HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM VĂN SƠN NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VI
Trang 1HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
PHẠM VĂN SƠN
NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ
CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018
Trang 2HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
PHẠM VĂN SƠN
NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG GỐC VÀ THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT VACXIN VÔ HOẠT PHÒNG HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TỪ
CHỦNG VIRUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Bá Hiên
2 TS Nguyễn Văn Cảm
HÀ NỘI, 2018
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của bản thân Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Tác giả luận án
Phạm Văn Sơn
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều người, sau đây là lời cảm ơn chân thành của tác giả:
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Bá Hiên
và TS Nguyễn Văn Cảm, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án Nhờ có sự hướng dẫn nhiệt tình và những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy mà luận án của tôi đã được hoàn thành
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ của Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này
Trân trọng cảm ơn nhóm các nhà Khoa học nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản xuất vacxin vô hoạt phòng Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp
ở lợn” Thuộc chương trình KC-04 do PGS.TS Nguyễn Bá Hiên chủ nhiệm đã tạo điều kiện cho chúng tôi tham gia nhiều công đoạn nghiên cứu và cho phép tôi
sử dụng một số kết quả nghiên cứu trong luận án này
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và cơ quan mà tôi đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án
Hà Nội, ngày tháng năm 2018
Nghiên cứu sinh
Phạm Văn Sơn
Trang 5MỤC LỤC
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục chữ viết tắt vii
Danh mục bảng ix
Danh mục hình xi
Trích yếu luận án xiv
Thesis abstract xvi
Phần 1 Mở đầu 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1
1.2 Mục tiêu của đề tài 2
1.2.1 Mục tiêu chung 2
1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2
1.3 Phạm vi nghiên cứu 2
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu 2
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 3
1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3
1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3
1.5.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 3
1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 4
Phần 2 Tổng quan tài liệu 5
2.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn 5
2.1.1 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn trên thế giới 5
2.1.2 Lịch sử và tình hình dịch PRRS ở lợn tại Việt Nam 8
2.2 Căn bệnh 14
2.2.1 Cấu trúc virus PRRS 14
2.2.2 Phân loại virus PRRS 17
2.2.3 Khả năng gây bệnh và sức đề kháng của virus PRRS 18
2.3 Truyền nhiễm học 19
2.3.1 Loài vật mắc bệnh 19
Trang 62.3.2 Chất chứa mầm bệnh và quá trình truyền lây 19
2.3.3 Cơ chế sinh bệnh, phương thức truyền lây và đáp ứng miễn dịch 20
2.4 Triệu chứng và bệnh tích 22
2.4.1 Triệu chứng lâm sàng 22
2.4.2 Bệnh tích 23
2.5 Chẩn đoán và phòng trị bệnh 24
2.5.1 Chẩn đoán 24
2.5.2 Các biện pháp phòng trị bệnh 25
2.6 Giống gốc trong sản xuất vacxin 27
2.6.1 Định nghĩa 27
2.6.2 Cách chế tạo giống gốc 27
2.6.3 Cách quản lý giống gốc 27
2.6.4 Các phương pháp bảo quản giống gốc PRRSV trong phòng thí nghiệm 28
2.7 Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng PRRS 30
2.7.1 Sản xuất vacxin bằng phương pháp vô hoạt virus 30
2.7.2 Sản xuất vacxin bằng phương pháp nhược độc virus trên môi trườngtế bào 31
2.7.3 Phương pháp sản xuất vacxin thế hệ mới 32
Phần 3 Nội dung, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 36
3.1 Địa điểm nghiên cứu 36
3.2 Thời gian nghiên cứu 36
3.3 Vật liệu nghiên cứu 36
3.4 Nội dung nghiên cứu 36
3.4.1 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn ở những ổ dịch PRRS và thu thập mẫu 36
3.4.2 Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRSV 36
3.4.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS 37
3.5 Phương pháp nghiên cứu 37
3.5.1 Phương pháp mổ khám 37
3.5.2 Phương pháp RT - PCR 37
3.5.3 Phương pháp làm tiêu bản vi thể 40
3.5.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào 41
3.5.5 Phương pháp nhân virus PRRS 43
3.5.6 Phương pháp xác định hiệu giá virus 43
Trang 73.5.7 Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus 43
3.5.8 Phương pháp giải trình tự gen 44
3.5.9 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein 45
3.5.10 Phương pháp gây tối miễn dịch trên chuột 45
3.5.11 Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng) 46
3.5.12.Phương pháp IPMA 47
3.5.13.Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống PRRS (master seed và working seed) 48
3.5.14 Phương pháp kiểm tra thuần khiết của giống (master seed và workingseed) bằng kỹ thuật PCR/RT-PCR 50
3.5.15.Phương pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 trên hệ thống Bioreactor 50
3.5.16.Phương pháp cô đặc virus PRRS bằng lọc tiếp tuyến 50
3.5.17 Phương pháp vô hoạt virus 51
3.5.18 Phương pháp kiểm tra sau vô hoạt 51
3.5.19 Phương pháp nhũ hóa vacxin 52
3.5.20 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của vacxin 52
3.5.21.Kiểm tra chỉ tiêu an toàn 53
3.5.22.Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vacxin 53
3.5.23.Phương pháp Realtime RT-PCR 54
3.5.24 Phương pháp ELISA 55
3.5.25 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 56
Phần 4 Kết quả và thảo luận 57
4.1 Nghiên cứu một số biểu hiện bệnh lý của lợn mắc PRRS 57
4.1.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm 57
4.1.2 Chẩn đoán PRRS bằng phương pháp RT-PCR 58
4.1.3 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể 60
4.1.4 Nghiên cứu biến đổi bệnh lý vi thể 62
4.2 Phân lập và tuyển chọn chủng giống gốc PRRS 65
4.2.1 Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 65
4.2.2 Nghiên cứu sự ổn định một số đặc tính sinh học của các chủng virus PRRS phân lập tại Việt Nam 71
4.2.3 Đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus PRRS 79
Trang 84.2.4 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của động vật thí nghiệm với các chủng virus
PRRS nghiên cứu 98
4.2.5 Sản xuất giống gốc 102
4.3 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt nhũ dầu phòng PRRS 107
4.3.1 Nhân giống sản xuất (Working seed) vacxin 107
4.3.2 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vacxin vô hoạt PRRS 109
4.3.3 Nghiên cứu kiểm nghiệm vacxin vô hoạt PRRS 115
Phần 5 Kết luận và kiến nghị 123
5.1 Kết luận 123
5.2 Kiến nghị 123
Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án 124
Tài liệu tham khảo 125
Phụ lục 137
Trang 9DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Viết đầy đủ
PEARS Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome
Trang 10Từ viết tắt Viết đầy đủ
PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus
RT- PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SIRD Swine Infertility and Respiratory Disease
TCID50 50% Tissue Culture Infective Dose
Trang 11DANH MỤC BẢNG
2.1 Lịch sử phát hiện bệnh 6
2.2 Một số tên thường gặp trong các tài liệu 6
2.3 Protein cấu trúc của PRRSV 7
2.4 Tổng hợp các ổ dịch PRRS xảy ra ở Việt Nam từ 2007-2016 10
2.5 Cấu trúc và chức năng protein phi cấu trúc 16
2.6 Các vacxin đã thử nghiệm sản xuất 33
3.1 Thành phần phản ứng RT – PCR 38
3.2 Các mồi sử dụng trong phản ứng RT-PCR: 38
3.3 Chu kỳ nhiệt trong máy PCR 39
3.4 Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml 44
3.5 Chương trình chạy PCR giải trình tự 44
4.1 Số lượng mẫu lợn nghi mắc PRRS thu thập được 57
4.2 Kết quả phản ứng RT-PCR chẩn đoán PRRS 59
4.3 Bệnh tích đại thể ở phổi lợn mắc PRRS 60
4.4 Bệnh tích đại thể ở một số khí quan khác của lợn mắc PRRS 60
4.5 Bệnh tích vi thể ở phổi, hạch phổi và hạch amidan của lợn mắc PRRS 62
4.6 Bệnh tích vi thể ở gan, lách và thận của lợn mắc PRRS 63
4.7 Bệnh tích vi thể ở tim, hạch ruột và ruột của lợn mắc PRRS 63
4.8 Kết quả phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 65
4.9 Khả năng gây bệnh tích tế bào của các chủng virus PRRS phân lập được 66
4.10 Kết quả lựa chọn các chủng virus PRRS xác định hiệu giá 67
4.11 Kết quả xác định hiệu giá của các chủng PRRSV phân lập được 68
4.12 Các chủng virus PRRS được lựa chọn nghiên cứu quy luật nhân lên 69
4.13 Kết quả lựa chọn sơ bộ các chủng virus PRRS cho nghiên cứu 72
4.14 Khả năng gây bệnh tích tế bào theo thời gian của các chủng virus qua 5 đời cấy chuyển 73
4.15 Hiệu giá của các chủng virus PRRS nghiên cứu qua 5 đờicấy chuyển 75
4.16 Kết quả lựa chọn chủng virus PRRS để nghiên cứu các đặc tính sinh học phân tử 79
Trang 124.17 Tương đồng nucleotide gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu
và các chủng tham chiếu 81
4.18 Tương đồng axit amin gen ORF5 của các chủng virus PRRS nghiên cứu 83
4.19 Tương đồng nucleotide gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu 86
4.20 Tương đồng axit amin gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu 88
4.21 Kết quả tinh chế kháng nguyên các chủng virus PRRS nghiên cứu 98
4.22 Kết quả của phản ứng IPMA kiểm tra kháng thể kháng PRRSV ở thời điểm 14 ngày sau khi tiêm kháng nguyên PRRS cho chuột 99
4.23 Kết quả phản ứng IPMA kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV 100
4.24 Phản ứng trung hòa xác định tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu 101
4.25 Kết quả kiểm tra vô trùng của giống gốc PRRS 103
4.26 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của giống gốc PRRS 104
4.27 Kết quả nhân giống sản xuất vacxin PRRS 108
4.28 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng của các lô giống sản xuất 108
4.29 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của các lô giống sản xuất 109
4.30 Hiệu giá virus sau khi cô đặc bằng phương pháp lọc tiếptuyến 110
4.31 Kết quả xác định nồng độ formalin sử dụng vô hoạt virus vacxinPRRS 110
4.32 Kết quả quá trình vô hoạt virus vacxin PRRS bằng Formalin 111
4.33 Lịch tiêm các loại vacxin vô hoạt cho các lô lợn thí nghiệm 112
4.34 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của lợn sau khi tiêm vacxin sử dụng chất bổ trợ khácnhau 113
4.35 Kết quả sản xuất vacxin vô hoạtnhũ dầu PRRS 115
4.36 Kết quả kiểm tra cảm quan các lô nhũ hoá 115
4.37 Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin vô hoạt PRRS 116
4.38 Kết quả kiểm tra thuần khiết vacxin vô hoạt PRRS 116
4.39 Kết quả theo dõi chỉ tiêu an toàn của vacxin PRRS ở lợn thí nghiệm 117
4.40 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA 118
4.41 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phương pháp IPMA 118
4.42 Kết quả đánh giá công cường độc 120
4.43 Phản ứng Realtime - PCR xác định virus trong máu của lợn sau công cường độc 121
Trang 13DANH MỤC HÌNH
2.1 Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2007-2010 9
2.2 Bản đồ dịch tễ phân bố của PRRS tại Việt Nam từ 2011-2013 10
2.3 Cấu trúc virus PRRS 15
2.4 Cấu trúc genome virus PRRS 16
2.5 Cây phả hệ của virus PRRS 17
2.6 Gen từ các chủng virus khác nhau 34
4.1 Tai sung huyết 58
4.2 Viêm mí mắt, có rử mắt 58
4.3 Ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn 58
4.4 Sảy thai 58
4.5 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR 59
4.6 Viêm phổi thùy 61
4.7 Hạch lympho sưng to 61
4.8 Thận xuất huyết 61
4.9 Lách nhồi huyết 61
4.10 Viêm phổi (HE×10) 64
4.11 Dịch tiết trong lòng phế nang (HE×40) 64
4.12 Gan sung huyết (HE×10) 64
4.13 Gan thâm nhiễm tế bào viêm (HE×40) 64
4.14 Đường biểu diễn quy luật nhân lên trên môi trường nuôi cấy của các chủng virus PRRS phân lập được 70
4.15 Bệnh tích tế bào (CPE) do PRRS gây ra trên tế bào MARC-145ở các thời điểm khác nhau 74
4.16 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 010TB ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau 76
4.17 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 012NA ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau 77
4.18 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 049HY ở P0 và P5 tạicác thời điểm khác nhau 77
Trang 144.19 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 052TH ở P0 và P5 tại các
thời điểm khác nhau 77
4.20 Đường biểu diễn sự nhân lên của chủng virus 008HN ở P0 và P5 tại các thời điểm khác nhau 78
4.21 Giản đồ giải trình tự tự động thành phần nucleotide của đoạn gen ORF5 nghiên cứu 80
4.22 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của các chủng virus PRRS
nghiên cứu 80
4.23 So sánh trình tự axit amin gen ORF5 của các chủng virus PRRS
nghiên cứu 82
4.24 So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của các chủng virus PRRS nghiên cứu và một số chủng tham chiếu 85
4.25 So sánh trình tự axit amin gen ORF7 của các chủng virus PRRS
nghiên cứu 87
4.26 Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF5 90
4.27 Cây phả hệ dựa trên trình tự gen ORF7 91
4.28 Kết quả điện di sản phẩm đoạn gen ORF5 và ORF7 sau 5 đời cấy chuyển của chủng KTY-PRRS-01 92
4.29 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển 93
4.30 So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-01 qua 5 đời cấy chuyển 94
4.31 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-02 qua 5 đời cấy chuyển 94
4.32 So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-02 qua 5 đời cấy chuyển 95
4.33 So sánh trình tự nucleotide gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-03 qua 5 đời cấy chuyển 96
4.34 So sánh trình tự nucleotide gen ORF7 của virus KTY-PRRS-03 qua 5 đời cấy chuyển 97
4.35 Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus CSF, PCV2, PPV 105
Trang 154.36 Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus giả dại và
Mycoplasma 105
4.37 Hình ảnh điện di kiểm tra tạp nhiễm của giống với virus PED, TGE 106
4.38 Tế bào MARC-145 âm tính với KT PRRSV 119
4.39 Tế bào MARC-145 dương tính với KT PRRSV bằng kỹ thuật IPMA 119
4.40 Kết quả Realtime-PCRxác định virusPRRSV 121
1 Môi trường dinh dưỡng trước khi kiểm tra vô trùng 137
2 Môi trường dinh dưỡng sau khi kiểm tra vô trùng 137
3 Môi trường dinh dưỡng sau khi kiểm tra vô trùng 137
4 Giống sản xuất được lấy để kiểm tra vô trùng 138
5 Kiểm tra vô trùng giống sản xuất trên thạch Macconkey 138
6 Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên thạch Sabouraud 138
7 Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên thạch Macconkey 138
8 Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên Canh thang PPLO 138
9 Kết quả kiểm tra giống sản xuất trên Thioglycollat 138
10 Phổi lợn được tiêm vacxin vô hoạt PRRS sau công cường độc 139
11 Phổi lợn được tiêm vacxin vô hoạt sau công cường độc (10X) 139
12 Phổi lợn không tiêm vacxin sau công cường độc, viêm, xuất huyết 139
13 Phổi lợn không tiêm vacxin sau công cường độc, viêm kẽ phổi (10X) 139
14 Triệu chứng lâm sàng của lợn không tiêm vacxin sau công cường độc (tím tai) 139
15 Bệnh tích đại thể của lợn không tiêm vacxin sau công cường độc (thận xuất huyết điểm) 139