công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp kỹ thuật xác định trình tự DNA

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG (SH3014) Giảng viên hướng dẫn: ……. BM CNSH TV – Khoa CNSH BM-CNSHTV CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) 1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 3. Các phương pháp lai phân tử 4. Phương pháp PCR, ứng dụng 5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA BM CNSH TV – Khoa CNSH BM-CNSHTV KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA BM-CNSHTV Khái niệm Xác định trình tự DNA là phương pháp xác định trật tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA. BM-CNSHTV Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau Cho đến nay, hệ gen của hơn 100 tổ chức sinh vật đã đƣợc giải mã trình tự BM-CNSHTV Maxam-Gilbert (1977) Sanger (1977) Các phƣơng pháp xác định trình tự Xác định trình tự tự động  Xác định trình tự thế hệ mới BM-CNSHTV Phƣơng pháp Maxam-Gilbert • Là phương pháp phân giải hóa học • Sử dụng hóa chất để phân hủy DNA ở các vị trí base đặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau Walter Gilbert BM-CNSHTV  Dimethyl sulfat methyl hóa G.  Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G.  Hydrazin gây biến đổi tại C và T.  Hydrazin + NaCl nồng độ cao gây biến đổi tại C.  Piperidine được dùng để loại bỏ các base sau khi bị biến đổi và cắt mạch. Các loại hóa chất sử dụng BM-CNSHTV Base specificity Chemical used for base alteration Chemical used for altered base removal Chemical used for strand cleavage G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine A+G Acid Acid Piperidine C+T Hydrazine Piperidine Piperidine C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine A>C Alkali Piperidine Piperidine BM-CNSHTV G ATCTC G ATCTC GG CH 3 TCTCG A TCTCG A DNA labeled at one end with 32 P Base modification Release or displace- ment of reacted bases Strand scission Maxam and Gilbert chemical method J2 nucleic acid sequencing BM-CNSHTV [...]... Bài tập về nhà Giả sử đoạn DNA cần xác định trình tự có trình tự như sau: 3’ 5’ ATTCTCAATGCTATGCTA Nêu các bước tiến hành xác định trình tự theo phương pháp Sanger BM-CNSHTV Xác định trình tự DNA tự động Nguyên lý: • Hoạt động trên cơ sở của phương pháp Sanger Nhưng : • Quá trình tổng hợp DNA thực hiện nhờ kỹ thuật PCR • Các chất đánh dấu phát huỳnh quang được đưa vào mạch DNA tổng hợp mới nhờ sử dụng... thông tin về trình tự DNA thông qua bản gel điện di bên BM-CNSHTV Ƣu điểm của phƣơng pháp Sanger • Tính ổn định cao, có thể tiến hành với quy mô lớn • Phản ứng không phụ thuộc vào tính đặc trưng hoá của các chất hoá học, không có phản ứng phụ • Nếu kết hợp dùng với phản ứng PCR thì chỉ cần lượng DNA mẫu nhỏ, đồng thời có thể giảm được ảnh hưởng của DNA cấu trúc bậc 2 • Xác định được trình tự đoạn gen... ddTTP, ddGTP, ddCTP) − DNA polymerase − Dung dịch đệm thích hợp BM-CNSHTV DNA khuôn mạch đơn chưa biết trình tự DNA khuôn và mồi Mồi Chia thành 4 ống phản ứng Bổ sung DNA polymerase Các đoạn kết thúc bằng ddG Các đoạn kết thúc bằng ddC Các đoạn kết thúc bằng ddT Phân tách mạch mới được tổng hợp ra khỏi mạch khuôn Lớn nhất Nhỏ nhất BM-CNSHTV BM-CNSHTV VD bản gel điện di xác định trình tự theo phương pháp... Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàn toàn đặc trưng cho từng phản ứng riêng biệt, phản ứng phụ sẽ diễn ra ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm cắt • Đây là phương pháp xác định trình tự trực tiếp của DNA, do đó số lượng DNA mẫu cần dùng là rất lớn, nếu lượng mẫu ban đầu ít thì các băng điện di kết quả bằng phóng xạ tự ghi bị mờ, không rõ ràng, khó đọc chính xác • Phản ứng đòi hỏi DNA mẫu hoàn... Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method) •Phương pháp enzyme •Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơn được xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ sung Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tại các vị trí đặc hiệu DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơn đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không... BM-CNSHTV Sự kéo dài mạch DNA BM-CNSHTV Sự kéo dài mạch DNA khi xuất hiện ddNTP BM-CNSHTV Các bƣớc thực hiện 1 2 3 4 Chu ẩn bị DNA khuôn sợi đơn Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng Thực hiện phản ứng Điện di kết quả  Thu nhận kết quả giải trình tự DNA BM-CNSHTV Thành phần phản ứng Có 4 ống hỗn hợp phản ứng, mỗi ống chứa các thành phần như sau: − DNA khuôn mạch đơn − Mồi được tổng hợp hóa học (có thể đánh dấu phóng... các băng điện di kết quả bằng phóng xạ tự ghi bị mờ, không rõ ràng, khó đọc chính xác • Phản ứng đòi hỏi DNA mẫu hoàn toàn là mạch đơn, do vậy phải phân tách DNA thành các sợi đơn trước khi tiến hành xác định trỡnh tự • Chỉ áp dụng xác định trình tự đoạn gen tương đối ngắn, khoảng 250 bp BM-CNSHTV Phƣơng pháp Sanger • Còn gọi là phương pháp kết thúc mạch (chain termination method) hay phuong pháp dideoxyribonucleotide... Máy cũng như hệ thống phần mềm sẽ thu nhận thông tin về màu sắc và từ đó chuyển đổi sang thông tin về trình tự của DNA • Đọc kết quả điện di tự động nhờ tia laze và phần mềm xử lý số liệu BM-CNSHTV Các bƣớc tiến hành • Chuẩn bị DNA khuôn • Nhân DNA bằng PCR • Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự sequencer, chạy máy • Phân tích kết kết quả từ các dữ liệu do máy cung cấp, so sánh kết quả đọc trên hai... thống xác định trình tự DNA phát hiện sự phát huỳnh quang từ 4 chất nhuộm khác nhau được sử dụng để phân biệt A, C, G và T trong các phản ứng kéo dài Mỗi chất nhuộm hấp thu ánh sáng ở các bước sóng ở bước sóng khác nhau Có 4 màu và do đó 4 loại base có thể được phát hiện và phân biệt được với nhau Máy cũng như hệ thống phần mềm sẽ thu nhận thông tin về màu sắc và từ đó chuyển đổi sang thông tin về trình. .. Điện di gel Applied Biosystems PRISM 377 (Gel, 34-96 lanes) Điện di mao quản Applied Biosystems PRISM 3700 (Capillary, 96 capillaries) BM-CNSHTV Sequencing (Sanger) – kết quả BM-CNSHTV BM-CNSHTV Xác định trình tự thế hệ mới BM-CNSHTV . CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG (SH3014) Giảng viên hướng dẫn: ……. BM CNSH TV – Khoa CNSH BM-CNSHTV CHƢƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) 1. Chức năng. nucleotide trong phân tử DNA. BM-CNSHTV Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau Cho đến nay, hệ gen của hơn 100 tổ chức sinh vật đã đƣợc giải mã trình tự BM-CNSHTV Maxam-Gilbert (1977). lai phân tử 4. Phương pháp PCR, ứng dụng 5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA BM CNSH TV – Khoa CNSH BM-CNSHTV KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ DNA BM-CNSHTV Khái