KIỂM NGHIỆM THỬ VÔ KHUẨN

THỬ VÔ KHUẨNTÀI LIỆU THAM KHẢO Hội đồng Dược điển Việt Nam (2009), Dược điển ViệtNam 4, Phụ lục 13.7 Thử vô khuẩn, tr PL266 PL269 British pharmacopoeia Commission (2014), Britishpharmacopoeia 2014 – Volume 5, Appendix XVI A. Testfor Sterility The United States Pharmacopeia (2014), USP 37 Volume 1, Microbiological tests Sterility tests. MỤC ĐÍCH Phát hiện sự có mặt của vi khuẩn (hiếu khívà kị khí), vi nấm trong các nguyên liệu, chếphẩm và dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêngcần phải vô khuẩn. NGUYÊN TẮC Nếu VK, nấm được cấy vào mtr có chất dinhdưỡng và nước, được giữ ở điều kiện nhiệt độthích hợp thì chúng sẽ phát triển Sự có mặt của VSV làm cho mtr biến đổi trạngthái từ trong sang đục, có váng hoặc có cặn lắng ởđáy mtrĐỐI TƯỢNG ÁP DỤNG Các loại thuốc dùng theo đường tiêm: tiêmbắp, tiêm tĩnh mạch, dịch truyền Các dụng cụ vô khuẩn dùng để tiêm: xilanh,bộ dây truyền dịch… Thuốc nhỏ mắt Thuốc điều trị bỏng (một số NSX đăng kí tiêuchuẩn vô khuẩn theo CP)YÊU CẦU VỀ PTN Thao tác trực tiếp với mẫu: Tủ an toàn sinh học (Biosafety cabinet – BSC):bảo vệ người, mẫu, môi trường thí nghiệm Laminar flow: bảo vệ mẫu Phòng đặt BSCLaminar flow: class B (theo phânloại của WHO) Cơ sở vật chất, qui trình vận hành PTN rất nghiêmngặt để đảm bảo tránh trường hợp dương tính giảYÊU CẦU VỀ PTNTủ ATSH cấp II Safe fast Elite (FasterÝ)«70% of the air recirculated via the main ClassH14 HEPA filter within the cabinet, whilst theremaining 30% is discharged through anexhaust Class H14 HEPA filter»Laminar flow FlowFAST H (FasterÝ)«Prefilter with a minimum efficiency of 80%90% ASHRAE and the HEPA filter with anefficiency better than 99,995 % MPPS ( H14 EN:1822 )YÊU CẦU VỀ PTNIsolatorGloveFAST Aseptic (FasterÝ)«Faster GloveFAST Aseptic positive isolator isa class 3 ISOFDIS 146447 isolator withvertical laminar airflow in the working area andphysical separation between operator andproduct (gloves); the unit is designed to highlyprotect the product manipulated and foreffective personnel protection.The dusted, filtered and sterile air passingthrough the main HEPA filter ensures optimumlaminar airflow on the working surface»USP 37 Sterility Testing Validationof isolator system: Isolator đạt ISO class 5 (ISO 146441,2,3,7)Annex 6, TRS 961: phòng đặt isolator: ít nhấtclass DTHIẾT BỊ CẦN THIẾT Tủ an toàn sinh học class IILaminar flow Phòng sạch Tủ sấy (160oC) Tủ nuôi cấy (02 loại: 3035oC; 2025oC) 02 Nồi hấp Bơm chân khôngDỤNG CỤ CẦN THIẾT Bộ lọc vi sinh thủy tinhinox chuyên dụng hoặcbộ lọc kín Màng lọc mix cellulose kích thước lỗ lọc khôngquá 0,45 µm (0,45 µm0,22 µm) Bơm tiêm thủy tinhQuần áo vô khuẩn Các dụng cụ thủy tinh như bình đựng môitrường, pipet cấy chủng ... Kẹp, kéo inox, que cấy, đèn cồnChú ý: Tất cả dcụ phải được tiệt trùng theo qtrìnhđã được thẩm địnhDỤNG CỤ CẦN THIẾTBộ lọc vi sinh 47 mm(Merck Millipore Mỹ): Bình lọc chân không Phễu lọc Bơm chân không Màng lọc mix cellulose0,45 µm Phụ kiện khác: Ốngsilicone, nút silicone…DỤNG CỤ CẦN THIẾTBộ lọc kín Sterisart®NF (Sartorius stedim)MÔI TRƯỜNG Mtr Thioglycolat lỏng (vi khuẩn hiếu khí và kịkhí): Nếu quá 13 thể tích phía trên của ống mtrcó màu hồng, mtr ko thích hợp để sử dụng. Cóthể phục hồi mtr bằng cách đun cách thủy đếnkhi mất màu, rồi làm lạnh ngay. Chỉ sử dụng mtrphục hồi 1 lần Mtr Soyabean Casein lỏng (vi khuẩn hiếu khívà vi nấm)Hấp tiệt trùng mtr theo qui trình đã thẩm địnhHÓA CHẤT VÀ THUỐC THỬ Natri clorid Pepton thịt hoặc pepton casein Ethanol 70o Nước cất Dung dịch tím tinh thể (có sẵn) Dung dịch iod (có sẵn) Dung dịch Safranin (có sẵn)CHỦNG VI SINH VẬT CHUẨN Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Bacilus subtilis ATCC 6633 Aspergilus niger ATCC 16404 Candida albicans ATCC 10231 Clostridium sporogenes ATCC 19404 Tần suất: mỗi lần pha chế“USP, BP: test each lot of readyprepared medium and each batch ofmedium prepared either from dehydrated medium or fromingredients” Các chỉ tiêu Độ vô khuẩn:+ Mtr thioglycolat lỏng: ủ 30 – 35oC14 ngày+ Mtr soybean casein lỏng: ủ 20 – 25oC14 ngày pH Khả năng kích thích vi sinh vậtKIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNGKIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNGVi khuẩn hiếu khíStaphylococcus aureus ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518,NBRC 13276Bacillus subtilis ATCC 6633, CIP 52.62, NCIMB 8054, NBRC 3134Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, NBRC 13275Vi khuẩn kị khíClostridium sporogenes ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532 or ATCC 11437,NBRC 14293NấmCandida albicans ATCC 10231, IP 48.72, NCPF 3179, NBRC 1594Aspergillus niger(Aspergillus brasiliensis)ATCC 16404, IP 1431.83, IMI 149007, NBRC 9455.KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNGCách ktra: Cấy vào mtr thioglycolat ko quá 100 CFU VSVC. sporogenes, P. aeruginosa và S. aureus Cấy vào mtr soybean casein ko quá 100 CFU VSVA. niger, B. subtilis và C. albicans Ủ mtr chứa VK trong ≤ 3 ngày và mtr chứa nấmtrong ≤ 5 ngày. Ủ mtr thioglycolat ở 30 – 35oC. Ủ mtrsoybean casein ở 20 – 25oC Sau tg ủ, qsát sự ptr của VSV trong bình mtrYêu cầu: VSV mọc rõ ràng trong các bình mtrPHƯƠNG PHÁP THỬ Phương pháp màng lọc: Ưu tiên áp dụng cho cáctrường hợp mà chế phẩm cho phép thử nghiệmbằng pp màng lọc (ví dụ: thuốc tiêm, dịch truyền,thuốc nhỏ mắt, chế phẩm dạng kem, mỡ, dầu…) Phương pháp cấy trực tiếp: áp dụng cho các mẫuthử là dụng cụ vô trùng dùng trong y tế (bộ dâytruyền, kim tiêm, chỉ khâu phẫu thuật….) và các chếphẩm khác ko thể áp dụng pp màng lọc một cáchthích hợpBảng 1. Số lượng mẫu tối thiểu của ĐVĐG cho vào từng mtr nuôi cấyDĐVN 4Loại mẫu thử Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy trên 1 ĐVĐGChất lỏng (trừ kháng sinh): Nhỏ hơn 1ml Có từ 1 đến 40ml Có từ hơn 40ml đến ko quá 100ml Lớn hơn 100ml Toàn bộ ĐVĐG 12 ĐVĐG nhưng ko được ít hơn 1ml 20ml 10% ĐVĐG nhưng ko được ít hơn 20mlDung dịch kháng sinh 1mlChế phẩm tan trong nước hoặc isopropylmyristatToàn bộ ĐVĐG nhưng ko được ít hơn 200mgNhững chế phẩm ko tan, kem, thuốc mỡ, nhũdịch hoặc dịch treoToàn bộ ĐVĐG nhưng ko được ít hơn 200mgNhững chế phẩm là chất rắn Nhỏ hơn 50mg Có từ 50 đến nhỏ hơn 300mg Có từ 300mg đến 5g Lớn hơn 5gToàn bộ ĐVĐG12 ĐVĐG nhưng ko được ít hơn 50mg150mg500mgDụng cụ: Chỉ khâu phẫu thuật và chỉ khâu dùng trong thúy Băng, bông, gạc phẫu thuật được đóng gói kín Chỉ khâu phẫu thuật và các dụng cụ khác đượcđóng gói dùng một lần Các dụng cụ y tế khác3 đoạn (mỗi đoạn dài 30 cm)100 mg mỗi góiToàn bộ ĐVĐGToàn bộ dụng cụ, cắt nhỏ hoặc tháo rời dụngcụ raBảng 2.6.1.3. Số lượng ĐVĐG tối thiểu cho vào từng mtr nuôi cấyBP 2013PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC Dùng cồn 70o để lau bên ngoài bao bì tất cả các bình, lọ mtr,mẫu thử... Bộ phễu lọc, dụng cụ... nên được bao gói 2 lần bằnggiấy bán thấm, bao gói đầu tiên được loại bỏ ở passbox trướckhi đưa vào khu vực B để thử vô khuẩn Sử dụng màng lọc có kích thước lỗ lọc ko quá 0,45 µm, ĐKkhoảng 50 mm. SD màng cellulose nitrat cho dd nước, dd dầu,dd cồn yếu. SD màng cellulose acetat cho dd cồn mạnh. Có thểSD màng mix cellulose cho nhiều TH DMFL: dd pepton thịt hoặc pepton casein 1‰, pH 7,1 ± 0,2 Màng lọc đã được lắp sẵn vào bộ phễu và hấp tiệt trùngtrướcPHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC Lượng mẫu: theo qui định ở 2 bảng 1 và 2.6.1.3 Mẫu thử là dd nước hoặc dạng bột, rắn tan trong nước: Cho 50 ml DMFL vào phễu lọc. Bật bơm chân không hút 1phần (ko hút hết) DMFL xuống bình hứng Mẫu thử là dd nước: dùng bơm tiêm vô khuẩn lấy trực tiếpchế phẩm rồi cho vào phễu lọc Mẫu thử dạng bột, rắn tan trong nước : dùng DMFL để phaloãng mẫu, dùng bơm tiêm vô khuẩn lấy chế phẩm đã phaloãng rồi cho vào phễu lọc Rửa màng lọc bằng DMFL 3 lần, mỗi lần 100 ml. Đối vớimẫu thử là kháng sinh hoặc có chứa chất kháng khuẩn thì cóthể tăng số lần rửa màng lọc nhưng ko quá 5 lần, mỗi lần100mlPHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC Mẫu thử dạng dầudung dịch dầu: Chuyển trực tiếp lên phễu lọc nếu mẫu thử là dd dầu có độnhớt thấp. Nếu mẫu thử là dd dầu rất nhớt, nên pha loãng trongisopropyl myristat trước khi chuyển lên phễu lọc Bật bơm chân không hút hết mẫu thử xuống bình hứng Rửa màng lọc bằng DMFL (có thêm chất diện hoạt phù hợp, VDPolysorbat 80, 10glit) 3 lần, mỗi lần 100 ml Mẫu thử dạng mỡ, kem: Nên pha loãng mẫu trong isopropyl myristat với tỷ lệ 1%, gianhiệt dưới 40oC (có thể lên tới 44oC) để chế phẩm dễ tan hơntrong isopropyl myristat nếu cần trước khi chuyển lên phễu lọc Bật bơm chân không hút hết mẫu thử xuống bình hứng Rửa nhanh màng lọc bằng DMFL (có thêm chất diện hoạt phùhợp, VD Polysorbat 80, 10glit) 3 lần, mỗi lần 100 mlPHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC Sau khi lọc, dùng kẹp và kéo vô khuẩn cắt màng lọc thành2 phần. Một nửa cấy vào ống mtr chứa 100 ml Soyabeancasein lỏng và nửa còn lại cấy vào ống mtr chứa 100 mlThioglycolat lỏngCó thể cấy cả màng lọc vào 1 ống mtr nếu ĐK PTN chophép Ủ mtr Thioglycolat lỏng đã cấy màng lọc ở 30 35oC Ủ mtr Soyabean Casein lỏng đã cấy màng lọc ở 20 25oC Theo dõi khả năng phát triển của VSV trong mtr trong ítnhất 14 ngày. Nên định kì theo dõi để phát hiện thời điểmsớm nhất mà vi sinh vật mọc trong các ống môi trường(VD: 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày)PHƯƠNG PHÁP CẤY TRỰC TiẾP Dùng cồn 70o để lau bên ngoài bao bì tất cả các bình, lọ mtr, mẫu thử...Dụng cụ panh, kéo... nên được bao gói 2 lần bằng giấy bán thấm, baogói đầu tiên được loại bỏ ở passbox trước khi đưa vào khu vực B để thửvô khuẩn Lấy mẫu: lấy lượng chế phẩm theo qui định ở 2 bảng 1 và 2.6.1.3 Bộ dây truyền dịch, găng tay phẫu thuật, băng gạc vô khuẩn…: Dùngkéo và kẹp vô khuẩn cắt mẫu thử thành các phần nhỏ rồi cấy vào mtr Bơm kim tiêm: Dùng kéo và kẹp vô khuẩn tách riêng các phần của bơmtiêm ra rồi cấy vào mtr Lượng mtr nuôi cấy phải đủ ngập toàn bộ mẫu thử (thể tích mẫu thửkhông được vượt quá 10% thể tích của mtr) Ủ mtr Thioglycolat lỏng đã cấy chế phẩm ở 30 35oC Ủ mtr Soyabean Casein lỏng đã cấy chế phẩm ở 20 25oC Theo dõi khả năng phát triển của VSV trong mtr trong ít nhất 14 ngày.Nên định kì theo dõi để phát hiện thời điểm sớm nhất mà VSV mọc trongcác ống môi trường (VD: 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày)CHỨNG ÂM TÍNH Mục đích: kiểm tra xem quá trình thử nghiệm có bị nhiễm VSV bênngoài ko? Tiến hành: Thay mẫu thử bằng nước cất đã được hấp vô khuẩn Tiến hành thử nghiệm song2 giống với chế phẩm Kết quả: Nếu ko có sự phát triển của VSV trong các ống mtr: quá trình thửnghiệm ko bị nhiễm VSV. Chấp nhận kết quả của mẫu thử cùngngày với chứng âm tính đó Nếu có sự phát triển của VSV trong các ống mtr: quá trình thửnghiệm đã bị nhiễm VSV. TH này cần tiến hành lại thử nghiệm trênmẫu thử đã tiến hành cùng ngày với chứng âm tính đó Tần suất thực hiện: mỗi khi thử nghiệm độ vô khuẩnKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP Nên th ktra chất lượng mtr cùng thời điểm vớiktra sự phù hợp của PP để so sánh kết quả Th thử vô khuẩn giống như mẫu thử, chỉ khác: PP màng lọc: Thêm một lượng nhỏ (ko quá100 CFU) VSV sống vào phần dd rửa cuốicùng để rửa màng lọc và tiếp tục lọc PP cấy trực tiếp: Sau khi cho mẫu thử vàomtr, thêm một lượng nhỏ (ko quá 100 CFU)VSV sống vào mtrKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP Tiến hành Chủng VSV sử dụng:+ Mtr thioglycolat: C. sporogenes,P. aeruginosa và S. aureus+ Mtr soybean casein: A. niger, B. subtilis,và C. albicans Thời gian ủ: ko quá 5 ngàyKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP Đánh giá: Sau tgian ủ, sự ptr của VSV trong ống mtr chứamẫu thử rõ ràng, giống như sự ptr của VSV trongống mtr ko chứa mẫu thử: mẫu thử ko chứa chất ứcchế VSV hoặc tác dụng ức chế đã được loại bỏ bởiĐK TNchấp nhận QT thử vô khuẩn trên mẫu thử màko cần điều chỉnhKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP Đánh giá: Sau tgian ủ, sự ptr của VSV trong ống mtr chứamẫu thử ko rõ ràng như sự ptr của VSV trong ốngmtr ko chứa mẫu thử: mẫu thử chứa chất ức chếVSV và tác dụng ức chế đó ko loại bỏ được bởi ĐKTNThay đổi QT thử vô khuẩn trên mẫu thử đócho phù hợp để loại bỏ được tác dụng ức chế VSV,và tiến hành ktra sự phù hợp của PP lạiKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP Tần suất tiến hành: khi có sản phẩm mới (3 lô liên tiếp) khi có thay đổi điều kiện tiến hành thử vôkhuẩn trên sản phẩm cũCHỨNG DƯƠNG TÍNH (tại VKN) Mục đích: kiểm tra kn phát hiện VSV khi có mặt mẫu thử Chủng VSV cấp 4 Vi khuẩn: S. aureus ATCC 6538 Nấm: C. albicans ATCC 10231 Tiến hành: Cấy 100 CFU S. aureus ATCC 6538 vào mtr Thioglycolat lỏng đã cấymẫu thử và ủ 3035oC5 ngày Cấy 50 CFU C. albicans ATCC 10231 vào mtr Soyabean casein lỏngđã cấy mẫu thử và ủ 2025oC5 ngày Kết quả: Nếu có VSV ptr trong ống mtr: chất ức chế (nếu có) đã bị loại bỏbởi ĐK thí nghiệm. Chấp nhận kết quả của mẫu thử. Nếu ko có VSV ptr trong mtr: mẫu thử có chất ức chế hoặc chất ứcchế ko bị loại bỏ bởi ĐK thí nghiệm. TH này phải thay đổi, lựa chọnđiều kiện thử cho phù hợpĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ Nếu sau 14 ngày ko thấy có dấu hiệu ptr của VSV trongcác ống mtr kèm theo các kết quả của chứng âm tính vàdương tính đạt thì chế phẩm được coi là đạt tiêu chuẩn vôkhuẩnNếu khó quan sát sự ptr của VSV sau 14 ngày nuôi cấy:cấy chuyển ít nhất 1 ml từ loạt mtr cũ sang loạt mtr mới,tiếp tục ủ trong ko dưới 4 ngày Nếu có sự phát triển của VSV trong các ống mtr ?ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ Nếu sau 14 ngày ko thấy có dấu hiệu ptr của VSV trongcác ống mtr kèm theo các kết quả của chứng âm tính vàdương tính đạt thì chế phẩm được coi là đạt tiêu chuẩn vôkhuẩnNếu khó quan sát sự ptr của VSV sau 14 ngày nuôi cấy:cấy chuyển ít nhất 1 ml từ loạt mtr cũ sang loạt mtr mới,tiếp tục ủ trong ko dưới 4 ngày Nếu có sự phát triển của VSV trong các ống mtr thì kiểmtra lại điều kiện thử nghiệm: Ko phát hiện nguyên nhân gây sai sót: KL mẫu không đạt Phát hiện nguyên nhân gây sai sót: Hành động khắc phục→ lặp lại phép thử với số lượng mẫu giống lần đầuĐÁNH GIÁ KẾT QUẢSƠ ĐỒ 1:CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH KHI KẾT QUẢ THỬ NGHIỆMNGOÀI KHOẢNG GIỚI HẠN QUY ĐỊNHVỚI CÁC MẪU THỬ ĐỘ VÔ KHUẨNĐÁNH GIÁ KẾT QUẢBIỂU MẪUBÁO CÁO CÁC NGUYÊN NHÂNGÂY RA KẾT QUẢ NẰM NGOÀI GIỚI HẠN(Áp dụng với mẫu thử vô khuẩn)KIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PPKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PPKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PPKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PPKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PPKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PPKIỂM TRA SỰ PHÙ HỢP CỦA PP