Khảo sát tính thấm qua ruột của hệ vi tự nhũ chứa atorvastatin trên mô hình ex vivo

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHẢO SÁT TÍNH THẤM QUA RUỘT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MÔ HÌNH EX VIVO Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dƣợc Chủ trì nhiệm vụ: PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tƣơi Thành phố Hồ Chí Minh - 20… ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ KHẢO SÁT TÍNH THẤM QUA RUỘT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MƠ HÌNH EX VIVO Cơ quan chủ quản (ký tên đóng dấu) Chủ trì nhiệm vụ PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tƣơi Cơ quan chủ trì nhiệm vụ BÁO CÁO TĨM TẮT KHẢO SÁT TÍNH THẤM QUA RUỘT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MƠ HÌNH EX VIVO Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Đỗ Thị Hồng Tươi, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Cộng tác viên chính: PGS.TS Nguyễn Thiện Hải, DS Nguyễn Hồng Anh Nơi phối hợp thực hiện: Bộ mơn Bào chế, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM Mở đầu: Atorvastatin thuốc trị rối loạn lipid máu quen thuộc hiệu quả, nhiên sinh khả dụng thuốc lại thấp khoảng 14% hướng giải đầy tiềm bào chế dạng hệ vi tự nhũ (SMEDDS) Mục tiêu: Khảo sát tính thấm tương đối qua ruột hệ vi tự nhũ chứa atorvastatin Phƣơng pháp: Áp dụng mơ hình ex vivo lộn ngược đoạn ruột chuột để khảo sát tính thấm tương đối so sánh với thuốc đối chiếu Lipitor Kết quả: Hệ SMEDDS chứa atorvastatin có độ thấm tương đối tốt 1,54 lần so với thuốc đối chiếu Lipitor Kết luận: Hệ SMEDDS chứa atorvastatin có độ thấm ex vivo tương đối tốt thuốc đối chiếu Lipitor Từ khóa: SMEDDS, atorvastatin, tính thấm, ex vivo ABSTRACT STUDY ON EX VIVO PERMEABILITY OF SELF-MICROEMULSIFYING DRUG DELIVERY SYSTEM CONTAINING ATORVASTATIN IN MICE Introduction: Atorvastatin is a common and effective agent to treat dyslipidemia However, atorvastatin is a hydrophobic substance and its bioavailability is low, about 14%; therefore, it is necessary to find a solution to improve its absorption One of the most promising methods used widely these days is to develop a selfmicroemulsifying drug delivery system (SMEDDS) for atorvastatin The purpose of this work is study on ex vivo permeability of self-microemulsifying drug delivery system containing atorvastatin in mice Methods: This study used the everted gut sac model to compare SMEDDSatorvatatin’s relative permeability with the control drugs Results: The results showed that the relative permeability of SMEDDS-atorvastatin is 1.54 times better than that of control drug Conclusion: SMEDDS-atorvastatin could offer the use of reduced current dose of atorvastatin with the same effect Keywords: SMEDDS, atorvastatin, permeability, ex vivo BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHẢO SÁT TÍNH THẤM QUA RUỘT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MƠ HÌNH EX VIVO ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn lipid máu trở thành gánh nặng bệnh tật gánh nặng cho chi phí y tế Ở Hoa Kỳ, khoảng 53% dân số bị rối loạn lipid máu người người bị rối loạn lipid máu [1, 2] Ở nhiều nước Châu Á Thái Bình Dương, bệnh mạch vành với yếu tố nguy rối loạn lipid máu [3] Tổ chức Y tế giới (WHO) ước tính 50% bệnh nhân thiếu máu cục triệu người chết năm liên quan đến rối loạn lipid máu [4] Theo WHO, vào năm 2008, tỷ lệ rối loạn lipid Đông Nam Á 30,3%; Tây Thái Bình Dương 36,7%; thấp châu Âu 53,7% châu Mỹ 47,7% [3] Theo Hiệp hội Tim Mạch Hoa Kỳ, tổng chi phí chi trả cho bệnh tim mạch liên quan đến rối loạn lipid máu Hoa Kỳ vào năm 2006 lớn 400 triệu USD, chi phí để khám chữa bệnh chiếm gần 2/3 tổng chi phí [4] Nhiều thử nghiệm chứng minh tác dụng phòng ngừa biến cố tim mạch người rối loạn lipid máu nhóm statin, đặc biệt thử nghiệm Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial (ASCOT) Dự án dự tính nghiên cứu ngẫu nhiên bệnh nhân tăng huyết áp khơng có tiền sử bệnh mạch vành  yếu tố nguy bệnh tim mạch điều trị với atorvastatin (10 mg) placebo năm, kết thúc sớm năm biểu lâm sàng cải thiện đáng kể nhóm atorvastatin [4] Tuy nhiên, atorvastatin thân dầu tan nước, thuộc nhóm II hệ thống phân loại sinh dược học, sinh khả dụng khoảng 14% Một cách giúp tăng độ tan sinh khả dụng thuốc điều chế dạng hệ tự nhũ tạo vi nhũ tương (self-microemulsifying drug delivery system - SMEDDS) [5, 6, 7] Hiện nay, nhóm nghiên cứu môn Bào chế, Khoa Dược xây dựng cơng thức quy trình điều chế SMEDDS chứa atorvastatin đạt yêu cầu độ ổn định [14] Đề tài khảo sát tính thấm qua ruột ex vivo hệ vi tự nhũ chứa atorvastatin ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino, khỏe mạnh, trọng lượng 32  g, cung cấp Viện Vaccin Sinh phẩm y tế Nha Trang Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh Chuột ni lồng 15 x 26 x 36 cm (cao x rộng x dài) có lót lớp trấu, ni ổn định mơi trường thí nghiệm ngày Chuột cung cấp đầy đủ thức ăn nước uống suốt thời gian thử nghiệm 2.1.2 Hóa chất, thuốc thử Bảng Danh mục hóa chất thuốc thử sử dụng đề tài STT Hóa chất Nhà sản xuất Xuất xứ Lipitor® (Atorvastatin) Pfizer Mỹ SMEDDS atorvastatin Đại học Y Dược TP.HCM Việt Nam NaCl Guangdong Guanghua Trung Quốc NaH2PO4.2H2O Guangdong Guanghua Trung Quốc Na2HPO4.2H2O Guangdong Guanghua Trung Quốc KCl Guangdong Guanghua Trung Quốc CaCl2.2H2O Guangdong Guanghua Trung Quốc MgSO4 Guangdong Guanghua Trung Quốc 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ Bảng Danh mục thiết bị sử dụng đề tài STT Thiết bị Nhà sản xuất Xuất xứ Bếp cách thủy WB-14 Memmert Đức Cân phân tích Kern Đức Cân kỹ thuật Kern Đức Máy đọc ELISA Multiskan Thermo Electron Mỹ Máy vortex genius Ika Đức Máy ly tâm Hitachi Nhật Dụng cụ:  Falcon 15 mL; eppendorf 1,5 mL, mL;  Micropipet multimicropipet, đầu típ;  Đĩa 96 giếng;  Đĩa petri; becher 100 mL; bình định mức 500 mL; ống đong 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL;  Dụng cụ mổ, inox có thắt eo, mổ, kim tiêm mL (VinaHanbok) 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Khảo sát tính thấm ex vivo SMEDDS chứa atorvastatin qua ruột chuột nhắt Cho chuột nhịn đói 12 - 18 trước thí nghiệm cung cấp nước uống đầy đủ Chuột gây mê khí CO2 Mở bụng chuột đường rạch giữa, cẩn thận lập tồn đoạn ruột non từ đầu tá tràng đến cuối hồi tràng đặt dung dịch KRPB (pH 7,2) làm lạnh đến - 10 oC sục khí liên tục Chuyển đoạn ruột vào đĩa petri có chứa dung dịch KRPB lạnh, cẩn thận loại bỏ lớp mạc treo ruột, cắt để có đoạn ruột dài khoảng - cm thuộc phần hỗng tràng Rửa đoạn ruột thu - lần với dung dịch KRPB lạnh Q trình lập ruột thực vòng - phút Kỹ thuật lộn ngược ruột tiến hành sau:  Luồn buộc cố định đầu đoạn ruột vào vị trí thắt eo thép khơng rỉ dài 20 cm, nhẹ nhàng luồn toàn đoạn ruột lại qua thép để màng niêm mạc lộ phía ngồi;  Dùng dao cắt đường vịng quanh đầu ruột cách chỗ buộc vị trí thắt eo thép cm đẩy đoạn ruột lộn ngược khỏi thép;  Buộc đầu đoạn ruột chỉ, luồn đầu lại vào ống kim tiêm có chứa sẵn - mL dung dịch KRPB;  Bơm dịch vào lịng ruột cho ruột có độ căng phồng phù hợp, dùng buộc chặt đầu bơm dịch cho có túi ruột dài khoảng 6,5 cm;  Kiểm tra độ kín độ căng phồng túi ruột trước đem ủ Cả trình lộn ngược ruột điền dịch vào túi ruột thực vòng 10 - 15 phút;  Mỗi túi ruột đặt becher 100 mL chứa 50 mL dung dịch đệm KRPB (lô sinh lý) dung dịch SMEDDS chứa atorvastatin có nồng độ 100 μg/mL (lơ thuốc thử nghiệm) hỗn dịch Lipitor® có nồng độ 100 μg/mL (lô thuốc đối chiếu) pha KRPB, trì 37  0,5 oC sục khí liên tục;  Dịch KRPB bên ngồi túi ruột dịch niêm mạc, dịch bên túi ruột dịch mạc;  Sau 45 phút, thu lấy phần dịch mạc, ghi nhận thể tích thu được, đo chiều dài chiều rộng đoạn ruột Lượng atorvastatin thấm qua ruột từ SMEDDS chứa atorvastatin thuốc đối chiếu (thấm từ bề mặt niêm mạc đến bề mặt mạc) xác định phương pháp đo quang phổ UV-Vis bước sóng 245 nm, sử dụng mẫu trắng mẫu ruột lô sinh lý ủ với dung dịch đệm [8, 9] Tính thấm tương đối tính theo cơng thức sau: Tính thấm tương đối (μg/cm2) = Tính thấm tương đối lơ thuốc thử nghiệm lơ thuốc đối chiếu tính cách trừ kết mẫu trắng Thí nghiệm lặp lại lần cho dung dịch thử Quy trình thực minh họa Hình Hình Hình Thao tác lộn ngƣợc đoạn ruột [10] Đem ủ Sau 45 phút Hình Giai đoạn bơm dịch, ủ ruột thu lấy dịch 2.2.2 Xử lý kết phân tích số liệu thống kê Các kết trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình (Mean ± SEM) đánh giá ý nghĩa thống kê phần mềm SPSS 20.0 Với biến số tuân theo luật phân phối chuẩn, sử dụng phép kiểm Student’s t test để kiểm định khác biệt có ý nghĩa lô Với biến số không theo luật phân phối chuẩn, sử dụng phép kiểm Mann - Whitney để kiểm định khác biệt có ý nghĩa Sự khác biệt có ý nghĩa giá trị p < 0,05 0 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 TÍNH THẤM EX VIVO CỦA ATORVASTATIN TỪ SMEDDS QUA RUỘT CHUỘT NHẮT Tính thấm tương đối atorvastatin qua ruột từ SMEDDS chứa atorvastatin thuốc đối chiếu sau trừ trung bình tính thấm lơ sinh lý trình bày Bảng 3, minh họa Hình Bảng Kết diện tích ruột, thể tích dịch tính thấm tương đối atorvastatin từ thuốc thử nghiệm thuốc đối chiếu Diện tích ruột Thể tích dịch Tính thấm tƣơng đối (cm2) (mL) (g/cm2) 7,20 0,85 7,56 7,98 0,93 7,85 7,44 0,70 5,97 Thuốc thử 9,38 1,00 7,06 nghiệm 9,10 1,05 8,41 11,10 1,11 5,43 7,68 0,87 6,36 9,52 1,30 10,65 9,80 0,85 3,65 8,82 0,90 5,72 10,08 0,89 4,21 9,38 0,95 4,90 9,10 0,85 4,61 11,20 1,05 4,57 8,68 0,92 5,14 9,76 1,02 5,69 Lô Thuốc đối chiếu Bảng Tính thấm tương đối atorvastatin từ thuốc thử nghiệm thuốc đối chiếu Lơ Thể tích dịch màng (n = 8) thu đƣợc (mL) niêm mạc (cm2) đối (μg/cm2) Lipitor 0,93  0,26 9,60  0,29 4,81  0,25 0,98  0,65 8,68  0,47 7,41  0,58** Thuốc thử nghiệm Diện tích bề mặt màng Tính thấm tƣơng **: p < 0,01 so với lô thuốc đối chiếu Hình Tính thấm tƣơng đối thuốc thử nghiệm thuốc đối chiếu Nhận xét: Tính thấm atorvastatin từ thuốc thử nghiệm cao có ý nghĩa thống kê so với thuốc đối chiếu (p < 0,01) Sau 45 phút ủ, tính thấm tương đối atorvastatin từ hệ SMEDDS thuốc đối chiếu 7,41 μg/cm2 4,81 μg/cm2 Như vậy, với hệ SMEDDS xây dựng được, tính thấm atorvastatin ex vivo tăng 1,54 lần so với thuốc đối chiếu 2 BÀN LUẬN Tính thấm SMEDDS chứa atorvastatin qua ruột chuột nhắt Để khảo sát tính thấm atorvastatin từ hệ SMEDDS, đề tài sử dụng dung dịch đệm KRPB pH 7,2 tương tự mơ hình thực giới để khảo sát tính thấm thuốc dạng SMEDDS báo cáo Kelan cộng sự, Khutle Vijaya [9, 11, 12] Điều giải thích pH 7,2 pH bền ổn định theo thời gian dung dịch KRPB Nồng độ dung dịch/hỗn dịch thuốc thử/thuốc đối chiếu dung dịch đệm KRPB 100 g/mL phù hợp với nhiều báo cáo giới [9, 11, 13] Kết cho thấy tính thấm tương đối thuốc nghiên cứu cao gấp 1,54 lần so với thuốc đối chiếu Sự gia tăng tính thấm đáng kể atorvastatin từ hệ phân tán vi tự nhũ phù hợp mặt lý thuyết, nhiều yếu tố khác Yếu tố phân bố kích thước hạt đồng khoảng 15 - 65 nm, tập trung cao khoảng 30 nm Ngoài ra, chế phẩm nghiên cứu, atorvastatin diện trạng thái hịa tan với kích thước hạt nhỏ giúp làm tăng diện tích bề mặt, từ tạo điều kiện cho tính thẩm thấu thuốc tăng lên [14] Như vậy, tính thấm ex vivo qua ruột chuột nhắt atorvastatin từ sản phẩm dạng SMEDDS cao gấp 1,54 lần so với thuốc đối chiếu Lipitor Kết phù hợp với tác dụng điều trị rối loạn lipid máu cấp chuột nhắt SMEDDS atorvastatin liều 30 mg/kg tương đương Lipitor liều 60 mg/kg, làm giảm nồng độ triglycerid tương đương nhau, tác động giảm cholesterol toàn phần LDL-C cao gấp 1,3 - 1,4 lần, đặc biệt tác động tăng HDL-C cao gấp khoảng 2,0 lần Kết thu từ đề tài gợi ý tiềm phát triển sản phẩm dựa hệ SMEDDS chứa atorvastatin có tính thấm qua ruột tăng, làm tăng sinh khả dụng thuốc, góp phần tăng tuân thủ điều trị bệnh nhân, nâng cao hiệu điều trị lâm sàng 3 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đề tài tiến hành thử nghiệm tính thấm qua ruột mơ hình ex vivo sử dụng ruột chuột nhắt; kết thu cho thấy hệ SMEDDS chứa atovastatin thấm tốt thuốc đối chiếu Lipitor 1,54 lần KIẾN NGHỊ Từ kết thu được, đề tài sở để phát triển nghiên cứu thời gian tới theo định hướng nghiên cứu phát triển sản xuất dạng bào chế thích hợp cho hệ SMEDDS chứa atorvastatin để sử dụng lâm sàng TÀI LIỆU THAM KHẢO Frank A T et al (2014), “Racial/Ethnic Differences in Dyslipidemia Patterns”, NIH Public Access, 129(5), 570-579 Joffres M et al (2013), “Dyslipidemia prevalence, treatment, control, and awareness in the canadian health measures survey”, Canadian Journal of Public Health, 104(3), 252257 Lin C et al (2018), “Epidemiology of Dyslipidemia in the Asia Pacific Region”, International Journal of Gerontology, 12(1), 1-5 Smith D G (2007), “Epidemiology of Dyslipidemia and Economic Burden on the Healthcare System”, The Amercican Journal of Managed Care, 13 (3), 68-71 Bora D., Borude P., Bhise K (2012), “Formulation and evalution of self microemulsifying drug delivery system of low solubility drug for enhanced solubility and dissolution”, Asian journal of biomedical and pharmaceutical sciences, 2(15),7-14 Shen H., Zhong M (2006), “Preparation and evaluation of self-microemulsifying drug delivery systems (SMEDDS) containing atorvastatin”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 58(9), 1183-1191 Pattewar S et al (2016), “Self Microemulsifying Drug Delivery System: A Lipid Based Drug Delievery System”, International Journal of Pharamaceutical Sciences and Research, 7(2), 443-452 Alam M A., Al-Jenoobi F I., Al-mohizea A M (2011), “Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: limitations and applications”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 64(3), 326-336 Khuttle N M., Vijaya C (2014), “Formulation Studies on Novel Self-Solidifying Self Nanoemulsifying Drug Delivery Systems of Nebivolol Hydrochloride”, Pharmaceutical Nanotechnology, 2(2), 87-100 10 Hamilton K L., Butt A G (2013), “Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice”, Advances in Physiology Education, 37(4), 415-426 11 Khutle N M., Kelan D (2016), “Formulation and evaluation of self-microemulsifying drug delivery system of cefpodoxime proxetil”, European Journal of Pharmaceutical and Medical Research, 3(3), 491-499 12 Shalla CL., Fisher AK (1971), “Buffering action of Krebs-ringer-phosphate solutions in respiration studies of dental pulp”, Journal of Dental Research, 50(1), 116-118 13 Dixit P., Jain D K., Dumbwani J (2012), “Standardization of an ex vivo method for determination of intestinal permeability of drugs using everted rat intestine apparatus”, Journal of oharmacological and toxicological methods, 65(1), 13-17 14 Hà Thanh Tú (2015), Nghiên cứu điều chế hệ vi tự nhũ chứa atorvastatin, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Khoa Dược – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh  ... dạng hệ vi tự nhũ (SMEDDS) Mục tiêu: Khảo sát tính thấm tương đối qua ruột hệ vi tự nhũ chứa atorvastatin Phƣơng pháp: Áp dụng mơ hình ex vivo lộn ngược đoạn ruột chuột để khảo sát tính thấm. .. HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ KHẢO SÁT TÍNH THẤM QUA RUỘT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MÔ HÌNH EX VIVO Cơ quan chủ quản... effect Keywords: SMEDDS, atorvastatin, permeability, ex vivo BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHẢO SÁT TÍNH THẤM QUA RUỘT CỦA HỆ VI TỰ NHŨ CHỨA ATORVASTATIN TRÊN MƠ HÌNH EX VIVO ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn