Giáo trình Công nghệ sinh học đại cương: Phần 1

Phần 1 cuốn giáo trình Công nghệ sinh học giới thiệu tới người học các nội dung: Khái niệm, lịch sử và biện chứng phát triển của công nghệ sinh học; công nghệ tế bào thực vật; cơ sở sinh học phân tử của kỹ thuật di truyền; công nghệ ADN tái tổ hợp. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

ĐẠI H Ọ C THÁI NGUYỀN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM Đ Ô N Ă N G V Ị N H (Chủ biên) - N G Ơ XN B Ì N H NHÀ XUẤT B Ả N N Ô N G N G H I Ệ P ĐẠI H Ọ C THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NỒNG LÂM Đ Ỗ N Ă N G V Ị N H (Chủ biên) NGƠ XN BÌNH G C Ơ N G I N Đ A Á G I O H T R Ệ C S Ư NHÀ XUẤT BẢN NÔNG H À N Ộ I - 2008 Ì N I Ơ H N N H H G NGHIỆP Ọ C M Ở Công tiên phát nghệ thông tin công nghệ sinh học (CNSH) triển hầu hết quốc gia giới N hiều to lớn CNSH CNSH ĐẦU hai lĩnh vực công nghệ học giả dự báo sức cải tạo sinh giới, có thân người ưu mạnh Vai trò phát triển kinh tế y học, an sinh xã hội hệ sinh thái trái đất ngày mạnh trình sống N hiều lên với tích lũy nh anh tri thức ch óng câu hỏi lớn liên quan đến phát triển công nghệ sinh học đặt ra: Ì Lịch sử hình thành phát triển cơng nghệ sinh học? Cơng nghệ sinh học gì? Công nghệ sinh học bao gồm học công nghệ nào? ngành Quan hệ CNSH Các kiến thức Vai trò khám phá chất sống khả cải tạo sinh giới Vai trị cơng nghệ sinh học phát triển kinh tế- xã hội ngược lại vai trị kinh tế- xã hội sách quốc gia dối với phát triển CNSH? Hiện trạng dự báo phát triển công nghệ sinh học giới ỏ nước Định hướng phát triển công nghệ sinh học nước với ngành khoa học tự nhiên, khoa học xã hội công nghệ sinh khoa khác? học? CNSH? ta? ta? Một nhiệm vụ sách đặt câu hỏi, đồng thời sinh viên người đọc tìm câu trả lời câu hỏi mang tính tổng quát Hiện nay, kinh tế toàn cẩu trải qua thách phát triển nóng kinh tế, Trung nước Đông Nam Á có Việt Nam, lượng Khả suy kiệt nguồn 30 năm tới Các quốc thức ngày lớn Đố Quốc, An Độ, Brasiỉ, Nga vá đòi hỏi gia tăng khai thác sử dụng than đá, dầu mỏ, khí đốt nhãn tiền gia đông dân Trung Quốc, khoảng An Độ, Nga dần trở thành nên kinh tế lớn với mức tiêu dùng lượng sản xuất khí thải nhà kính tương tự Mỹ Tình hình đẩy nhanh q trình khủng mơi trường tồn cầu, dẫn đến chiến tranh khoảng nguồn lượng tồn tại? Phát Vấn đề môi trường triển hay không phát triển? triển xem bền vững phạm CNSH đến đâu giải vấn đê Định hướng nhiêu xu phát sinh thái trở thành Phát triển phải khoảng không lượng gian sinh tồn vấn đề tồn hay nào? Giải pháp vi toàn cẩu cho quốc gia? Vai trị khơng phát trên? triển cơng nghệ sinh học vào việc trả lời cho câu hỏi tương lai phụ thuộc Vai trò CNSH giải vấn dề an sinh xã hội, vấn đề lượng tái sinh sinh thái bền vững to lớn Các nhà khoa học trẻ sinh viên lĩnh sinh học - nơng nghiệp, bên cạnh việc phải có kiến thức chun mơn sâu, phải tầm nhìn rộng lớn hơn, bao quát định hướng tốt hoạt động thực Cuốn "Công nghệ sinh học đại cương" kiến thức CN SH nhằm góp phần vai trị CNSH Giáo trình phản cơng viết từ ỉ đến Ngơ Xn Bình - tham gia viết chương lo l i nghệ sinh học lĩnh hàng ngày nên hoàn thiện Chúng vực khoa sách khó tránh tơi xin trân trọng cảm số lo học rộng khỏi lớn, phát có thiếu sót, mong ơn Nhóm tác giả sau: Đỗ Năng Vịnh - Chủ biên, viết chương Vì cơng cung cấp cho học viên giai đoạn có tiễn thực tiễn, đồng thời gợi ý định hướng giải pháp phát triển CNSH vực triển bạn đọc góp đổi ý Chương Ì KHÁI NIỆM, LỊCH s VÀ BIỆN CHÚNG PHÁT TRIỂN CÔNG N G H Ệ SINH CỦA H Ọ C 1.1 K H Á I N I Ệ M C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C V À Q U A N H Ệ C Ủ A C Ô N G N G H Ệ S I N H H Ọ C V Ớ I C Á C N G À N H K H O A H Ọ C T ự N H I Ê N VÀ Xà H Ộ I K H Á C C ô n g n g h ệ sinh học (CNSH) tập hợp c c n g n h khoa học - c ô n g n g h ệ v ề sống, bao g m sinh học p h â n tử, k ỹ thuật gen, c ô n g n g h ệ t ế b o , c ô n g n g h ệ v i sinh, c ô n g n g h ệ protein enzym , n g h i ê n cứu khai t h c c c q u trình sinh học, hoạt đ ộ n g sống v i sinh vật, t ế b o đ ộ n g v thực vật, c t h ể sống m ô c c q u trình sinh học quy m ô sản x u ấ t c ô n g nghiệp H i ệ n C N S H bao g m c c l o i c ô n g n g h ệ k ỹ thuật chủ lực n h c ô n g n g h ệ gen, c ô n g nghệ v i sinh vật, c ô n g n g h ệ t ế b o , c ô n g n g h ệ enzym, sinh học p h â n tử, sinh hoa học, lý sinh học, đ i ề u k h i ể n học, sinh t i n học, genom học (genomics), protein học (proteomics), nano sinh học T u y v ậ y , C N S H k h ô n g đ n khoa học sinh học, n ó k ế t hợp c c n g u y ê n lý sinh học v i c ô n g n g h i ệ p sinh học CNSH k ế t hợp c c n g u y ê n lý khoa học c ô n g n g h ệ m ộ t h ệ thống đ ó c c c t h ể sống, m ô t ế b o , c quan tử, c c p h â n t q u trình sống khai t h c sử d ụ n g v o sản x u ấ t quy m ô c ô n g nghiệp M ỗ i t ổ hợp sản x u ấ t C N S H bao g m n ó c c y ế u t ố k h c nhau: - C c n g u y ê n lý khoa học c ô n g nghệ - H ệ thống c c t h i ế t bị d â y c h u y ề n c ô n g n g h ệ ( c c t h i ế t bị n g h i ê n cứu khoa học k i ể m soát chất lượng, c c thiết bị sản x u ấ t n h c c bioreactor, h ệ t h ố n g lên men vi sinh vật, h ệ đ i ề u k h i ể n tự đ ộ n g ) - Các h ệ thống sống c c mức đ ộ t ổ chức k h c t p h â n tử, c ấ u trúc p h â n tử, t ế b o quan, t ế b o , m ô , c quan, c t h ể sống, quần thể - Các q u t r ì n h c h u y ể n đ ổ i vật chất n ă n g lượng n h ằ m tạo c c sản p h ẩ m mong m u ố n (ví dụ," sản x u ấ t c c chất hoạt tính sinh học n h h o r m o n sinh trưởng, interĩeron, k h n g sinh, insulin) quy m ô c ô n g nghiệp Sự đ i p h t t r i ể n C N S H c ó quan h ệ chặt c h ẽ v i p h t t r i ể n n h i ề u n g n h khoa học c ô n g nghệ k h c C c m ố i quan h ệ đ ó t h ể h i ệ n c c s đ 1.1 1.2 Tích lũy tri thức tốn học.vật lý, hoa học, khoa học trái đất, không gian Cuộc cách mạng công nghiệp lần 1,2 3: Công nghiệp điện tử, chế tạo máy, thông tin, tin học, vật liệu Công nghệ sinh học Công nghiệp sinh học Sơ đồ LI Dự báo Tích tụ tri thức phương tiện nghiên cứu khoa học sinh học khoa học tự nhiên khác Cuộc cách mạng công nghiệp sinh học the kỷ XXI Công nghệ sinh học đời phát triển tất yếu lịch sử Quan h ệ c c n g n h khoa học t h ể h i ệ n quan h ệ b i ệ n chứng c c h ì n h thức v ậ n đ ộ n g k h c v ậ t chất v quan h ệ v ậ n đ ộ n g x ã h ộ i v p h t t r i ể n khoa học c ô n g nghệ H i ể u b i ế t c c m ố i quan h ệ logic đ ó , c h ú n g ta m i c ó c ă n đ ể t ổ chức h ệ thống khoa học x â y dựng c c c h n g t r ì n h n g h i ê n cứu p h t t r i ể n p h ù h ợ p V ậ n đ ộ n g sinh học t ổ n g hoa n h i ề u h ì n h thức v ậ n đ ộ n g k h c v ậ t chất k ế t q u ả v ậ n đ ộ n g v ậ t lý, hoa học, v ậ n đ ộ n g v ũ trụ n ó i c h u n g K h i l o i n g i c ó k h ả n ă n g thao t c d i t r u y ề n mức p h â n t trở t h n h " đ ấ n g s n g t o m i " sinh g i i v ậ n đ ộ n g sinh học c ò n x ả y m ố i quan h ệ n g y c n g chặt c h ẽ v i v ậ n động xã h ộ i V ì t í n h chất phức tạp v ậ n đ ộ n g sinh học, n ê n C N S H c h ỉ c ó t h ể h ì n h t h n h p h t t r i ể n k h i c c n g n h khoa học k h c đ ã đ t đ ế n q u t r ì n h t í c h l ũ y t r i thức v p h n g t i ệ n mức " t i hạn" n o đ ó C N S H n g y đ a n g đ ứ n g t r ê n n ề n tảng c c khoa h ọ c t ự n h i ê n k h c t h n h tựu c c c c h m n g c ô n g n g h i ệ p D o v ậ y , m ộ t n h C N S H chắn p h ả i c ó t r i thức khoa học t ự n h i ê n v k i ế n thức c ô n g nghệ M ộ t quốc gia m u ố n p h t t r i ể n c ô n g n g h i ệ p C N S H v ữ n g p h ả i k ế t hợp p h t t r i ể n c c khoa học sinh học v i c ô n g n g h ệ t i n học, đ i ệ n tử, v ậ t l i ệ u m i v phải c ó t ầ m n h ì n t o n c ầ u v t ầ m n h ì n quốc gia v ề k i n h t ế , sinh t h i v m ô i t r n g 1.2 CÁC NGÀNH KHOA HỌC VỀ SỐNG VÀ Mối QUAN HỆ BIỆN CHÚNG M ố i quan h ệ c c khoa học v ề sống v c c n g n h khoa học t ự n h i ê n k h c v i C N S H m ô tả v ắ n tắt sớ*đồ 1.2 Sơ đ n y c ũ n g t h ể h i ệ n quan h ệ t r i ế t học c c khoa học x ã h ộ i n h c h í n h trị, lịch sử, k i n h t ế v i khoa học c ô n g n g h ệ n ó i chung v v i C N S H n ó i r i ê n g T r ê n sơ đ n y , n g n h khoa học p h â n t h n h l o i h ì n h hay thang bậc k h c m ố i quan h ệ v i thực t i ễ n : - C c n g n h khoa học c bản; - C c n g n h khoa học c ô n g nghệ: sản p h ẩ m khoa học c k ế t hợp v i c ô n g n g h i ệ p k i n h t ế ; - C c n g n h khoa học ứng dụng: sản p h ẩ m n g n h t r ê n , n ó l ĩ n h vực đ i sống m đ ó c c n g n h khoa học c ô n g n g h ệ ứng d ụ n g Công nghệ sinh học Các ngành khoa học sống Các ngành khoa học Các ngành khoa học - công nghệ CNSH úng dụng Di truyền học Kỹ thuật di truyền CNSH y học: - Công nghệ vacxin chế phẩm dược CNSH nong nghiệp: - Công nghệ vi nhân giống thực vật - Công nghệ nhân động vật - Công nghệ tạo giống CNSH mơi trưịng-sinh thái lượng tái sinh Sinh phân tử Sinh hoa học Sinh lý học Toán sinh học Điều khiển học sinh học Genom học Protein học Tế bào học Mô phôi học Sinh thái học Bệnh học Miễn dịch học Công nghệ tế bào Công nghệ erưym protein Công nghệ vi sinh Công nghệ lên men Công nghệ vacxin chế phẩm dược Các ngành khoa học công nghệ ^ Ị Ị Sơ đồ 1.2 Quan hệ biện chứng ngành Khoa học Công nghệ Công nghệ điện tử Công nghệ lazer Năng lượng nguyên tử Công nghệ vật liệu Tự động hoa Công nghệ chế tạo máy Các ngành khoa học tự nhiên khác Các ngành khoa học - Toán học - Vật lý học - Hoa học - Tin học - Thiên văn học - Các ngành khoa học trái đất Công nghệ thông tin Công nghệ nano khoa học cơng nghệ Ì TRIÊT HỌC KINH TẾ HỌC KHOA HỌC CHÍNH TRỊ VÀ LỊCH s ũ - Thế giói quan: Quan hệ vặt chất tinh thần, vật chất vận động, vật chất lượng, tinh thần thuộc tính vật chất có tổ chức cao Luận người sản phẩm tự nhiên dự báo vai trò CNSH tiến hoa người - Phép biện chứng: Các quy luật phổ biến vận động vật chất.vận động xã hội tư Tổng hoa mối quan hệ tương" tác vật tượng vũ trụ Vận động sinh học vận động vũ trụ - Nhận thức luận: Các phương pháp nhận thức Thực nghiệm khoa học thực tiễn khách quan tiêu chuẩn chân lý Vai trò khoa học việc phát quy luật vận động, từ giải thích dự báo phát triển CNSH liệu có Quan điểm hệ thống xem xét vật - Các quy luật phát triển xã hội, quan hệ người với ngi xã hội lồi người với thiên nhiên - Quan hệ chế độ xã hội, tính tiền phong chế độ xã hội phát triển khoa học cơng nghệ Luật pháp sách phát triển tiên tiến định thành tựu phát triển KHCN giáo dục ỏ quốc gia - Tác động khoa học công nghệ lên người: Phương tiện sản xuất phương tiện sống - môi trường sống - suất lao động - phương tiện nhận thức người CNSH tác động lên thân người: tiềm trí tuệ khả sáng tạo, sức khoe, tuổi thọ - Vai trò định KHCN việc giải vấn đề phát triển kinh tế-xã hội - Quan điểm lịch sử nhận thức luận khoa học - Quan hệ kinh tế khoa học cơng nghệ - Địn bẩy kinh tế phát triển khoa học cơng nghệ - Địn bẩy khoa học công nghệ phát triển kinh tế - Dự báo kinh tế, thị trường, dự báo tương lai quy định định hướng phát triển KHCN quốc gia Dự báo thị trường Nông nghiệp-Y dược, dự báo môi trường sinh thái quy định định hướng nghiên cứu CNSH - Dự báo vai trò định CNSH đoi với phát triển nông- lâm ngư nghiệp - y dược mơi trường sinh thái Chính sách quốc gia phát triển CNSH 1.2.1 C c n g n h k h o a học c b ả n v ề sống - Di truyền học Sinh hoa học - Sinh học p h â n tử Bệnh học - T ế b o học Phỏng sinh học - M ô p h ô i học Đ i ề u k h i ể n học sinh học - Sinh lý học T o n sinh học - M i ễ n dịch học c c khoa học k h c G e n o m học - Sinh thái học Protein học - D i t r u y ề n học lý thuyết Nano sinh học Vv C c n g n h khoa học c v ề sống m i h i ệ n c ó t h ể n ó i genom học (genomics) bao g m c ấ u trúc, t ổ chức chức n ă n g t n g gen, n h ó m gen, h ệ t h ố n g ( A D N t ế b o n h â n thực plasmid A D N c c c h ủ n g v i k h u ẩ n m ấ t k h ả n ă n g methyl hoa) Sơ đồ 4.1 Sự cắt đặc hiệu eniym cắt giới hạn 4.2.2 Ligase kinase Hai enzym n y đ ó n g vai trị quan trọng k ỹ thuật A D N tái t ổ hợp A D N - ligase xúc tác hình thành liên k ế t phosphodiester 5-3' nucleotid c ù n g m ộ t sợi phân tử A D N K ế t q u ả n g u y ê n tử C3 p h â n tử đường deoxyribose m ộ t nucleotid liên kết v i p h â n tử C5 p h â n tử đường nucleotid qua p h â n tử phosphaíe Kinase enzym l m phosphoryl hoa c chất tạo liên k ế t đ n g hoa trị phosphate A T P v i p h â n tử c chất 4.2.3 ADN - polymerase ARN - polymerase C c enzym n y tham gia vào q u trình sinh tổng hợp A D N A R N v i việc sử dụng m ộ t sợi A D N k h u ô n (template) m i (primer) A D N A R N Trong k h i việc tổng hợp A R N c ó t h ể bắt đ ầ u h o n toàn m i T ổ n g hợp A D N A R N enzym đ i ề u k i ệ n i n vitro c ó ý nghĩa quan trọng sinh học p h â n tử V í dụ, n h â n c c trình tự A D N phản ứng c h u ỗ i polymerase (PCR) Phản ứng PCR cần phải sử dụng A D N - polymerase b ề n v i nhiệt đ ộ g ọ i Taq A D N polymerase E n z y m hoạt hoa t ố i ưu nhiệt đ ộ ° c Trong trường hợp A D N tổng hợp t m A R N i n vitro v i việc sử dụng enzym c h é p ngược (reverse transcriptase) g ọ i c A D N 103 4.3 C Ô N G N G H Ệ A D N T Á I T ổ H Ợ P T h ế n o m ộ t A D N t i t ổ h ợ p T A D N tổng số tách k h ỏ i m ộ t c t h ể sống, n g i ta c ó t h ể cắt A D N t h n h n h i ề u p h â n đ o n A D N k h c C c p h â n đ o n t c h r i n y c ó t h ể chứa m ộ t vài gen Đ o n A D N n y c ó t h ể g h é p n ố i v i m ộ t A D N vector ( g ọ i A D N mang), A D N vector mang theo n ó m ộ t đ o n A D N m i g ọ i A D N tái t ổ hợp A D N tái t ổ hợp k ế t hợp n ó c c p h â n đ o n A D N c c gen c ó n g u n gốc k h c A D N tái tổ hợp vector tái tổ hợp sau đ ó c ó thể chuyển v o v i k h u ẩ n V i khuẩn mang gen m i c ó thể sinh sản nhanh tạo t h n h m ộ t quần lạc (colony) - tập hợp t ế b o c ó nguồn gốc t m ộ t t ế b o ban đ ầ u - v i h n g triệu t ế b o mang gen M ộ t colony hay quần lạc t ế b o c ù n g mang c c A D N tái t ổ hợp g i ố n g g ọ i d ị n g A D N V ì từ A D N tổng số m ộ t t ế b o n g i ta c ó t h ể cắt A D N t h n h v ô s ố p h â n đ o n A D N k h c (có t h ể lên h n g chục n g h ì n p h â n đ o n A D N ) , v ậ y sau k h i chuyển c c đ o n gen n y v o v i k h u ẩ n t h ô n g qua c c vector n g i ta n h ậ n h n g loạt (vơ số) c c colony ( d ị n g t ế b o ) mang c c gen k h c Bước t i ế p theo chọn lọc c c d ò n g t ế b o mang c c gen quan t â m (gen đặc t h ù mang m ộ t t í n h trạng d i t r u y ề n x c định) 4.3.2 Ý nghĩa việc tách gen đặc thù - Cần cho việc x c định trình tự nucleotid gen n y - Sau k h i trình tự gen đ ã x c định, c ă n v o m ã d i t r u y ề n n g i ta c ó thể x c định gen n y m ã hoa sinh tổng hợp protein n o b ê n gen n y c ó m ấ y đ o n intron vị trí intron b ê n gen N h v ậ y , x c đ ị n h chức n ă n g gen t h ô n g qua việc t ì m protein n o sản p h ẩ m gen - So s n h trình tự A D N c c gen c c allel k h c c ù n g m ộ t gen t đ ó t ì m h i ể u q u trình t i ế n hoa gen - Chức n ă n g gen quan t â m c ó t h ể n g h i ê n cứu c c h c h u y ể n gen n y v o t ế b o t h ể sống k h c v n g h i ê n cứu thay đ ổ i t ế b o hay c t h ể sống đ ó N h gen n g h i ê n cứu b i ể u h i ệ n c t h ể c h u y ể n gen v chức n ă n g gen thể 4.3.3 Các bước tạo ADN tái tổ hợp 4.3.3.1 Tách chiết AD N Bước Ì tách A D N từ t ế b o t c t h ể sống quan t â m A D N vector C c p h n g p h p tách chiết A D N t c c n g u n k h c k h c v đ ã n h i ề u tài l i ệ u m ô tả A D N tổng số c ó t h ể t c h t n h â n t ế b o t ế b o n h â n thực (eukaryote) từ A D N lục l p ty t h ể , t n h i ễ m sắc t h ể t ế b o t i ề n n h â n (prokaryote) N h i ễ m sắc t h ể t ế b o t i ề n n h â n m ộ t p h â n tử A D N m c h v ò n g 104 A D N vector c ó t h ể plasmid m c h v ò n g v i k h u ẩ n A D N siêu v i k h u ẩ n , ví d ụ A D N siêu v i k h u ẩ n X 4.3.3.2 Phân cắt ADN P h â n cắt A D N thực h i ệ n n h c c e n z y m cắt g i i h n ( r e s t r i c t i o n e n z y m ) E n z y m cắt g i i h n v i k h u ẩ n t o đ ể c h ố n g l i x â m n h ậ p c c s i ê u v i k h u ẩ n C c e n z y m cắt hoạt đ ộ n g n h n h ữ n g c h i ế c k é o cắt A D N s i ê u v i k h u ẩ n t h n h n h i ề u đ o n n h ỏ l m cho n ó m ấ t k h ả n ă n g sinh sản t r o n g t ế b o v i k h u ẩ n T u y n h i ê n , c c e n z y m cắt k h ô n g p h â n cắt A D N c c vị t r í t h í c h C h ú n g c h ỉ p h â n cắt A D N c c v ù n g c ó t r ì n h tự n u c l e o t i d đặc t h ù m t h ô i D o v ậ y , A D N c c t ế b o sống t đ n g i ả n ( n h virus) đ ế n phức t p n h t ế b o n g i đ ề u c ó chứa m ộ t s ố c c t r ì n h t ự A D N n g ắ n g ọ i đ i ể m p h â n cắt (restriction - e n z y m target site) C c e n z y m cắt p h â n cắt A D N c c đ i ể m p h â n cắt k h c tạo v ô s ố c c p h â n đ o n A D N k h c C c p h â n đ o n n y c ó t h ể t c h t h n h n h ữ n g v ệ t ( b ă n g ) đ ặ c t r n g q u t r ì n h đ i ệ n d i M ộ t p h â n tử A D N c ó t h ể c ó đ o n trình t ự nucleotid đặc t h ù m đ o n đ ó hai sợi A D N c ó trình tự nucleotid n h n h n g chạy ngược c h i ề u N h ữ n g trình tự nucleotid đặc t h ù n h v ậ y g ọ i c c palindrom N h i ề u enzym cắt g i i hạn nhận biết cắt p h â n tử A D N t h n h c c m ả n h n h ỏ t i v i trí palindrom V í dụ: E n z y m cắt E c o R I (từ E.coli) c ó t h ể n h ậ n b i ế t cặp trình tự g m nucleotid bất k ỳ c t h ể sống n o d i đ â y : 5" - G A A T T C - ' 3' - C T T A A G - ' Trình tự n y g ọ i palindrom, vị trí cắt palindrom n y E c o R I n h sau: 5'-GAATTC-3' _ 3" CTTAAG-5' ^ 5' - G A A T T C - 3' y _ C X T A - A T o hai sợi c ó c c đ ầ u đ í n h sau - - • " G - 5' Các điểm cắt gọi đầu dính dễ dàng bắt cặp với đoạn A D N k h c c ó c c đ ầ u d í n h t n g đ ổ n g K ế t q u ả đ o n A D N g h é p n ố i v i k ế t n ố i thực h i ệ n b i c c liên k ế t hydrogen c c nucleotid sợi đ ố i xứng Enzym E c o R I sử dụng đ ể cắt m ộ t plasmid m c h v ò n g tạo sợi plasmid A D N thẳng v i đ ầ u d í n h 105 Hai đ ầ u d í n h n y d ễ k ế t n ố i v i m ộ t đ o n gen ( A D N ) c ó đ ầ u đ í n h t n g đ ổ n g v i n ó tách từ t ế b o n g i từ bất k y c t h ể sống n o k h c K ế t q u ả tạo m ộ t plasmid mang gen l Đ â y m ộ t A D N tái tổ hợp P h n g p h p tạo m ộ t plasmid A D N tái tổ hợp đ ó plasmid (vector) sợi A D N ví d ụ n g i , cắt b i c ù n g m ộ t enzym E c o R I m ô tả s đ ổ 4.2: A D N n g i c ó the tạo n h i ề u m ả n h A D N k h c v i đ a u d í n h t n g đ n g v i đ ầ u dinh sợi plasmid K ế t ta c ó t h ể thu plasmid tái t ổ hợp k h c Trong q u trình g h é p n ố i hai sợi A D N , liên k ế t p h â n tử đ n g nucleotid n y v i p h â n tử phosphate nucleotid k h c c ù n g m ộ t sợi A D N tái t ổ hợp c â n c ó xúc tác m ộ t enzym đ ó n g vai trò k h â u n ố i g ọ i A D N - l i g a s e H i ệ n n g i ta sản x u ấ t t h n g m i h n g t r ă m c c enzym cắt k h c M ỗ i enzym cắt nhận biết cắt m ộ t trình tự A D N đặc thù sợi A D N (bảng 4.1) Trong bảng , c ó t h ể d ễ d n g nhận biết m ộ t số enzym cắt A D N k h ô n g tạo đ ầ u dính, t i vị trí cắt c c enzym n y tạo c c p h â n đ o n A D N c ó đ â u tù Tuy n h i ê n , m ả n h A D N đ ầ u tù v ẫ n c ó t h ể g h é p n ố i v i c c A D N k h c đ ể tạo c c A D N tái tổ hợp V i ệ c cắt A D N t h n h c c m ả n h n h ỏ c ó t h ể thực h i ệ n p h n g p h p c giới, đ ó dung dịch A D N lấc m n h v i c ó m ặ t c c m ả n h cứng M ộ t sợi A D N n h i ễ m sắc t h ể dài c ó t h ể bị đứt tạo t h n h c c đ o n c ó đ ầ u tù C c đ o n n y n h â n lên t h n h d ò n g A D N Nhiêm sắc thể người Gen interíeron yj NST plasmid bị cắt enzym cắt ^ Gen Interíeron ghép với plasmid Vi khuẩn hấp thụ plasmid + gen interíeron V Ghép nối Ghép nơi Gen interíeron Vi khuẩn sinh sản tạo vi khuẩn mang gen Tách chiết interíeron ^ Ni cấy vi khuẩn sản xuất interteron Sơ đồ 4.2 Tạo ADN tái tổ hợp sản xuất interỷeron người vi khuẩn 106 G i ả i thích s đ 4.2: Các bước tạo v i khuẩn mang gen i n t e r í e r o n tái tổ hợp: Cắt A D N n h i ễ m sắc thể n g i c ó đ o n mang gen Interferon A D N Plasmid c ù n g enzym cắt tạo c c p h â n đ o n A D N c ó đ ầ u d í n h tương Đ o n A D N mang gen Interferon tái t ổ hợp v i A D N Plasmid tạo Plasmid tái t ổ hợp-mang gen Interferon Chuyển plasmid tái tổ hợp v o t ế b o v i k h u ẩ n đ ể tạo d ò n g v i k h u ẩ n mang gen Interferon N u ô i c ấ y d ò n g v i k h u ẩ n mang gen I n t e r í e r o n b ì n h n u i í e r m e n t o r đ ể sản xuất I n t e r í e r o n t h n g mai Bảng 4.1 Vị trí cắt ADN sô enzym N g u n gốc T ê n enzym EcoRỈ đặc trưng Escherichia coli giới hạn VỊ t r í cắt đ ặ c t h ù A D N ị 5' - G - A - A - T - T - C -C-T-T-A-A-G- 5' t EcoRII E.coli ị 5' -G-C-C-T-G-G-C-C-G-G-A-C-C-G- 5' t Hindlỉỉ H.influenzae ị 5' - A - A - G - C - T - T -T-T-C-G-A-A- 5' t HaelII H aegyptius 5' ị -G-G-C-C-C-C-G-G- 5' t Hpall H.paraỉnfluenzae 5' ị -C-C-G-G-G-G-C-C- 5' t Pstỉ Provìdencia stuartii 5' ị -C-T-G-C-A-G-G-A-C-G-T-C- 5' t 107 Smal Serratia marcescens 5' ị -C-C-C-G-G-G-G-G-G-C-C-C- 5' í Bám! Bacillus amyỉolique/aciens 5' ị -G-G-A-T-C-C-C-C-T-A-G-G- 5' t B.globiggi Bglỉl 5' ị -AG-A-T-C-T-T-C-T-A-G-A- 5' t Hindll Haemophilus influenzae ị 5' -G-T-Py-Pu-A-C-C-A-Pu-Py-T-G- 5' t 4.3.3.3 Ghép nối ADN T h ô n g thường, A D N thể cho (donor D N A ) v ADN vector p h â n cắt b i c ù n g m ộ t enzym t h n h n h i ề u m ả n h A D N k h c c ó đ ầ u d í n h K h i c c m ả n h A D N n y h ỗ n hợp v i m ộ t ống n g h i ệ m , c h ú n g tạo c c p h â n t A D N tái tổ hợp V ì m ộ t enzym cắt c ó t h ể p h â n chia A D N m ộ t thể cho t h n h r ấ t n h i ề u đ o n k h c mang c c trình tự A D N (hoặc c c gen) k h c K h i h ỗ n hợp l o i A D N , dung dịch đ ã c ó n h i ề u sợi plasmid mang đ ầ u d í n h t n g đ n g , n ê n n g i ta c ó t h ể thu n h ậ n r ấ t n h i ề u c c plasmid vector tái t ổ hợp mang c c gen k h c thể cho C h ú ý q u trình g h é p n ố i c c đ o n A D N cho (donor) v A D N plasmid cần c ó tham gia enzym ligase E n z y m n y đ ó n g vai t r ị g h é p n ố i liên k ế t đ n g - phosphate sợi A D N 4.3.3.4 Nhân nhanh ADN tái tổ hợp Plasmid A D N tái t ổ hợp c ó t h ể c h u y ể n m ộ t c c h k h d ễ d n g v o v i k h u ẩ n T r o n g t ế b o v i k h u ẩ n , c c plasmid c ó t h ể n h â n l ê n n h i ề u l ầ n V ì p l a s m i d tái t ổ hợp mang c c A D N c t h ể cho, n ê n c c A D N n y n h â n b ả n l ê n n h i ề u l ầ n c ù n g v i n h â n plasmid mang n ó K ế t q u ả t ế b o v i k h u ẩ n c ó t h ể c ó r ấ t n h i ề u plasmid tái t ổ hợp N h t ế b o v i k h u ẩ n c ó t h ể sinh sản theo c ấ p s ố n h â n , m ộ t t h i gian ngắn t m ộ t t ế b o mang plasmid tái t ổ hợp c ó t h ể t o 108 q u ầ n lạc g m n h i ề u t ỷ p h i ê n giống A D N tái t ổ hợp mang đ o n gen quan t â m c t h ể cho H i ệ n c ó n h i ề u l o i vector k h c sử d ụ n g đ ể n h â n d ò n g gen, lựa c h ọ n vector c ò n phụ thuộc v o k í c h thước đ o n A D N l c ầ n n h â n nhanh N h v ậ y n g i ta c ó t h ể d ù n g c c A D N vector c ó n g u n gốc k h c ( A D N vector c ó t h ể g ọ i A D N mang hay A D N mang chuyển) đ ể g h é p v i c c m ả n h A D N mang c c gen quan t â m k h c c t h ể cho Đ ể t i ệ n cho việc thao tác c h u y ể n gen, vector mang gen cần c ó m ộ t số tiêu chuẩn chung là: - K í c h thước phải n h ỏ - C ó k h ả n ă n g tự n h â n n h i ề u l ầ n t ế b o đ ó n h â n gen quan t â m (gen lạ) lên nhiều l ầ n - C ó đ i ể m cắt g i i hạn t r ê n vector thích hợp cho g h é p n ố i v i gen l N ế u m ộ t plasmid chi c ó m ộ t đ i ể m cắt enzym t h u ậ n l ợ i h n ta c ó t h ể d ễ d n g hem nhận biết vị trí g h é p n ố i gen l - D ễ d n g x c định p h t h i ệ n A D N tái t ổ hợp 4.4 NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC GEN VÀ ÚNG DỤNG KỸ THUẬT ADN TÁI TỔ HỢP Ngay sau k h i k ỹ thuật A D N tái t ổ hợp đ i n g i ta đ ã đ ầ u t ứng dụng k ỹ thuật lĩnh vực y t ế T r o n g c ô n g b ố U y ban c h â u  u (1998) cho biết: "lĩnh vực sức khoe, thức ăn, k i ể m soát bệnh dịch bệnh virus v t ế b o n h m y " c c hoạt động c h ì a khoa khoa học c ô n g nghệ V i ệ c p h ò n g v chữa trị bệnh đ ã đ ó n g vai trị thiết y ế u c ả i t h i ệ n chất lượng đ i sống G i ả m giá c h ă m s ó c y t ế r ấ t quan trọng N g i ta t í n h Ì đ n g E U R O chi cho t i ê m chủng c ó t h ể tiết k i ệ m 21-29 E U R O chữa bệnh T h i trường vacxin t h ế g i i v o khoảng t ỷ E U R / n ă m t ă n g trưởng thị trường n y khoảng 9,7% n ă m C c sản p h ẩ m C N S H d ự k i ế n t ă n g 15% n ă m Các sản p h ẩ m A D N tái t ổ hợp c ó giá trị y t ế erythropoietin (EPO), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF ), a- I n t e r í e r o n ( a - I F N ) , hormon sinh trưởng n g i (human growth hormone ( h G H ) , insulin G ầ n đ â y , khoa học đ a n g sử dụng c ô n g nghệ A R N i đ ể sản x u ấ t A R N ngắn c ó k h ả n ă n g đ i ề u trị b ệ n h H I V , k i ể m soát c c bệnh virus, bệnh ung t h n g i 4.4.1 a-Interferon tái tổ hợp I n t e r í e r o n c c protein glycoprotein tự n h i ê n t ế b o sản sinh k h i c ó tác n h â n g â y bệnh x â m nhập v o thể n g i a-Interferon c ó t h ể t ế b o bạch cầu (leucocytes) lymphoblasts n g i c ô n g n g h ệ A D N tái t ổ hợp sản xuất a-Interferon protein 19 k D a sử dụng 109 chữa bệnh đ n g sinh dục, v i ê m gan B m ã n (chronic hepatitis B ) , v i ê m gan k h ô n g A v k h ô n g B (non-A, non-B Hepatitis), kaposi sarcoma liên quan v i A I D Công nghệ sản xuất: Chủng E C o l i c h u y ể n gen v i plasmid mang gen a - I F N n g i Các t ế b o E C o l i c h u y ể n gen sản sinh Ct-IFN đ ã thu hoạch sau l ê n men Sau đ ó CC-IFN tinh c h ế v i đ ộ cao v i hoạt t í n h đặc t h ù 200 t r i ệ u đ n vị/mg Sản p h ẩ m c ó k h ả n ă n g t h n g m i đạt n â n g suất k h o ả n g 15-25 mg/1 m ô i t r n g G ầ n đ â y v i sử dụng bioreactor dung tích lít, đ ó m i t r n g n u ô i c ấ y d u n g t í c h 3,5 lít đ ã sản x u ấ t 14 g a - I F N , x ấ p x ỉ 4,0 g/lít Đ ó k ế t q u ả p d ụ n g c ô n g n g h ệ n u ô i cấy v i mật đ ộ t ế b o cao (high cell density cultivation- H C D C ) , n g u n cacbon d u y glucose k í c h thích sinh tổng hợp a - I F N y ế u t ố n h i ệ t đ ộ 4.4.2.Ỵ-Interferon tái tổ hợp người I n t e r í e r o n sản p h ẩ m tự v ệ c t h ể Phản ứng c t h ể bắt đ ầ u việc tổng hợp oe, p y-Interferon Ỵ-Interferon t ế b o c ó n g u n gốc t T h y m u s tiết sau k h i c t h ể bị n h i ễ m bệnh v i k h u ẩ n hay virus Ỵ-IFN c ó hoạt t í n h c h ố n g virus, v i t r ù n g , ung t h m i ễ n dịch Đ â y protein sử d ụ n g đ ể chữa c c b ệ n h v i ê m k h p , viêm đ n g sinh dục, v i ê m da, ung t h t ế b o thận, b i ể u b ì , chứng n h i ễ m hắc t ố c t í n h Phạm v i sử dụng y - I F N đ a n g m rộng T r ê n 200 gen đ i ề u k h i ể n b i Ỵ-IFN 4.4.3 Sản xuất bFGF (Basis FibrobIast Growth Factor) N ă m 1980, Thomas p h t h i ệ n chất b F G F c ó chất m ộ t protein hypophysis (tuyến y ê n n ã o ) tiết Sau đ ó h n g loạt c c c ô n g t r ì n h n g h i ê n cứu v ề b F G F đ ã đ i bFGF b ò b F G F n g i k h c axit amin T n ă m 1986, c c p h ò n g thí n g h i ệ m n h i ề u nước t h ế g i i đ ã bắt đ ầ u n g h i ê n cứu k ỹ thuật A D N tái t ổ hợp đ ể sản xuất bFGF d ù n g y học v m ỹ p h ẩ m Gen tổng hợp b F G F t c h t b ò n g i đ ã thiết k ế chuyển v o E c o l i C h ế p h ẩ m b F G F sản x u ấ t t r ê n n i lên men í e r m e n t o r v i c c chủng E c o l i mang gen n y M ộ t í e r m e n t o r 50 lít c ó t h ể sản xuất đ ủ số lượng bFGF cho nước Trung Q u ố c b F G f m ộ t protein c ấ u t r ú c k h đ n giản, đ n sợi, sợi ngắn v i số lượng 146 axit amin, đ n gen, c ó hoạt t í n h sinh học cao đ ố i v i n g i đ ộ n g v ậ t n ê n c ó ý nghĩa y học v t h n g m i l n V ì đ n gen m ã hoa bFGF n ê n việc tạo sản p h ẩ n A D N tái t ổ hợp chuyển gen v o E c o l i k h đ n g i ả n 4.4.4 Vacxin tái tổ hợp phòng viêm gan B - Hepatitis B virus Hepatitis B m ộ t bệnh dịch nguy h i ể m K h o ả n g hai t ỷ n g i h i ệ n đ ã n h i ễ m virus n y t h i đ i ể m n o đ ó C ó b ố n t r i ệ u n g i bị v i ê m gan c ấ p v t r ê n 350 t r i ệ u mang bệnh m ã n tính t h ế g i i K h o ả n g 15% số n g i mang virus m ã n t í n h (chronic carriers) c ó t h ể bị x gan ( c i h o s i s gan) thường d ẫ n đ ế n ung thư T ổ chức Y no t ế t h ế g i i ( W H O ) k ê u g ọ i nhập vacxin cho t i ê m chủng m r ộ n g N h n g m ộ t số nước c h a l m g i vacxin cao V a c x i n tái t ổ hợp đ ầ u tiên sản x u ấ t n ă m 1986 v b n t r ê n thị trường sau đ ó Công nghệ sản xuất: M ộ t đ o n A D N d i 720 cặp nucleotid (HBS) đ ã tách t virus g â y bệnh v i ê m gan B (Hepatitis B virus) đ ã gắn v i plasmid PBS+ Đ o n PBS/HBS đ ã chọn lọc đ ể thiết k ế vector b i ể u h i ệ n Đ o n PBS/HBS đ ã gắn v o p A O 815 vector n ấ m men c ó chứa gen A l c o h o l oxidase c ả m ứng cao T h i ế t k ế thu g ọ i expression cassette ( É C ) - b ă n g b i ể u h i ệ n M ộ t số c c n ò i chủng n ấ m men Pichia pastoris GS115 mang t Ì đ ế n đ o n l ặ p l i (copy) b ă n g b i ể u h i ệ n É C đ ã tạo b i ể u h i ệ n N ấ m men c h u y ể n HBS sản sinh k h n g n g u y ê n H B s A g Lượng H B s A g sản sinh phụ thuộc v o số lượng copy É C m ỗ i d ò n g Đ ặ c đ i ể m vacxin tái t ổ hợp là: V a c x i n k h ô n g p h ả i virus v i ê m gan đ ã bị l m y ế u m m ộ t đ o n gen virus gây bệnh n y K h i t i ê m chủng, gen HBS tạo t c c n ò i n ấ m men tái t ổ hợp c ó thể gây biểu h i ệ n m i ễ n dịch v i virus v i ê m gan B N ă n g suất thu 50mg/l sản phẩm vacxin c ó giá t h n h thấp N g h i ê n cứu đ ộ c tính vacxin tái t ổ hợp cho t h ấ y đ ộ an toàn cao 4.4.5 Kỹ thuật ADN tái tổ hợp sản xuất Kít chẩn đốn bệnh (virus HIV) Bệnh suy g i ả m m i ễ n dịch ( A I D S ) c c virus g â y ra, chủ y ế u H I V I H I V D ự tính c ó 30 t r i ệ u n g i bị n h i ễ m H I V v g ầ n t r i ệ u n g i đ ã mắc A I D S T r ê n 90% số n g i bị n h i ễ m b ệ n h c c nước đ a n g p h t t r i ể n H i ệ n t i , việc chẩn đ o n H I V / A I D S gặp k h ó k h ă n t h i ế u p h n g t i ệ n c h ẩ n đ o n bệnh H i ệ n n h i ề u c ô n g ty c c t ổ chức quốc t ế c ó b n kít c h ẩ n đ o n đặc t h ù r ấ t n h y k ỹ thuật A D N tái t ổ hợp đ ể phân tích H I V Ì v H I V Chẩn đ o n H I V m u dựa k ỹ thuật E L I S A t i ế n h n h n h sau: v i l ỗ (microvvells) m y E L I S A c ó chứa peptid tổng hợp virus peptid tái t ổ hợp virus m c ó k h ả n ă n g k í c h t h í c h p h ả n ứng tạo k h n g t h ể (antibody) n g i bệnh K h i nhỏ huyết t n g v o c c v i l ỗ , k h n g t h ể (antibody) c ó huyết t n g bệnh n h â n phản ứng v i c c peptid c c v i l ỗ C c k h n g t h ể bị gắn v i c c peptid phản ứng với anti-human immunoglobulins bắt cặp v i m ộ t chất thị - horseradiss peroxidase (HRP) M ứ c đ ộ bắt cặp v i H R P t h ể h i ệ n đ ộ n h i ễ m H I V Sử d ụ n g c c peptid c c loại H I V k h c l m t ă n g tính đặc t h ù chẩn đ o n B ộ kít g m c c peptid tạo k ỹ thuật A D N tái t ổ hợp c ó đ ộ n h y tính đặc thù cao 4.4.6 Chẩn đoán virus viêm gan c (Hepatitis c virus - HCV) N h i ê m hepatitis c virus thường liên quan t i x gan t h n g đ ẫ n đ ế n ung t h gan K h o ả n g 1/2 số n g i n h i ễ m virus c ó t h ể bị v i ê m gan m ã n D ự đ o n c ó 1-2% d â n số t h ế g i i bị v i ê m n h i ễ m m ã n tính Bên cạnh dạng m ã n tính, c ó dạng v i ê m cấp C h ẩ n đ o n bệnh virus H C V c c nước đ a n g p h t t r i ể n gặp k h ó k h ă n t h i ế u b ộ kít chẩn đ o n IU Công nghệ: C h ẩ n đ o n H C V dựa v o k ỹ thuật E L I S A : Peptit virus H C V tổng hợp n h k ỹ thuật A D N tái t ổ hợp Phủ v i l ỗ (microvvells) c c peptid virus C c peptid n y g â y việc tổng hợp k h n g t h ể antibody n g i K h n g t h ể antibody huyết t n g phản ứng v i c c peptid v i l ỗ K h n g n g u y ê n l i ê n k ế t đ ó l i phản ứng t i ế p v i anti-human i m m u n o g l o b i l i n bắt cặp v i chất t h ị H R P H R P l i ê n k ế t cho biết mức đ ộ n h i ễ m H C V P h n g p h p c ó đ ộ nhạy t í n h đặc t h ù cao 4.5 KỸ THUẬT ADN TÁI Tổ HỢP PHỤC vụ CHUYỂN GEN VÀO CÁC CÂY TRỒNG Đ ế n n ă m 2006, c â y trổng chuyển gen đ ã sản x u ấ t t h n g m i 22 q u ố c gia, đạt d i ệ n tích tồn cầu 102 t r i ệ u ha, t ă n g 12 t r i ệ u so v i n ă m 2005 Đ ậ u t n g , n g ô , b ô n g c ả i dầu c â y trồng b i ế n đ ổ i gen c h ủ lực, c h i ế m h ầ u hết d i ệ n t í c h c â y chuyển gen toàn cầu C c t í n h trạng quan trọng c c g i ố n g c â y t r n g b i ế n đ ổ i g n h i ệ n k h n g chất d i ệ t cỏ gen k h n g sâu C c giống mang gen k h n g virus, n ấ m bệnh c c đ i ề u k i ệ n bất l ợ i k h c m i trồng d i ệ n hẹp 4.6 QUAN ĐIỂM VỀ CÔNG NGHỆ GEN VÀ GIỐNG CÂY TRỔNG CHUYỂN GEN V i đ i c ô n g n g h ệ gen n g i đ ã ữở t h n h đ ấ n g s n g t o m i M ặ c dù vậy, cho đ ế n sản p h ẩ m C N S H s n g tạo c ò n r ấ t k h i ê m t ố n so v i s n g tạo t h i ê n n h i ê n Theo V i ệ n sỹ Dobzhanski c ó đ ế n 1,0 t r i ệ u l o i đ ộ n g vật 265,5 n g h ì n lồi thực vật k h c M ỗ i loài l i c ị n c ó v s ố n h ữ n g d n g thức t n đ a dạng T h i ê n n h i ê n đ ã tạo m ộ t t h ế g i i sống cực k ỳ đ a dạng, đ ó c ó sinh vật hữu ích sinh vật g â y bệnh h i cho n g i v sinh g i i , k ể n g i k ẻ thù loài n g i N h ữ n g t c n h â n g â y b ệ n h h i cho m ô i t r n g n g i c ò n đ a n g t i ế p tục h ì n h t h n h , v í d ụ n h c c virus m i đ a n g t i ế p tục x u ấ t hiện, đ ó virus m i nguy h i ể m c ó t h ể tổng hợp, c ả i b i ê n c c p h ị n g thí n g h i ệ m D o v ậ y , c h ú n g ta lưu ý đ i ể m sau: - N h ữ n g s n g tạo m i C N S H m ộ t b ộ p h ậ n t o n b ộ s n g tạo t h i ê n n h i ê n , mặc d ù h i ệ u q u ả n ó c h a t h ể l n g trước - Tài n g u y ê n sinh vật trái đ ấ t cần p h ả i c o i gốc r ễ t n t i loài n g i N h ữ n g s n g tạo d i t r u y ề n học m i cần x e m n h c n h , n h n g ọ n k h ô n g t h ể đ ố i l ậ p v i s n g tạo trước đ ó t h i ê n n h i ê n - V i ệ c bảo t n v k h a i t h c hợp l ý tài n g u y ê n sinh v ậ t , t r o n g đ ó c ó c c n g u n gen h ữ u í c h , p h ả i n ề n t ả n g v ữ n g cho n hoa k ế t t r i c ô n g n g h ệ gen, dựa t r ê n n ề n tảng đ ó t h ì c c c t h ể c h u y ể n gen m i m a n g l i h i ệ u q u ả k i n h t ế v s i n h t h i bền vững - Sản p h ẩ m giống C N S H c ó t h ể sinh vật hữu ích n h n g c ũ n g c ó t h ể sinh vật g â y h i , p h v ỡ c â n sinh thái, sinh v ậ t g â y bệnh dịch v v ũ k h í sinh học 112 - V ì t h ế quan đ i ể m c h ú n g ta đ ố i v i c ô n g n g h ê gen k h ô n g p h ả i quan đ i ể m m ộ t c h i ề u , đ n d n g tính, m p h ả i c c h n h ì n t o n d i ệ n t n h i ề u p h í a - Sự p h ủ n h ậ n h o n t o n đ ố i v i c c sản p h ẩ m c ô n g n g h ệ gen đ a n g thịnh h n h h i ệ n m ộ t số n g i , c h â u A u k h ô n g c ô n g b ă n g , p h i ế n d i ệ n , c ó tính t h ị i - N h n g n h ữ n g quan đ i ể m thần t h n h hoa vai trị c n g n g h ệ gen, coi t h n g c ô n g n g h ệ d i t r u y ề n t r u y ề n thống, bất c h ấ p c c n g h i ê n cứu v ề an t o n sinh học k h ô n g t h ể c h ấ p n h ậ n Con n g i đ a n g d ầ n trở t h n h " Đ ấ n g s n g tạo m i " d n g thức sống m i V i t h n h tựu k ỹ thuật d i t r u y ề n n g u ô i vượt qua m ộ t số bệnh tật nan y v trở n ê n k h ỏ e m n h h n , sống lâu h n , c ó trí n h v k h ả n ă n g s n g tạo b ề n vững h n Trong t h ế k ỷ t h ứ X X I n y C N S H m ộ t c h ộ i m i đ ố i v i p h t t r i ể n c ó tính chất b ù n g n ổ n ô n g nghiệp, y học t i ế n hoa c h í n h b ả n t h â n n g i n ế u n h c h ú n g ta t r n h c c m ặ t trái n ó 4.7 THƯ VIỆN ADN N h ta đ ã p h â n tích, m u ố n n g h i ê n cứu genom v chức n ă n g gen m ộ t c t h ể trước tiên n g u ô i ta p h ả i t c h A D N tổng s ố t t ế b o Sau đ ó , p h â n đ o n n h â n d ò n g c c p h â n đ o n k h c genom K ế t q u ả n g i ta thu m ộ t b ộ sưu tập l n t ấ t d ò n g A D N t ế b o g ọ i t h v i ệ n A D N ( A D N library) 4.7.1 Phân loại thư viện ADN P h â n l o i t h b i ệ n A D N dựa đặc t r n g : - L o i vector n o đ ã sử dụng - Nguồn A D N C c vector n h â n d ò n g A D N (cloning vector) k h c mang c c p h â n đ o n A D N k h c D o v ậ y v i ệ c lựa c h ọ n c c vector phụ thuộc v o đ ộ l n genom Plasmid vector siêu v i k h u ẩ n mang lượng A D N n h ỏ , c h ú n g t h í c h hợp đ ể n h â n d ò n g c c c t h ể đ n g i ả n c ó genom n h ỏ Cosmid c ó k h ả n ă n g g h é p n ố i v i c c A D N l n h n , c c vector n h Y A C S v B A C S c ó t h ể mang theo lượng A D N l n T h v i ệ n siêu v i k h u ẩ n (phage library) m ộ t dịch l ỏ n g siêu v i k h u ẩ n (suspension o f phagas) T h v i ệ n plasmid t h v i ệ n cosmid dịch l ỏ n g v i k h u ẩ n (suspension o f bacteria) m ẫ u v i k h u ẩ n n u ô i c ấ y ố n g n g h i ệ m đĩa petri Thư viện cADN: T h v i ệ n c A D N ( c A D N library) tập hợp c c p h â n t c A D N t ổ n g hợp t A R N t h ô n g t i n v i tham gia enzym c h é p ngược (enzym n y t c h t retroviruses) 113 Bước m ộ t A R N t h ô n g t i n sử dụng l m sợi k h u ô n đ ể t ổ n g hợp m ộ t A D N đ n sợi Sau đ ó A D N đ n sợi n y l i trở t h n h k h u ô n cho tổng hợp A D N sợi k é p V ì c A D N tổng hợp t m A R N n ê n c A D N k h ô n g c ó chứa c c đ o n A D N đ i ề u k h i ể n hoạt hoa gen c c introns Đ i ề u đ ó c ó nghĩa c A D N t c t h ể t ế b o n h â n thực c ó k h ả n ă n g tổng hợp protein t ế b o v i k h u ẩ n T h v i ệ n c A D N g m c c gen b i ể u h i ệ n q u t r ì n h d ị c h m ã t A D N t h n h m A R N m A R N c ó t h ể tổng hợp c c t ế b o , c quan m ô n h ấ t định, thời đ i ể m x c định T h v i ệ n n y k h ô n g chứa c c gen đ i ề u k h i ể n c c t r ì n h t ự m ã hoa introns Thư viện genomic: T h v i ệ n genomic chứa t ấ t c c p h â n đ o n genom, t h v i ệ n n y l n h n so với thư viện c A D N V í d ụ : T h v i ệ n genom c ó t h ể tạo n h â n d ò n g gen b i s i ê u v i k h u ẩ n X n h sau: - Genom t ế b o v genom siêu v i k h u ẩ n cắt đ o n b i c c e n z y m cắt tạo v ô số c c đ o n p h â n cắt A D N k h c genom - C c đ o n p h â n cắt A D N genom g h é p n ố i (hay c ó t h ể g ọ i l a i ) v i A D N siêu v i k h u ẩ n c ó đ ầ u d í n h t n g đ n g n h enzym ligase tạo t h n h v ô s ố c c A D N siêu v i k h u ẩ n lai c c vectors mang c c đ o n A D N k h c genom - C c vector (siêu v i k h u ẩ n lai) mang genomic A D N lây n h i ễ m v o q u ầ n t h ể vi k h u ẩ n M ỗ i v i k h u ẩ n t i ế p n h ậ n m ộ t siêu v i k h u ẩ n l a i K ế t q u ả genom l a i siêu vi k h u ẩ n n h â n lên n h i ề u l ầ n M ỗ i m ộ t k h u ẩ n lạc v i k h u ẩ n bị l â y n h i ễ m Ì siêu v i k h u ẩ n , tạo t h n h v ô số c c k h u ẩ n lạc (clones), đ ó m ỗ i k h u ẩ n lạc mang theo Ì d ị n g siêu v i k h u ẩ n l a i (mang m ộ t p h â n đ o n A D N ) đ ã n h â n n h i ề u l ầ n - T ậ p hợp t ấ t c c quần lạc v i k h u ẩ n mang c c d ò n g s i ê u v i k h u ẩ n l a i k h c nhaum ỗ i d ò n g mang theo Ì đ o n A D N genom t ế b o , tạo t h n h t ậ p hợp t ấ t c c d ò n g siêu v i k h u ẩ n lai mang c c đ o n genomic A D N t ế b o g ọ i m ộ t t h viện genomic t ế b o 4.7.2 Phương pháp phát dòng mang gen quan tâm - Chuẩn bị sẵn m ộ t đ o n A D N A R N đ ã b i ế t c ó quan h ệ v i gen quan t â m ( g ọ i A D N m i A R N m i ) - T ậ p hợp siêu v i k h u ẩ n l a i c h u y ể n lên m n g l ọ c nitrocellulose v l m cho protein v ỏ c c siêu v i k h u ẩ n bị hoa tan bị rửa c ò n l i A D N l a i t r ê n m n g lọc - L m cho c c sợi A D N k é p m x o ắ n thu nhận c c A D N đ n sợi ( t c h c c A D N k é p t h n h c c A D N đ n sợi), A D N lai đom sợi n y b m d í n h v o m n g íilter l ọ c 114 - M n g l ọ c n y n u ô i ủ dung dịch chứa m ộ t đ o n m i đ ã đ n h d ấ u b i c h ấ t p h ó n g x chất p h t quang n h u ộ m m u í l u o r e s c e n c e ( đ o n m i n y c A D N n h â n lên t m ộ t m A R N t h ô n g t i n ) - Đ o n m i bắt cặp lai v i bất k ỳ đ o n A D N n o số c c A D N t h v i ệ n genom m c ó trình tự tương đ n g v i n ó m n g l ọ c - C ă n v o vị trí A D N lai c ó p h ó n g x m n g đ ể x c định d ò n g ( k h u ẩ n lạc) mang g n đ ã bắt cặp v i c A D N m i , c h ọ n lọc k h u ẩ n lạc đ ó n h â n lên đ ể thu nhận d ò n g siêu v i k h u ẩ n mang gen x c đ ị n h mong m u ố n Vì t h v i ệ n genomic A D N c ó chứa n h i ề u ( h n g t r ă m đ ế n h n g n g n c c đ o n A D N k h c t ế b o ) D o v ậ y , đ ể x c định d ò n g mang gen quan t â m t h v i ệ n n g i ta phải sử d ụ n g c c đ o n m i đặc t h ù C ó hai l o i m i : l o i m i n h ậ n biết A D N l o i m i n h ậ n b i ế t protein 4.7.3 Mồi nhận biết ADN P h n g p h p n y dựa chất tự n h i ê n m ộ t đ o n trình t ự A D N đ n sợi cần tìm k i ế m g h é p n ố i v i m ộ t đ o n A D N đ n sợi k h c c ó c c trình tự t n g đ n g v i n ó M i A D N đ n sợi bắt cặp v i đ o n A D N đ n sợi t n g đ n g v i n ó t h v i ệ n genomic A D N V ì đ o n m i đ ã đ n h d ấ u b i chất p h ó n g x chất m u p h t quang (Auorescence) n ê n n g i ta c ó t h ể d ễ d n g p h t h i ệ n đ i ể m c ó p h â n tử lai m n g n h m ộ t đ i ể m c ó p h ó n g x autoratiogam 4.7.4 Tạo ADN mồi (probe) N g u n A D N từ đ ó n g i ta chọn l m m i đ ể x c định m ộ t gen quan t â m c ó t h ể là: - c A D N : c A D N đ ợ c t c h c h i ế t t m ô m đ ó gen quan t â m b i ể u h i ệ n : V ì số lượng m A R N m ô r ấ t n h i ề u , v ậ y số l ợ n g c A D N v s ố vector mang c c c A D N k h c c ũ n g c ó t h ể đ a d n g T u y n h i ê n , m ộ t s ố t ế b o v m ô đặc t h ù t h ể , m ộ t vài gen đ ợ c t ă n g c n g b i ể u h i ệ n v c h i ế m s ố l ợ n g l n m A R N t h ô n g t i n , ví d ụ , m A R N sản p h ẩ m gen P - G l o b i n D o v ậ y , m ộ t s ố t ế b o c o i nguồn m A R N t ố t n h ấ t đ ể t o c c c A D N m i t r o n g t ì m k i ế m c c gen quan t â m t h v i ệ n genom Trong trường hợp sử dụng c A D N m i đ ể x c định m ộ t gen h ệ gen ta c ò t h ể xác định v ù n g dịch m ã gen quan t â m , k h i đ ó c A D N k h ô n g t h ể bắt cặp với c c đ o n đ i ề u k h i ể n c c đ o n introns gen n y D o v ậ y , ta cần t ì m k i ế m thêm nguồn A D N m i khác - A D N m i c ó n g u n gốc t c c gen t n g đ n g t c h t c c c t h ể sống c ó h ọ h n g gần v i đ ố i - t ợ n g n g h i ê n cứu V í d ụ , m ộ t gen n o đ ó n h â n d ò n g t ascomycetes n ấ m Neurospore c ó t h ể sử dụng l m m i đ ể x c định m ộ t gen 115 tương đ ổ n g n ấ m podospora P h n g p h p n y dựa t í n h l ặ p l i hay t í n h b ả o t h ủ c c trình tự A D N q u trình t i ế n hoa Trong trường hợp A D N m i v A D N gen quan t â m k h ô n g h o n toàn giống nhau, c h ú n g ta v ẫ n c ó t h ể c ó c c đ o n t r ì n h t ự t n g đ n g v ẫ n c ó t h ể lai g h é p v i - A D N m i c ó t h ể tạo k h i ta đ ã biết protein (sản p h ẩ m gen quan t â m ) protein đ ó đ ã x c định trình tự Dựa h i ể u b i ế t v ề m ã d i t r u y ề n ta c ó t h ể d ễ d n g thiết k ế trình tự A D N gen m ã hoa protein đ ó T u y n h i ê n , m ộ t axit amin protein c ó t h ể t n g ứng v i vài codon gen, v ậ y ta c ó t h ể t h i ế t k ế m ộ t số trình tự A D N k h c c ó k h ả n ă n g m ã hoa c ấ u trúc protein n y Đ ể tránh k h ó k h ă n n y , n g i ta tách trình tự protein t h n h đ o n n g ấ n h n t đ ó x c định trình tự c c đ o n m i v i số lượng nucleotid n h ỏ g ọ i c c oligonucleotids T m ộ t đoạn peptid c ó t h ể tạo m ộ t b ộ oligonucleotids g m t r ì n h t ự nucleotid dao động n h n g c ó k h ả n ă n g tạo c ù n g m ộ t peptid 4.8 Dự ÁN GENOM NGƯỜI Dự án Genom nhiều nước tổ chức quốc tế tham gia thực Ở Mỹ Dự án Genom B ộ N ă n g lượng (Department o f Energy) V i ệ n q u ố c gia v ề sức khoe (National Insititute o f Healths) đ i ề u p h ố i thực h i ệ n D ự án bắt đ ầ u t r i ể n khai t n ă m 1990, k é o d i 13 n ă m k ế t t h ú c v o n ă m 2003 sớm h n n ă m so v i d ự k i ế n ban đ ầ u 15 n ă m n h c c n g u n đ ầ u tư v t i ế n b ộ m i kỹ thuật M ụ c tiêu d ự n - X c định t ấ t c c gen n g i v i số lượng k h o ả n g 30.000 gen - X c định trình tự nucleotids k h o ả n g t ỷ cặp b a z A D N n g i - L u trữ t h ô n g t i n d ữ l i ệ u - C ả i t i ế n c c p h n g p h p p h â n tích d ữ l i ệ u - Chuyển giao c c c ô n g n g h ệ liên quan cho c c c ô n g ty tư n h â n - G i ả i c c v ấ n đ ề đ ặ t n h c c n g u y ê n tắc đ o đức, luật p h p , c c v ấ n đ ề xã hội khác 4.9 CÁC Dự ÁN NGHIÊN cứu CHỨC NĂNG HỆ GEN (FUNCTIONAL GENOMICS) VÀ SO S Á N H C H Ứ C N Ă N G H Ệ G E N ( C O M P A R A T I V E GENOMICS) - T o m ộ t tập hợp c c d ò n g C - A D N m ộ t c t h ể sống t đ ó x c đ ị n h t r ì n h tự gen n g h i ê n cứu c c protein - sản p h ẩ m gen 116 - X â y dựng c c p h n g p h p n g h i ê n cứu chức n ă n g c c t r ì n h t ự k h n g m ã hoa protein - P h t t r i ể n c ô n g n g h ệ k h c p h â n tích b i ể u h i ệ n gen - C ả i t h i ệ n c c p h n g p h p g â y h n g loạt c c đ ộ t b i ế n genom, m ấ t chức n ă n g , thay đ ổ i chức n ă n g gen h ệ gen, từ đ ó x c đ ị n h chức n â n g gen - C c c ô n g n g h ệ p h â n tích protein: đặc biệt đ i thiết bị proteomics cho p h é p p h â n tích p h â n biệt h n g n g h ì n protein c ù n g m ộ t l ú c - So s n h genom n g u ô i v i genom tinh tinh, k h ỉ so s n h genom n g i bệnh v i n g i bình thường, n g i c ó đặc tính siêu v i ệ t (trí nhớ, t u ổ i t h ọ , đ ộ t h ô n g m i n h siêu việt ) v i n g i b ì n h t h n g v i n g i c ó c c đặc t í n h đ ố i lập Chức n ă n g c c gen c c v ù n g A D N n g i c ó t h ể l m s n g tỏ n h n g h i ê n cứu tính đ n g v k h c b i ệ t h ệ gen c c loài sinh vật k h c so v i n g i - Đ ế n so s n h n y c ó t h ể thực h i ệ n n h c c n ỗ lực phi t h n g n h i ề u p h ò n g t h í n g h i ệ m t r ê n t o n cầu việc đ ọ c t o n b ộ trình t ự nucleotid c c h ệ genom sau: Cacnorhabditis vi khuẩn elegans, E.coỉi, nấm men Saccharomyces cerevisỉae, giun tròn r u i d ấ m , chuột t h í n g h i ệ m n h i ề u c t h ể sống k h c Sự so sánh n y tạo đ ộ t p h n g h i ê n cứu t i ế n hoa c c đ n g trao đ ổ i chất 117 ... học Sinh lý học Toán sinh học Điều khiển học sinh học Genom học Protein học Tế bào học Mô phôi học Sinh thái học Bệnh học Miễn dịch học Công nghệ tế bào Công nghệ erưym protein Công nghệ vi sinh. .. o a học c b ả n v ề sống - Di truyền học Sinh hoa học - Sinh học p h â n tử Bệnh học - T ế b o học Phỏng sinh học - M ô p h ô i học Đ i ề u k h i ể n học sinh học - Sinh lý học T o n sinh học. .. triển công nghệ sinh học? Công nghệ sinh học gì? Cơng nghệ sinh học bao gồm học công nghệ nào? ngành Quan hệ CNSH Các kiến thức Vai trò khám phá chất sống khả cải tạo sinh giới Vai trị cơng nghệ sinh