng tác viên ông kết tinh pepsin trypsin xác định chúng protein quan niệm Sumner enzyme công nhận rộng rãi
Ngày hoá sinh học xác định tất enzyme protein Hoạt tính xúc tác chúng phụ thuộc vào tính nguyên vẹn cấu trúc nguyên thủy protein Nếu enzyme bị biến tính bị phân ly thành phần đơn vị hoạt tính xúc tác thường bị Khi enzyme bị phân giải thành aminoacid hoạt tính xúc tác hồn tồn khơng cịn Như vậy, cấu trúc bậc một, bậc hai, bậc ba bậc bốn protein enzyme yếu tố quan trọng hoạt tính xúc tác chúng
(3)có hoạt tính xúc tác với coenzyme (hoặc) ion kim loại hợp lại gọi holoenzyme Phần protein loại enzyme gọi apoenzyme hay apoprotein Coenzyme hoạt động vật mang nhóm chức đặc hiệu Nhiều vitamin chất hữu với hàm lượng nhỏ có thức ăn chất tiền thân coenzyme
Bảng Một số enzyme có chứa cần nguyên tố vô để làm cofactor
Cofactor Enzyme Fe2+ hoặc Fe3+ Cytochrome Oxydase Catalase, Peroxydase
Cu2+ Cytochrome Oxydase
Zn2+ Carbonic Anhydrase, Alcohol Dehydrogenase
Mg2+ Hexokinase, Glucoso-6-phosphatase, Pyruvate Kinase Mn2+ Arginase, Ribonucleotide reductase
K+ Pyruvate kinase
Ni2+ Urease
Mo Dinitrogenase
Se Glutathione peroxidase
Bảng Một số coenzyme làm vật trung chuyển nguyên tử nhóm nguyên tử đặc hiệu
COENZYME Nhóm vận
chuyeån
Chất tiền thân thức ăn động vật có vú Thiamine pyrophosphate Aldehyde Thiamine (Vitamine B1) Flavine adenine
dinucleotide Điện tử Riboflavine (Vitamine B2)
Nicotinamide dinuclotide Điện tử Nicotinic acid (Niacin)
Coenzyme A Nhoùm acyl Acid pantothenic
Pyridoxal phosphate Nhoùm amine Pyridoxine (Vitamine B6)
5’-Deoxyadenosylcobalamine (Coenzyme B12)
Các nguyên tử H
(4)Biocytin CO2 Biotin
Tetrahydrofolate Nhóm carbon Folate
Acid lipoic Điện tử nhóm acyl Khơng cần có thức ăn II DANH PHÁP VAØ PHÂN LOẠI ENZYME
Tên gọi enzyme thường tên gọi chất hay kiểu phản ứng mà xúc tác cộng với “ase”, ví dụ urease,, hydrolase v.v Ngồi cịn có tên gọi truyền thống theo thói quen, khơng cho thấy chất hóa học phản ứng enzyme xúc tác, ví dụ pepsin, trypsin hai kiểu gọi tên nêu thiếu xác
Để khắc phục tình trạng đó, Hội Hóa sinh học quốc tế đề nghị sử dụng hệ thống danh pháp phân loại sở chất phản ứng xúc tác Theo hệ thống toàn enzyme gọi tên theo chất phản ứng xúc tác chất chất cho, chất nhận phản ứng chia thành nhóm lớn; nhóm lớn lại chia thành nhiều phân nhóm; phân nhóm lại chia thành nhiều phân nhóm nhỏ hơn, bao gồm enzyme có chất tác dụng giống Mỗi nhóm, phân nhóm enzyme ký hiệu mã số đặc trưng gồm tương ứng một, hai, ba bốn số cách dấu chấm
Tên gọi nhóm enzyme phân nhóm quan trọng giới thiệu bảng với chất phản ứng xúc tác
Các phân nhóm nhỏ thuộc phân nhóm bảng ký hiệu mã số gồm số Ví dụ phân nhóm thứ enzyme nhóm (ký hiệu phân nhóm 1.1) có ba phân nhóm nhỏ 1.1.1, 1.1.2 1.1.3 đặc trưng cho trường hợp mà chất nhận điện tử NAD, NADP cytochrome
Maõ số enzyme gồm số, ví dụ:
1.1.1.29 – Glycerophosphate dehydrogenase; 2.7.1.1 – Hexokinase 3.2.1.20 – α- Glucosidase; 4.1.1.1 – Pyruvate decarboxylase;
5.3.1.1 – Triosophosphate isomerase; 6.3.1.2 – Glutamin synthetase
Bảng Danh mục mã số nhóm enzyme phân nhóm của chúng
(5)1. Oxydoreductase 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6
Hydrogen hóa dehydrogen hóa =CH–OH =C=O –CH=CH– –CH–NH2 =CH–NH– NADH, NADPH 2. Transferase 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8
Vận chuyển nhóm chức Các gốc carbon
Nhóm aldehyde cetone Acyl
Liên kết glycoside
Nhóm methylalkyl aryl Nhóm chứa nitơ
Nhóm chứa phosphore Nhóm chứa lưu huỳnh 3. Hydrolase 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6
Các phản ứng thủy phân Ester
Glycoside Eter Peptide
Các liên kết C-N khác Các anhydrit acid 4 Liase
4.1 4.2 4.3
Tạo liên kết đôi =C=C= =C=O =C=N– 5 Isomerase 5.1 5.2 5.3 5.4
Đồng phân hóa
Rasemase epimerase Xis-trans-isomerase Oxy hóa nội phân tử Transferase nội phân tử 6 Ligase
6.1 6.2 6.3 6.4
Tạo liên kết nhờ ATP –C=O
≡C–S– =C=N– ≡C–C≡
Khi tên hệ thống enzyme dài sử dụng không thuận tiện, người ta dùng tên gọi thơng dụng chúng, ví dụ tên hệ thống enzyme xúc tác phản ứng ATP + D-Glucose ⎯⎯⎯→ ADP + D-Glucoso-6-phosphate
(6)nhóm phosphate nhó –OH; Số cuối cho biết chất nhận nhóm phosphate D-glucose Khi tên hệ thống enzyme dài dùng tên thơng dụng nó, trường hợp gọi tên enzyme hesokinase
III ĐỘNG HỌC CỦA CÁC PHẢN ỨNG ENZYME
Bất kỳ phản ứng hóa học nào, ví dụ phản ứng A ⎯→ P, xảy nhờ phần lượng số phân tử A chứa lượng lớn số phân tử lại, làm cho chúng tồn trạng thái hoạt động Ở trạng thái dễ dàng phá vỡ liên kết hóa học tạo liên kết để làm xuất sản phẩm P Năng lượng cần để chuyển toàn số phân tử mol vật chất điều kiện định sang trạng thái kích động gọi năng lượng hoạt hóa Năng lượng cần thiết để chuyển phân tử tham gia phản ứng sang trạng thái trung gian giàu lượng tương ứng với đỉnh hàng rào hoạt hóa (hình 1) Tốc độ phản ứng tỉ lệ với nồng độ phân tử trạng thái trung gian
Năng lượng hoạt hóa đo lượng cần thiết để chuyển phân tử lên trạng thái hoạt động Chất xúc tác làm giảm lượng hoạt hóa vốn cần để phản ứng xảy tự phát Bảng cho biết lượng hoạt hóa số phản ứng Phản ứng phân hủy peroxide hydro đòi hỏi 18.000 KCal/mol giảm xuống cịn 11.700 có platin xúc tác giảm thấp chất xúc tác enzyme catalase Rõ ràng, catalase có hiệu nhiều so với chất xúc tác vô phản ứng Trên thực tế catalase có hiệu qủa đến mức cần giá trị lượng hoạt hóa nhỏ cho phản ứng Vì mà phân giải H2O2 catalase xảy tức khắc với tốc độ nhanh số phản ứng enzyme biết Bảng cho thấy enzyme khác giảm lượng hoạt hóa xuống mức thấp đáng kể so với chất xúc tác vơ Vì lý mà phản ứng enzyme xảy với tốc độ cao điều kiện nhiệt độ sinh lý
Bảng Năng lượng hoạt hóa phản ứng xúc tác enzyme chất xúc tác khác
Phản ứng Chất xúc tác Ea (Kcal/mol)
Phân giải peroxide hydro
không platin catalase
18.000 11.700 < 2.000 Thủy phân ethyl butyrate ion hydro ion hydroxyl
lipase tuyến tụy
(7)Thủy phân casein ion hydro
trypsin 20.600 12.000
Thủy phân saccharose ion hydro
invertase nấm men 8.000 -10.000 25.000 Thủy phân
β-methylglucoside
ion hydro β- glucosidase
32.600 12.200 Khi tăng nhiệt độ lượng chuyển động nhiệt phân tử tăng lên, làm cho số phân tử có khả đạt trạng thái trung gian tăng lên Vì tăng nhiệt độ lên 10o, tốc độ phu hóa học tăng lên khoảng hai lần (Q10 = 2)
Khác với tác dụng nhiệt độ, chất xúc tác làm tăng tốc độ phản ứng cách làm giảm lượng hoạt hóa
Hình Biến thiên lượng tự phản ứng hóa học.
Sự kết hợp chất phản ứng chất xúc tác làm xuất trạng thái trung gian với mức lượng hoạt hóa thấp Khi sản phẩm hình thành, chất xúc tác lại giải phóng trạng thái tự Các phản ứng enzyme tuân theo nguyên tắc chung động học phản ứng hóa học Tuy nhiên, chúng cịn có đặc điểm riêng Một đặc điểm tượng bão hịa chất Ở nồng độ chất thấp tốc độ phản ứng enzyme tỉ lệ thuận với nồng độ chất
Nhưng tiếp tục tăng nồng độ chất tốc độ phản ứng tăng chậm dần, nồng độ chất đạt giá trị đó, tốc độ phản ứng khơng tăng Trong điều kiện nồng độ enzyme yếu tố định tốc độ phản ứng
(8)ứng enzyme nêu lên số lý thuyết chung động học trình Thuyết sau Briggs Haldans phát triển thêm
Các tác giả nhận thấy phản ứng enzyme trước tiên enzyme E tạo phức hệ ES với chất S Sau ES phân giải thành sản phẩm P enzyme E tự
Theo định luật khối lượng, trình mơ tả sau: k k1 E + S ES E + P
k2 k4
trong k1 số tốc độ phản ứng hình thàønh ES từ E S; k2 số tốc độ phản ứng phân giải ES thành E S; k3 số tốc độ phản ứng phân giải ES thành E P; k4 số tốc độ phản ứng hình thành ES từ E P
Ở trạng thái cân tốc độ hình thành ES tốc độ phân giải phức hệ này:
k1[E][S] – k2[ES] = k3[ES] – k4[E][P] Biến đổi phương trình này, ta có:
[ES](k2+k3) = [E](k4[P] + k1[S]) [ES] k4[P] + k1[S] k4[P] k1[S] [E] k2 + k3 k2+k3 k2+k3
Do giai đoạn đầu phản ứng giá trị [P] vô nhỏ nên giản lược phương trình sau:
[ES] k1[S]
[E] k2 + k3
Đặt [E]t hàm lượng enzyme tổng số Km = k2+k3 / k1, ta có: [E] [E]t -[ES] [E] Km
[ES] [ES] [ES] [S]
Tốc độ ban đầu v phản ứng enzyme tỉ lệ thuận với hàm lượng enzyme hoạt động, hay ES], nên ta viết:
v = k3[ES]
Nếu nồng độ chất lớn, làm cho hầu hết enzyme hệ thống tồn trạng thái ES, tốc độ phản ứng enzyme đạt giá trị tối đa V, tốc độ tối đa bằng:
V = k3[E]t Do đó:
(9)Nhân hai vế cho [S] biến đổi phương trình, ta có: V[S]
v =
Km + [S]
Đây phương trình Michaelis-Menten Km gọi số Michaelis
Ý nghĩa thực tiển số Michaelis chỗ giá trị nồng độ chất tốc độ phản ứng ½ tốc độ tối đa Thay V v số tương ứng 0,5 vào phương trình trên, ta thấy rõ điều Như vậy, Km đo đơn vị nồng độ, tức mol/l
Hằng số Michaelis số quan trọng Nó xác định lực enzyme với chất Km nhỏ lực lớn, tốc độ phản ứng cao tốc độ tối đa V đạt giá trị nồng độ chất thấp
Trên sở phương trình Michaelis-Menten, cách xây dựng đường biểu diễn phụ thuộc v vào [S] đồ thị xác định tốc độ tối đa V ta tìm thấy giá trị [S], v = V/2, tức giá trị Km (hình 2)
Hình Đường biểu diễn
phương trình Michaelis-Menten
Tuy nhiên, cách khó xác định v cách xác Để khắc phục nhược điểm đó, người ta sử dụng đường biểu diễn Linewear-Burk Hai tác giả
này biến đổi phương trình Michaelis-Menten thành dạng: 1/v = Km/V x 1/[S] + 1/V
Ưu điểm phương trình chỗ đại lượng 1/v 1/[S] có mối liên hệ tỉ lệ thuận (hình 3)
Qua đường biểu diễn ta thấy tang ABO = Km/V BO = 1/Km
Phương trình cho phép tìm hiểu nhiều khía caïnh quan
(10)Linewear-trọng liên quan đến tác dụng chất ức chế hoạt tính enzyme
IV NHỮNG TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG CỦA XÚC TÁC SINH HỌC
1 Enzyme thể tính đặc hiệu cao chất chúng Một số enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa chất Ví dụ fumarase xúc tác phản ứng chuyển hóa fumarate malate:
OH COO-
- OOC - CH2 - C - COO- ⎯→ CH = CH + H2O H -OOC
L-Malate Fumarate
Cả maleat - đồng phân dạng cis fumarat - D-malat chất fumarase Các Enzyme khác có tính đặc hiệu rộng Ví dụ enzyme thủy phân protein bảng 2.4 có tính đặc hiệu với liên kết peptide vốn hình thành aminoacid khác nhau, đồng thời thể tính đặc hiệu lập thể, thủy phân liên kết peptide hình thành L- khơng phải D-aminoacid Tuy nhiên có enzyme có tính đặc hiệu rộng hơn, ví dụ số enzyme thủy phân protein thủy phân liên kết ester tyoester
2 Xúc tác enzyme dẫn đến hình thành phức hệ trung gian giữa enzyme chất
Sự hình thành phức hệ enzyme-cơ chất chất trung gian phản ứng enzyme phát biện pháp khác nhau, bao gồm phân tích động học, sử dụng thuốc thử đặc hiệu gốc R để tạo biến đổi hóa học, ức chế enzyme hợp chất đặc hiệu tương tác với trung tâm hoạt động, phát quang phổ hấp thụ đặc hiệu enzyme tác dụng với chất, dùng tia X phát cấu trúc tinh thể enzyme kết hợp với hợp chất tương tự mặt cấu trúc với chất
3 Trung tâm enzyme tương tác đặc hiệu với chất gọi trung tâm hoạt động
(11)trọng liên quan đến tác dụng chất ức chế hoạt tính enzyme
IV NHỮNG TÍNH CHẤT ĐẶC TRƯNG CỦA XÚC TÁC SINH HỌC
1 Enzyme thể tính đặc hiệu cao chất chúng Một số enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa chất Ví dụ fumarase xúc tác phản ứng chuyển hóa fumarate malate:
OH COO-
- OOC - CH2 - C - COO- ⎯→ CH = CH + H2O H -OOC
L-Malate Fumarate
Cả maleat - đồng phân dạng cis fumarat - D-malat chất fumarase Các Enzyme khác có tính đặc hiệu rộng Ví dụ enzyme thủy phân protein bảng 2.4 có tính đặc hiệu với liên kết peptide vốn hình thành aminoacid khác nhau, đồng thời thể tính đặc hiệu lập thể, thủy phân liên kết peptide hình thành L- khơng phải D-aminoacid Tuy nhiên có enzyme có tính đặc hiệu rộng hơn, ví dụ số enzyme thủy phân protein thủy phân liên kết ester tyoester
2 Xúc tác enzyme dẫn đến hình thành phức hệ trung gian giữa enzyme chất
Sự hình thành phức hệ enzyme-cơ chất chất trung gian phản ứng enzyme phát biện pháp khác nhau, bao gồm phân tích động học, sử dụng thuốc thử đặc hiệu gốc R để tạo biến đổi hóa học, ức chế enzyme hợp chất đặc hiệu tương tác với trung tâm hoạt động, phát quang phổ hấp thụ đặc hiệu enzyme tác dụng với chất, dùng tia X phát cấu trúc tinh thể enzyme kết hợp với hợp chất tương tự mặt cấu trúc với chất
3 Trung tâm enzyme tương tác đặc hiệu với chất gọi trung tâm hoạt động
(12)mà quy định chất biến cố để làm cho chất biến hóa thành sản phẩm Sự kết hợp chất với trung tâm hoạt động thực thơng qua hình thành liên kết khơng đồng hóa trị đặc hiệu vài trường hợp, liên kết đồng hóa trị Khi liên kết trung tâm, chất đặt gần sát với nhóm đặc hiệu enzyme, gây ổn định số liên kết định chất, làm cho chúng trở nên họat động mặt hóa học
4 Enzyme làm giảm lượng hoạt hóa cần thiết cho phản ứng
Ở nhiệt độ khơng đổi, tập đồn phân tử có động phân bố phân tử mô tả cách khái quát hình 4a Ở nhiệt độ T1 tập đồn phân tử khơng có đủ lượng để thực phản ứng hóa học đặc hiệu đó, nhiệt độ nâng lên đến T2 phân bố lượng thay đổi theo Tại T2 có đủ lượng để nâng số va chạm phân tử, làm cho phản ứng hóa học xảy Như vậy, nhiệt độ nâng lên từ T1 đến T2 việc tăng tốc độ phản ứng chủ yếu kết việc tăng số phân tử hoạt hóa, tức phận có lượng cần thiết cho hoạt hóa
Hình 3c cho thấy tranh đơn giản mặt lượng tập đồn phân tử q trình phản ứng A B
Khi phản ứng xảy ra, có đủ số phân tử với mức lượng cần thiết để trở nên hoạt động tham gia trạng thái trung chuyển, chúng phân hóa thành sản phẩm Năng lượng cần để đạt trạng thái trung chuyển, hay trạng thái hoạt hóa lượng hoạt hóa (Ea ) Để phản ứng xảy ra, mức lượng chất phản ứng phải lớn sản phẩm Tổng biến thiên lượng phản ứng mức hênh lệch mức lượng A B
(13)Hình 4. (a) Phân bố động tập đoàn phân tử nhiệt độ T1 T2 cao Mũi tên mức lượng tối thiểu cần thiết
để phân tử tham gia phản ứng Tại T1 phản ứng không xảy ra,
nhưng T2 phản ứng thực (b) Động tâp đoàn
phân tử chất nhiệt độ T1 mũi tên mức lượng cần
thiết để xảy phản ứng vắng mặt có mặt enzyme Cần ý rằng khơng có enzyme phản ứng khơng xảy ra, cịn có mặt enzyme phản ứng thực mà không cần thay đổi nhiệt độ (c) Biến thiên lượng phản ứng enzyme xúc tác có enzyme xúc tác A B Trong phản ứng khơng có enzyme xúc tác, mức lượng A cần nâng lên đủ để hoạt hóa phân tử của A đưa chúng lên trạng thái trung chuyển A,B* , phản ứng với B Năng lượng cần để mang phân tử lên trạng thái trung chuyển gọi lượng hoạt hóa Ea Mức chênh lệch
các mức lượng A A.B* số Trong phản ứng có xúc tác Ea cần để tạo phức hệ hoạt động ES
bằng số thấp nhiều so với số q trình khơng xúc tác Sự chênh lệch mức lượng A B (số 3) trong phản ứng có xúc tác khơng có xúc tác
5 Một số enzyme tham gia điều hòa tốc độ phản ứng
Đa số thể không thay đổi tốc độ phản ứng trao đổi chất nhiệt độ biến đổi Vì phản ứng xúc tác cần làm cho trình xảy đủ nhanh nhiệt độ thể Hơn nữa, phản ứng sinh học xảy khơng có xúc tác khơng thể kiểm tra tốc độ chúng
(14)của enzyme cho gây ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng Cơ chế điều hòa enzyme xem xét sau
6 Một số enzyme multienzyme hay phức hệ đa chức
Các phức hệ multienzyme có trọng lượng phân tử lớn thường chứa từ ba enzyme khác trở lên kết hợp chặt chẽ với cách tương tác khơng đồng hóa trị phân ly điều kiện làm phá vỡ liên kết khơng đồng hóa trị Mỗi enzyme phức hệ xúc tác phản ứng riêng biệt với enzyme khác phức hệ xúc tác phản ứng tổng thể Pyruvat dehydrogenase ví dụ phức hệ multi- enzyme.Các enzyme khác nằm phức hệ đa chức (multifuntional complex), hai hay nhiều enzyme riêng biệt chứa khu vực riêng chuỗi polypeptide Mỗi khu vực riêng xúc tác bước phản ứng tổng thể phức hệ đa chức xúc tác Synthetase acid béo ví dụ cho loại phức hệ
7 Động học phản ứng enzyme hai chất
Đa số enzyme có nhiều chất xúc tác phản ứng có dạng A + B ↔ C + D Các phản ứng dẫn đến hình thành phức hệ enzyme - chất giống phản ứng chất động học chúng dùng để thu nhận Km chất đo phân tích đồ thị (theo phương trình 11 - 13) tốc độ ban đầu thay đổi nồng độ chất giữ nguyên nồng độ bão hòa chất
Phương trình động học phản ứng hai chất tương tự phương trình tốc độ Michelis - Menten cho phép hiểu cách sâu sắc chế chung phản ứng lọai xác định gía trị số động học Km Vmax Những phương trình phức tạp nên đề cập đến Tuy nhiên, bổ ích xem xét chế phản ứng hai chất bao gồm hai chế khác chế thay kép (double displacement mechanism) chế liên tục (sequental mechanism)
Trong chế thay kép phản ứng A + B ↔ C + D, chất (A) gắn với enzyme để tạo phức hệ EA E A sau phản ứng để tạo phức hệ FC sau sản phẩm (C) giải phóng để tạo phức hệ trung gian enzyme - chất F khác với E Sản phẩm trung gian F sau phản ứng với chất thứ hai (B) để tạo phức hệ enzyme - chất FB Phức hệ tạo sản phẩm thứ hai D khôi phục enzyme E Cơ chế mơ tả cách khái qt dạng sơ đồ sau đây:
(15)E + A (EA ↔ F C) → F + B ↔ (FB ↔ FD) → E
A, B, C, D chất phản ứng sản phẩm, E enzyme, F dạng trung gian enzyme Cơ chế gọi chế ping-pong Phản ứng chuyển amin-hóa enzyme glutamic-aspartic aminotransferase ví dụ chế
Cơ chế liên tục có hai loại: loại trật tự loại tùy tiện Ngược với chế ping-pong, chế liên tục tất chất kết hợp để tạo phức hệ ba thành phần trước sản phẩm hình thành Các phản ứng loại tật tự mơ tả dạng sơ đồ sau đây:
A B C D E + A ↔ EA + B ↔ (EAB ↔ ECD) ⎯→ED ⎯→E Các phản ứng xúc tác phosphofructokinase glycealdehyde-3- phosphate dehydrogenase ví dụ kiểu phản ứng trật tự chế liên tục Trong trường hợp khác, E mang trung tâm kết hợp A B tốc độ phản ứng không bị ảnh hưởng A B gắn trước vào trung tâm dành cho chúng Vì vậy, chế gọi chế tùy tiện Nếu khơng có trật tự "thích hợp" cho giải phóng sản phẩm C D sau phức hệ ba thành phần EAB biến thành ECD, chế tùy tiện mơ tả sau:
A B C D
EA
ED
E E
EB (EAB ↔ ECD) EC
A B C D
Ví dụ chế tùy tiện phản ứng xúc tác enzyme UDP-ga- lactose:N-Acetylgalactosamine galactosyl transferase creatine kinase
Các chế động học phức tạp lơi ba chí bốn chất tham gia phản ứng Chúng thuộc chế liên tục chế ping-pong phối hợp hai chế
8 Ảnh hưởng pH
(16)xác định Bảng cho thấy pH tối thích số enzyme Một số yếu tố có ảnh hưởng đến pH tối thích bao gồm gốc acid trung tâm hoạt động
Nếu enzyme địi hỏi nhóm acide protein hóa cho hoạt động enzyme có hoạt tính cao gía trị pH thấp pK nhóm đó, ngược lại, cần dạng phân ly acide hoạt tính cao thể giá trị pH cao pK nhóm Thơng thường có hai nhóm acide phân ly trở lên tham gia trung tâm hoạt động đường cong hoạt tính theo pH phản ánh phụ thuộc vào nhóm thức tế, nghiên cứu ảnh hưởng pH tốc độ phản ứng giúp xác định nhóm acid trung tâm hoạt động, cần thơng tin khác
Bảng pHtối thích số enzyme thủy phân
Enzyme Cơ chất pHopt
Pepsin
Albumin trứng casein
Hemoglobin
Benzyloxycarboxylglutamyltyrosine
1,5 1,8 2,2 4,0
α-Glucosidase α-Metylglucoside
Maltose 5,4 7,0
Urease Urea 6,4-6,9
Trypsin Protein 7,8
α-Amylase tuyến tụy Tinh bột 6,7-7,2
β-Amylase mầm lúa mạch Tinh bột 7,8
Carboxypeptidase Các chất khác 7,5
Phosphatase kiềm huyết tương
2-Glycerophosphate 9-10 Phosphatase acid huyết
tương
2-Glycerophosphate 4,5-5,0
Arginase Arginine 9,5-9-9
(17)9 Ảnh hưởng nhiệt độ
Hằng số cân phản ứng hóa học tốc độ phản ứng phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ Các phản ứng enzyme ngoại lệ Ảnh huởng nhiệt độ lên số cân phản ứng hóa học mơ tả phương trình van't Hoff:
∆H
2,3 logK = C - ⎯⎯ RT
Trong ∆H nhiệt lượng phản ứng tính calo/mol, R số khí 1,98 cal/mol/oC T nhiệt độ tuyệt đối C số hợp (integration constant) Từ phương trình thấy đồ thị logK 1/T đường thẳng Độ nghiêng đường thẳng ∆H / 2,3R Ảnh hưởng nhiệt độ lên tốc độ phản ứng mơ tả phương trình Arrhenius:
Ea
2,3 logK = B - ⎯⎯
RT
Phương trình có dạng phương trình (19) mơ tả quan hệ số tốc độ k phản ứng với T, R, Ea (năng lượng hoạt hóa tính calo/mol) số B biểu định lượng tần số va chạm yêu cầu định hướng đặc hiệu phân tử va chạm
Hình Ảnh hưởng nhiệt độ lên số tốc độ k2 phản ứng thủy phân
benzyloxycarbonyl-glycylphenylalanin (CGP) benzyloxycarbonyl-glycyltryptophan (CGT) carboxypep-tidase tinh thể Các số liệu ghi nhận đồ thị dạng log k2
giá trị nghịch đảo nhiệt độ tuyệt đối (1/T) Năng lượng hoạt hóa biểu kiến Ea
bằng 9.900 cal/mol CGT 9.600 đối với CGP
Hình cho thấy ảnh hưởng nhiệt độ lên số tốc độ k2 phản ứng thủy phân hai chất carboxypeptidase Đây đồ thị Arrhenius điển hình phản ứng enzyme vốn cho thấy logk2 thay đổi tỷ lệ thuận với 1/T phạm vi từ đến 25oC cho thấy E
a xác định từ độ nghiêng đường thẳng
(18)V ỨC CHẾ ENZYME
Tốc độ phản ứng enzyme bị giảm tác dụng chất ức chế đặc hiệu, tức chất kết hợp với enzyme ngăn cản enzyme kết hợp cách bình thường với chất Tính độc nhiều chất HCN H2S tác dụng chúng chất ức chế enzyme Nhiều loại thuốc
cũng có tác dụng ức chế enzyme đặc hiệu Do đó, hiểu biết chất ức chế enzyme điều quan trọng để hiểu tác dụng thuốc chất độc Hơn thông tin thân enzyme thu cách nghiên cứu chất ức chế enzyme
Có ba kiểu ức chế thuận nghịch mang đặc điểm động học khác Đó kiểu ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) hai kiểu ức chế không cạnh tranh (noncompetitive uncompetitive inhibition)
1 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)
Các chất ức chế cạnh tranh kết hợp thuận nghịch với trung tâm hoạt động enzyme cạnh tranh với chất để giành lấy trung tâm hoạt động Khi trung tâm hoạt động bị chất ức chế chiếm giữ, khơng thể kết hợp với chất Sự kết hợp chất ức chế cạnh tranh I với enzyme E mơ tả giống kết hợp enzyme chất, chất ức chế khơng chuyển hóa thành sản phẩm:
E + I ↔ EI Hằng số phâ.n ly Ki phức hệ EI là:
[E][I]
K = i ⎯⎯⎯ [EI]
Vì hình thành EI phụ thuộc vào [I] hình thành ES phụ thuộc vào [S] nên tốc độ thực tế phản ứng ức chế cạnh tranh hoàn toàn phụ thuộc vào nồng độ tương đối S I nồng độ xác định E
Một ví dụ điển hình ức chế cạnh tranh ảnh hưởng acid malonic enzyme succinate dehydrogenase xúc tác phản ứng sau có chất nhận hydro A thích hợp :
COO-
CH2 HCCOO
(19)COO
Succinate Chất nhận Fumarate Chất nhận dạng khử Nhiều hợp chất với cấu trúc giống với acid succinic chất ức chế cạnh tranh loại enzyme dehydrogenase này, bao gồm:
COOH
COOH CH2
COOH
CH2 COOH CH2 CH2
C = O
CH2 CH2 CH2 CH2
CH2
COOH COOH COOH COOH COOH Oxalate Malonate Glutarate Phenylpropionate Oxaloacetate
Mạnh số chất ức chế acid malonic Khi tỷ lệ [I]/[S] = 1/50, enzyme bị ức chế 50% Tăng nồng độ chất [I] không đổi, làm giảm mức độ ức chế, ngược lại, giảm nồng độ chất làm tăng mức độ ức chế Nếu acid succinic acid malonic gắn với trung tâm khác enzyme khơng thể giải thích chúng cạnh tranh với Vì chúng cạnh tranh nên kết luận chúng kết hợp với enzyme chỗ, trung tâm hoạt động Cấu trúc chất ức chế cạnh tranh giống với chất số khía cạnh
Các chất ức chế cạnh tranh nhận biết đặc điểm động học qua hiệu ứng nồng độ chất ức chế quan hệ v [S] minh họa đồ thị phương trình Lineweaver-Burk Tác dụng ức chế cạnh tranh tuân theo phương trình sau với tham gia Ki -
số phân ly cuûa EI:
Km [I]
⎯ = ⎯⎯ + ⎯⎯ ⎯⎯ + ⎯⎯ v Vmax Ki [S] Vmax
Đặc điểm ức chế competitive có điểm cắt trục tung (1/Vmax ) phản ứng không ức chế độ nghiêng khác với phản
ứng không ức chế giá trị + [I]/Ki Đồ thị hình 6a cho thấy rõ
(20)Hình Đồ thị đảo ngược kép mơ tả kiểu ức chế phản ứng enzyme:
(a): ức chế competivive, (b): ức chế noncompetitive, (c): ức chế uncompetitive Km Vmax xác định từ độ dốc điểm cắt
phản ứng khơng ức chế, cịn Ki - từ độ dốc và/hoặc chỗ cắt phản ứng