13.7 Thử vô khuẩn Qui định chung Kỹ thuật áp dụng để thử vô khuẩn nhằm phát có mặt vi khuẩn, nấm mốc nấm men nguyên liệu, chế phẩm dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô khuẩn Thử vô khuẩn phải đợc tiến hành điều kiện vô khuẩn nh buồng thổi khí vô khuẩn buồng để mẫu thử không bị ô nhiễm Trong trình thử, mẫu không đợc tiếp xúc với tác nhân có ảnh hởng đến vi khuẩn, nấm mốc, nấm men (nh: tia tử ngoại, chất sát khuẩn, nhiệt độ cao ) Các dụng cụ, dung môi, môi trờng nuôi cấy phải đợc diệt khuẩn trớc dùng Phơng pháp thử Nguyên tắc Nếu vi khuẩn, nấm mốc, nấm men đợc cấy vào môi trờng có chất dinh dỡng nớc, đợc giữ điều kiện nhiệt độ thích hợp chúng phát triển Sự có mặt vi sinh vật làm cho môi trờng biến đổi trạng thái từ sang đục, có cặn lắng đáy môi trờng, thay đổi màu sắc môi trờng Chọn hai phơng pháp thử thờng dùng phơng pháp màng lọc phơng pháp cấy trực tiếp Khi tiến hành thử phải làm bề ống (hoặc chai, lọ, bình ) đựng chế phẩm chất sát khuẩn thích hợp Sau lấy lợng chế phẩm đủ dùng theo qui định, cấy trực tiếp vào môi trờng (nếu theo phơng pháp cấy trực tiếp) theo phơng pháp màng lọc: Đem chế phẩm sau đợc hoà loãng với dung môi thích hợp lọc qua màng lọc, cắt màng lọc thành miếng nhỏ đem nhúng vào môi trờng, ủ môi trờng cấy chế phẩm cấy màng lọc thời gian qui định Chuẩn bị môi trờng dung môi Môi trờng để phát vi khuẩn hiếu khí kỵ khí Môi trờng thioglycolat có thạch (dùng cho thử nghiệm chế phẩm lỏng trong) Môi trờng thioglycolat thạch (dùng cho thử nghiệm chế phẩm đặc đặc sền sệt dạng cao) Môi trờng Soybean - casein (để phát vi khuẩn hiếu khí nấm mốc) Cả hai loại môi trờng phải đợc pha chế kiểm tra chất lợng theo qui định mục "Cách pha chế kiểm tra chất lợng môi trờng" trớc dùng Dung môi dùng để hoà loãng Khi mẫu thử không dạng dung dịch lỏng, cần hoà loãng để thử nghiệm Chỉ đợc dùng làm dung môi hoà loãng chất lỏng tính kháng khuẩn không tác động đến độ xốp màng lọc Thờng dùng dung môi sau đây: Dung môi A: Hoà tan g pepton vào nớc cho vừa đủ lít Lọc (hoặc ly tâm) cho Điều chỉnh pH 7,1 0,2 Đựng vào nhiều bình, bình khoảng 100 ml HÊp ë 1210 C 18 - 20 phút Dung môi B: Nh dung môi A, nhng thêm ml polysorbat 80 cho lÝt dung m«i, dïng để hoà loãng chế phẩm thử có lecithin Dung môi C: isopropyl myristat Dùng để pha loãng chế phẩm dạng dầu hay dung dịch dầu Tiến hành thử theo phơng pháp màng lọc Dụng cụ Các dụng cụ dùng thử nghiệm phải đảm bảo vô khuẩn gồm: - Các ống nghiệm bình đựng môi trờng - Bộ lọc gồm có: Phễu lọc, giá đỡ màng lọc, bình hứng, phụ kiện để ghép nối; hệ thống hút chân không - Màng lọc: Thờng dùng loại có dờng kính lỗ lọc khoảng 0,2 - 0,45 àm Loại màng Cellulose nitrat đợc dùng cho chế phẩm dạng nớc, dạng dầu dung dịch có lợng cồn thấp độ Loại màng lọc dạng cellulose acetat đợc dùng cho chế phẩm dạng có nồng độ cồn cao Đặc biết chế phẩm kháng sinh cần phải chọn loại màng lọc thích hợp đảm bảo không d lợng kháng sinh màng sau lọc - Kéo cắt màng lọc Lợng mẫu thử cÇn dïng cho mét lÇn thư nghiƯm T theo tõng loại mẫu thử, lấy số lợng thích hợp theo qui định bảng Bảng STT Loại mẫu thử Dung dịch thuốc tiêm có chứa đơn vị đóng gói: - Dới ml - Có từ đến ml - Có từ ®Õn Ýt h¬n 20 ml - Cã tõ 20 ®Õn 100 ml - Lớn 100 ml Dung dịch thuốc nhỏ mắt chế phẩm lỏng không tiêm Những mẫu thử chất rắn, dịch treo, nhũ dịch, kem, thuốc mỡ Lợng tối thiểu chế phẩm cần lấy Toàn đơn vị đóng gói 1/2 đơn vị đóng gói ml - 10 ml 1/2 đơn vị đóng gói - 10 ml dung dịch hoà loãng đến 10 lần (tt/tt) dung môi thích hợp nêu (mục c) 0,5 - g mẫu thử đợc hoà loãng thành dung dịch với tỉ lệ 1% (kl/tt) dung môi thích hợp (nêu mục dung môi dùng để hoà loãng) Kỹ thuật thử Dùng dung môi A vừa đủ để thấm ớt màng lọc Rót lên màng lọc lợng mẫu cần thử nh qui định bảng Dùng máy hút chân không để rút ngắn thời gian lọc Rửa màng lọc lần, lần dùng 100 ml dung môi thích hợp, vô khuẩn Lấy màng lọc khỏi giá đỡ phễu lọc Cấy màng lọc vào môi trờng nhúng chìm vào loại môi trờng để phát nấm vi khuẩn (mục chuẩn bị môi trờng dung môi ) Khi mẫu thử có tính kháng khuẩn, rửa màng lọc ba lần cách lọc qua màng dung môi tiệt trùng ®· chän dïng cho thư nghiƯm.Lµm thÝ nghiƯm kiĨm tra để biết chắn không tác dụng kháng khuẩn mẫu thử hấp thụ màng Chuyển toàn màng lọc vào môi trờng nuôi cấy thích hợp để phát vi khuẩn, nấm mốc Nếu dẫn chuyên luận riêng, ủ môi trờng thyoglycolat 300C đến 350C ủ môi trờng soybean - casein 200C đến 250C 14 ngày Nếu mẫu thử dụng cụ (bộ dây truyền, túi lọc máu ) dùng 100 ml dung môi B cho chảy qua dụng cụ Hứng lấy dung môi, rót lên màng lọc đợc thấm ớt dung môi A, lµm tiÕp theo kü tht ghi ë mơc kü tht thử Tiến hành thử theo phơng pháp cấy trực tiếp Dụng cụ: Các dụng cụ dùng cho thử nghiệm phải đảm bảo vô khuẩn đợc sử dụng vào thử nghiệm Dụng cụ dùng cho phơng pháp cấy trực tiếp gồm: Bơm tiêm, pipet, ống nghiệm bình đựng môi trờng Lợng chế phẩm cần dùng để thử nghiệm Tuỳ theo loại mẫu thử, lấy lợng chế phẩm thích hợp theo qui định bảng Kỹ thuật thử Dùng bơm tiêm pipet lấy mẫu thử cấy vào hai loại môi trờng theo số liệu bảng Nếu mẫu thử chất rắn cấy trực tiếp vào môi trờng ý lắc để mẫu thử phân tán môi trờng Nếu dẫn chuyên luận riêng ủ môi trờng phát vi khuẩn 30 0C - 350C ; ủ môi trờng phát nấm mốc 200C - 250C, thêi gian Ýt nhÊt 14 ngµy; thêng xuyên theo dõi môi trờng cấy Nếu chế phẩm làm đục môi trờng, để dễ dàng quan s¸t sù mäc cđa vi khn, sau đ môi trờng - ngày nên chuyển phần nhỏ môi trờng sang loạt môi trờng loại Tiếp tục ủ ống môi trờng cấy lại ngày Trờng hợp mẫu thử băng, gạc, khâu phẫu thuật: Nếu kích thớc hình dạng cho phép, nhúng toàn mẫu thử vào 100 ml môi trờng tơng ứng Khi mẫu thử dụng cụ (dây truyền, ống lọc máu, ) dùng dung môi A B (mục chuẩn bị môi trờng dung môi) cho chảy qua để thu đợc 15 ml dịch rửa, cấy vào 100 ml loại môi trờng nuôi cấy ủ đọc kết nh ghi Bảng STT Lợng tối thiểu Thể tích Loại mẫu thử chế phẩm cần lấy tối thiểu Ghi môi trờng cần lÊy MÉu thư lµ chÊt láng NÕu mÉu thư chứa đơn dầu hay dung vị đóng gói loại: dịch dầu phải Dới ml Toàn đơn vị 15 ml thêm vào môi trTừ ml ®Õn Ýt h¬n ®ãng gãi 15 ml êng 1% ml 1/2 đơn vị đóng 20 ml polyethoxyTừ ml đến gói 40 ml ethanol 20 ml ml 80 ml 1% polysorbat Tõ 20 ml ®Õn ml để nhũ hoá 50 ml 10 ml Tõ 50 ml ®Õn 100 ml MÉu thư chất rắn, thuốc mỡ hay kem, chứa đơn vị đóng gói loại: Toàn đơn vị Díi 50 mg ®ãng gãi 40 ml 80 ml Tõ 50 mg đến 200 1/2 khối lợng mg đơn vị đóng gói Lớn 200 mg 100 mg 80 ml NÕu mÉu thư lµ thc mì hay kem cần hoà loãng với dung môi B theo tỷ lệ 1/10 (kt/tt) trớc cấy vào môi trờng Theo dõi đánh giá kết Trong suốt thời gian ủ, hàng ngày phải quan sát môi trờng cấy màng lọc mẫu thử Nếu không thấy cã vi khuÈn, nÊm mèc mäc suèt thêi gian qui định, mẫu thử đợc coi đạt tiêu chuẩn vô khuẩn Nếu có từ trở lên số môi trờng nuôi cấy, có vi khuẩn nấm mốc mọc, cần phải: Rà soát lại qui trình thử Thử lại mẫu thử nghi ngờ Giữ lại môi trờng có vi khuẩn, nấm mốc mọc Tiến hành phân lập, so sánh vi khuẩn nấm môi trờng, cấy lại với vi khuẩn nấm mọc môi trờng cũ Nếu tiêu phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) giống với tiêu làm lần đầu, mẫu thử đợc coi không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn Nếu tiêu phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) khác biệt so với lần thí nghiệm đầu tiên, cần thực phép thử lặp lại với số lợng mẫu gấp đôi Nếu không phát thấy vi khuẩn (hoặc nấm mốc), mẫu thử đợc coi đạt tiêu chuẩn vô khuẩn Nếu thấy vi khuẩn (hoặc nấm) mọc lần lặp lại này, mẫu thử đợc coi không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn Cách pha chế kiểm tra chất lợng môi trờng Môi trờng để phát vi khuẩn hiếu khí kỵ khí Môi trờng thioglycolat: Dùng cho thử nghiệm chế phẩm lỏng L - Cystin 0,50 g Natri clorid 2,50 g Dextrose (C6H12O6.H2O) 5,50 g Thạch bột (có độ ẩm nhỏ 15%) 0,75 g Cao men bia (có khả tan 5,00 g níc) 15,00 g Casein pancreatic 0,50 g Natri thioglycolat (hc acid thioglycolic 1,0 ml 0,3 g ) 1000 ml Resazurin (dung dÞch 0,1% míi pha) Níc cÊt pH sau tiệt khuẩn: 7,1 0,2 Trộn tất thành phần theo thứ tự ghi (trừ resazurin thioglycolat) cối nghiền, thêm vào nớc nóng, trộn kỹ, chuyển sang dụng cụ thích hợp Thêm số nớc lại, đun hỗn hợp cách thuỷ sôi đến tạo thành dung dịch Thêm natri thioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyd N điều chỉnh cho m«i trêng sau tiƯt khn cã pH7,1 ± 0,2 Đun nóng lại dung dịch (tránh đun sôi) Lọc (nếu cần) qua giấy lọc thấm ớt, thêm dung dịch resazurin trộn Đóng vào ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp, hấp vô khuẩn 1210C 18 - 20 LÊy lµm ngi nhanh tíi 25 0C, tiếp tục bảo quản nhiệt độ 20 - 30 0C, tr¸nh ¸nh s¸ng NÕu 1/3 thĨ tÝch phía ống (hoặc bình) môi trờng có màu hồng, môi trờng không thích hợp để thử nghiệm Có thể phục hồi lại môi trờng cách đun cách thuỷ cho màu làm lạnh đột ngột Nhng sử dụng môi trờng phục hồi lần, không dùng môi trờng phục hồi lần Các môi trờng thioglycolat lỏng dùng khoảng tuần Môi trờng thioglycolat thạch Dùng cho thử nghiệm chế phẩm đục đặc sền sệt dạng cao L Cystin 0,50 g Natri clorid 2,50 g Dextrose (C6H12O6.H2O) 5,50 g Cao men bia (có khả tan 5,00 g níc) 15,0 g Casein pancreatic 0,50 Natri thioglycolat g (hc acid thioglycolic 0,3 g) 10 ml Resazurin (dung dÞch 1% míi pha) 1000 Níc cÊt ml pH sau tiệt khuẩn: 7,1 0,2 Cho tất thành phần vào dụng cụ thích hợp, đun cách thuỷ, khuấy đến thành dung dịch, dùng dung dịch natri hydroxyd 1N điều chỉnh pH sau tiệt khuẩn đạt 7,1 0,2 Có thể lọc (nếu cần) Phân chia vào ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp Hấp tiệt khuẩn 121 0C khoảng 18 20 phút Sau tiệt khuẩn đem làm nguội nhanh tới 25 0C, môi trờng không đợc đun nóng trở lại Môi trờng phát vi khuẩn hiếu khí nÊm M«i trêng Soybean - casein Casein pancreatic 17,0 g Bét papaic soybean 3,0 g Natri clorid 5,0 g Dikali hydrophosphat 2,5 g (K2HPO4) 2,5 g Dextrose (C6H12O6.H2O) 1000 ml Níc cÊt pH sau tiƯt khn: 7,3 ± 0,2 Hoà tan tất chất rắn nớc, đun nóng nhẹ tan hoàn toàn Để nguội nhiệt độ phòng Dùng dung dịch natri hydroxyd 0,1N để ®iỊu chØnh (nÕu cÇn) cho pH sau tiƯt khn khoảng 7,1 đến 7,5 Lọc (nếu cần) môi trờng Phân chia vào dụng cụ thích hợp, hÊp tiƯt khn ë 121 0C kho¶ng 20 Kiểm tra chất lợng môi trờng a) Độ vô khuẩn: Lấy ngẫu nhiên vài ống (hoặc bình) môi trờng sản xuất, đem ủ nhiệt độ 30 - 350C ngày loại môi trờng dùng nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí kỵ khí; đ ë nhiƯt ®é 20 - 250C Ýt nhÊt ngày loại môi trờng dùng nuôi cấy vi khuẩn, nấm mốc Các loại môi trờng phải không đợc có vi khuẩn, nấm mốc mọc b) Khả dinh dỡng: Cấy vào môi trờng dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống loại vi khuÈn sau: Lo¹i hiÕu khÝ dïng Staphylococcus aureus ATCC 6538 Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùng Bacillus subtilis ATCC 6633 Loại vi khuẩn kỵ khí dùng Clostridium sporogenes ATCC 9404 Lo¹i nÊm dïng Candida albicans ATCC 10231 Aspergillus niger ATCC 16404 Mỗi loại chủng thị đợc cấy vào loại môi trờng tơng ứng, mang ủ nhiệt độ thích hợp cho loại ngày vi khuẩn ngày nấm mốc Trên loại môi trờng, sau thời gian ủ phải thấy vi khuẩn mọc tèt c) KiĨm tra t¸c dơng øc chÕ ë mÉu mang thử: Một số chế phẩm yêu cầu sản xuất chế phẩm ng ời ta cho thêm chất bảo quản Loại chế phẩm có ảnh hởng đến phát triển vi khuẩn, nấm mốc, nên cần phải kiểm tra tác dụng øc chÕ cđa chóng ®èi víi vi khn nÊm mèc Đối với vi khuẩn kỵ khí Dùng ống môi trờng phát vi khuẩn kỵ khí Hai ống dùng làm chứng cấy vào ống chứng 100 nha bào vi khuẩn kỵ khí Clostridium sporogenes ATCC 9404 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch nha bào pha loãng thích hợp) Hai ống lại cấy vào ống lợng chế phẩm cần kiểm tra, cấy vào ống 100 nha bào Clostridium sporogenes ATCC 9404 Đem ủ tất ống 30 - 350C ngày Đối với vi khuẩn hiếu khí Dùng ống môi trờng phát vi khuÈn hiÕu khÝ Hai èng dïng lµm chøng chØ cÊy vào ống chứng 100 tế bào vi khuẩn hiÕu khÝ Staphylococcus aureus ATCC 6538 (kho¶ng 0,1 ml nhò dịch tế bào pha loãng thích hợp) Hai ống lại cấy vào ống lợng chế phẩm cần kiểm tra, cấy vào ống 100 tế bào Staphylococcus aureus ATCC 6538 Đem ủ tất ống 30 - 350C ngày Đối với nấm mốc Dùng ống môi trờng phát nấm, mốc Hai ống dùng làm chứng cấy vào ống chứng 100 tế bào nÊm Candida albicans ATCC 10231 Hai èng dïng kiÓm tra, cấy vào ống 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231 lợng chế phẩm Đem ủ tất ống 20 - 25 0C ngày Đánh giá kết quả: Nếu thêi gian đ, vi khn, nÊm mèc mäc tèt, (dƠ dàng phong phú), loại, mọc giống ống kiểm tra ống chứng: Mẫu thử tác dụng ức chế Nếu ống m«i trêng cã cÊy mÉu thư, vi khn, nÊm, mèc mọc yếu, chậm phát triển không phát triển so víi èng chøng vÉn mäc tèt: MÉu thư cã t¸c dụng ức chế Phải loại bỏ tác dụng ức chế Tác dụng ức chế mẫu thử loại bỏ đợc cách có kết cách cấy truyền nhắc lại loạt môi trờng läc qua mµng läc vi khuÈn ... bảng Bảng STT Loại mẫu thử Dung dịch thu c tiêm có chứa đơn vị đóng gói: - Dới ml - Có từ đến ml - Có từ đến 20 ml - Có từ 20 đến 100 ml - Lớn 100 ml Dung dịch thu c nhỏ mắt chế phẩm lỏng không... cho chảy qua dụng cụ Hứng lấy dung môi, rót lên màng lọc đợc thấm ớt dung môi A, làm kỹ thu t ghi mục kỹ thu t thử Tiến hành thử theo phơng pháp cÊy trùc tiÕp Dơng cơ: C¸c dơng dïng cho thử nghiệm... thành dung dịch với tỉ lệ 1% (kl/tt) dung môi thích hợp (nêu mục dung môi dùng để hoà loãng) Kỹ thu t thử Dùng dung môi A vừa đủ để thấm ớt màng lọc Rót lên màng lọc lợng mẫu cần thử nh qui định