Đánh giá tác dụng của bacillus dạng bào tử chịu nhiệt đến sinh trưởng, hệ vi khuẩn đường ruột và hình thái niêm mạc ruột lợn con theo mẹ và lợn con sau cai sữa

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐÌNH TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA BACILLUS DẠNG BÀO TỬ CHỊU NHIỆT ĐẾN SINH TRƯỞNG, HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT VÀ HÌNH THÁI NIÊM MẠC RUỘT LỢN CON THEO MẸ VÀ LỢN CON SAU CAI SỮA Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Bá Tiếp NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu Các tài liệu tham khảo trích dẫn có nguồn gốc xác thực Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Đình Trình i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực đề tài hồn thành luận văn, tơi ln nhận giúp đỡ nhiều tổ chức cá nhân Nhân dịp xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Viện đào tạo Sau đại học, Ban Chủ nhiệm khoa Thú Y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Giải Phẩu - Tổ Chức, Khoa Thú Y nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn khoa học, TS Nguyễn Bá Tiếp, trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài hồn thành luận văn Tơi ln biết ơn gia đình, cộng sự, đồng nghiệp bạn bè đóng góp cơng sức, động viên, giúp đỡ tơi hồn thành đề tài nghiên cứu luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Đình Trình ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract x Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan probiotic 2.1.1 Tổng quan Probiotic 2.1.2 Đặc điểm chung probiotics nhóm Bacillus 2.1.3 Các nghiên cứu ứng dụng Probiotics chăn nuôi 14 2.2 Đặc điểm sinh trưởng hệ vi sinh vật đường ruột lợn 17 2.2.1 Khủng hoảng sinh lý lợn trước sau cai sữa 17 2.2.2 Hệ vi sinh vật đường ruột lợn trước sau cai sữa 18 Phần Đối tượng - nội dung phương pháp nghiên cứu 21 3.1 Đối tượng - thời gian – địa điểm nghiên cứu 21 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21 3.1.2 Thời gian nghiên cứu 21 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Nội dung nghiên cứu 21 3.2.1 Kiểm tra độ bảo toàn số lượng bào tử Bacillus sau trình ép viên thức ăn 21 3.2.2 Đánh giá tác động PBW lợn theo mẹ 22 3.2.3 Đánh giá tác động PBW lợn sau cai sữa 22 3.3 Phương pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm nhân tố 22 iii 3.3.2 Các phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 24 3.3.3 Phương pháp tính tốn tiêu sinh trưởng 29 3.3.4 Phương pháp kiểm tra vi thể biểu mô niêm mạc ruột 31 3.3.5 Phương pháp phân tích số liệu 31 Phần Kết thảo luận 32 4.1 Kết kiểm tra độ bảo tồn bào tử Bacillus sau q trình ép viên thức ăn 32 4.2 Kết tác động chế phẩm PBW lợn theo mẹ 34 4.2.1 Tác động chế phẩm PBW đến tiêu sinh trưởng lợn theo mẹ 34 4.2.2 Tác động chế phẩm PBW đến lượng thức ăn thu nhận lợn theo mẹ 35 4.2.3 Tác động chế phẩm PBW đến tỷ lệ tiêu chảy tỷ lệ chết lợn theo mẹ 37 4.3 Kết tác động chế phẩm PBW Trên lợn sau cai sữa 48 4.3.1 Tác động PBW đến số tiêu sinh trưởng lợn sau cai sữa 48 4.3.2 Tác động chế phẩm PBW đến hiệu sử dụng thức ăn lợn sau cai sữa 50 4.3.3 Tác động chế phẩm PBW đến tỷ lệ tiêu chảy tỷ lệ chết lợn sau cai sữa 53 4.3.4 Kết tác động chế phẩm PBW đến số vi khuẩn đường ruột lợn cai sữa 40 4.3.3 Kết tác động chế phẩm PBW đến hình thái kích thước biểu mơ niêm mạc ruột lợn theo mẹ sau cai sữa 55 4.4 Thảo luận chung 58 Phần Kết luận kiến nghị 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Kiến nghị 61 Tài liệu tham khảo 62 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt ADG - Average Daily Gain (tăng trọng trung bình /ngày) ADFI - Average Daily Feed Intake (lượng thức ăn thu nhận /ngày) ATP - Adenosine Triphosphate CNSH - Công Nghệ Sinh Học ĐC - Đối Chứng FCR - Feed Conversion Ratio (Hệ số chuyển hóa chức ăn) FAO - Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc) PBW - Chế phẩm Probiotics Bacillus Weaner NB - Nutrien broth VK - Vi Khuẩn WHO - World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật sử dụng phổ biến chế phẩm probiotic Bảng 2.2 Tóm tắt thơng tin số sản phẩm probiotic có mặt thị trường 16 Bảng 2.3 Trạng thái Eubiosis Dysbiosis đường ruột lợn 19 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm lợn theo mẹ 23 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm lợn sau cai sữa 23 Bảng 3.3 Khẩu phần dinh dưỡng sở cho thí nghiệm 24 Bảng 4.1 Kết đánh giá độ bảo toàn bào tử Bacillus sau trình ép viên 32 Bảng 4.2 Tác động chế phẩm PBW đến tỷ lệ mắc tiêu chảy tỷ lệ chết lợn theo mẹ 38 Bảng 4.3 Số lượng số vi khuẩn chất chứa đoạn ruột lợn cai sữa 41 Bảng 4.4 Tác động PBW đến tỷ lệ mắc tiêu chảy tỷ lệ chết lợn sau cai sữa 53 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế tác động probiotic đường ruột Hình 2.2 Trực khuẩn Bacillus subtilis điển hình chi Bacillus 10 Hình 3.1 Pha lồng mẫu từ 10-1 đến 10-5 26 Hình 3.2 Các bước xác định số lượng số vi khuẩn đường ruột lợn theo mẹ 27 Hình 4.1 Khối lượng thể giai đoạn lợn theo mẹ 34 Hình 4.2 Tăng trọng trung bình ngày lợn theo mẹ 35 Hình 4.3 Lượng thức ăn thu nhận trung bình/ngày lợn theo mẹ 36 Hình 4.5 Chiều cao lông nhung biểu mô ruột non lợn theo mẹ 46 Hình 4.6 Chiều rộng lông nhung biểu mô ruột non lợn theo mẹ 47 Hình 4.7 Khối lượng thể giai đoạn lợn sau cai sữa (Mean±SD) nhóm đối chứng (ĐC) bổ sung chế phẩm (PBW) 48 Hình 4.8 Tăng trọng trung bình/ngày lợn sau cai sữa 49 Hình 4.9 Lượng thức ăn thu nhận trung bình/ngày lợn sau cai sữa 50 Hình 4.10 Hệ số chuyển hóa thức ăn FCR lợn sau cai sữa 51 Hình 4.11 Biểu mơ niêm mạc khơng tràng lợn 56 ngày tuổi (HE x 400) 55 Hình 4.12 Biểu mơ niêm mạc hồi tràng lợn 56 ngày tuổi (HE x 400) 56 Hình 4.13 Chiều cao lơng nhung biểu mơ ruột non lợn sau cai sữa 57 Hình 4.14 Chiều rộng lơng nhung biểu mơ ruột non lợn sau cai sữa 57 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Đình Trình Tên luận văn: Đánh giá hiệu Bacillus dạng bào tử chịu nhiệt đến sinh trưởng, hệ vi sinh vật đường ruột hình thái niêm mạc ruột lợn theo mẹ lợn sau cai sữa Ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Đánh giá tác động Bacillus dạng bào tử chịu nhiệt chế phẩm PBW đến số tiêu suất, hệ vi sinh vật đường ruột hình thái niêm mạc ruột lợn theo mẹ lợn sau cai sữa nhằm cung cấp sở khoa học cho ứng dụng chế phẩm chăn nuôi lợn Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp bố trí thí nghiệm nhân tố đánh giá tác dụng chế phẩm PBW đến tiêu sinh trưởng, tỷ lệ chết, tỷ lệ tiêu chảy lợn theo mẹ lợn sau cai sữa - Phương pháp thường quy nuôi cấy xác định số lượng số vi khuẩn: Bacillus spp (TCVN 8736:2011), tổng vi sinh vật hiếu khí (TCVN 5165 : 1990), E.coli (TCVN7924-2:2008), Clotridium perfringens (TCVN 4991:2005), Lactobacillus spp (TCVN 8737:2011) - Phương pháp thường quy làm tiêu vi thể nhuộm HE - Kích thước lơng nhung đo phần mềm Infinity Analysis kính hiển vi Kniss MBL-2000T (Olympus, Japan) Kết nghiên cứu - Bacillus dạng bảo tử chế phẩm PBW tỷ lệ bảo toàn cao (92 đến 94%) nhiệt độ 80oC - PBW cải thiện 9,82% tăng trọng bình trung bình/ngày tuần tuổi 22 đến 28; giảm 68,75% tỷ lệ tiêu chảy; giảm 65,41% số ngày tiêu chảy giảm 33,33% tỷ lệ chết với lợn theo mẹ - Đối với lợn giai đoạn sau cai sữa, PBW làm giảm 5,7% giá trị FCR; giảm 57,14% tỷ lệ tiêu chảy, 53,95% số ngày tiêu chảy 50% tỷ lệ chết - Bổ sung PBW cho lợn theo mẹ không ảnh hưởng đến số lượng E.coli, Clotridium perfringens chất chứa đường ruột làm tăng số lượng vi khuẩn viii Lactobacillus spp không tràng, hồi tràng kết tràng; tăng số lượng tổng vi khuẩn hiếu khí khơng tràng, hồi tràng, mạnh tràng kết tràng - PBW không ảnh hưởng đến kích thước lơng nhung biểu mơ niêm mạc ruột non lợn theo mẹ làm tăng chiều cao chiều rộng lông nhung tá tràng không tràng lợn sau cai sữa Kết luận Tác dụng chế phẩm PBW chứa bào tử Bacillus spp phụ thuộc vào tuổi lợn Mức độ ảnh hưởng đến tiêu sinh trưởng, chuyển hóa thức ăn, hội chứng tiêu chảy, vi sinh vật đường ruột kích thước biểu mơ niêm mạc ruột khác lợn theo mẹ lợn sau cai sữa Những kết nghiên cứu góp phần chứng minh tác dụng tích cực bào tử Bacillus spp PBW; sở cho việc ứng dụng chế phẩm chăn nuôi lợn, giảm thiểu sử dụng kháng sinh ix bổ sung probiotic giảm tỉ lệ tiêu chảy tình trạng tiêu chảy nghiêm trọng so với lơ đối chứng Ngồi ra, tăng trọng tiêu tốn thức ăn cải thiện so với lô đối chứng Bổ sung B licheniformis 107 CFU /kg thức ăn cho kết tích cực Các nghiên cứu chứng minh B subtilis vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus có khả tạo bào tử, nảy mầm sinh sơi điều kiện yếm khí khắc nghiệt hệ tiêu hóa (Tam et al., 2006, Hong et al., 2009), góp phần quan trọng tạo trì hệ sinh vật có lợi cho đường ruột Tính chất đặc biệt quan trọng người sử dụng kháng sinh kéo dài số lượng vi khuẩn có lợi người bị suy giảm nghiêm trọng Để khôi phục cân cho hệ vi sinh vật, đưa B subtilis vào giúp phòng ngừa số triệu chứng thường gặp dùng kháng sinh kéo dài tiêu chảy, táo bón co thắt ruột Các kết (Perdigon et al., 1999; Collins et al., 1999; Blok et al., 2002; Ahmed et al., 2013) chứng minh probiotic dựa thành phần Lactobacillus có tác dụng tăng cường miễn dịch qua cải thiện sức khỏe sức sản xuất vật nuôi Đặc biệt, kết chứng minh probiotic cải thiện môi trường ruột, làm giảm NH3 H2S, ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột Probiotic làm tăng nồng độ Immunoglobulin G (IgG) Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α), protein tín hiệu (cytokine) – sản phẩm đại thực bào, CD4+, lympho bào hay tế bào diệt tự nhiên Lê Thị Phượng (2000), chứng minh hiệu phòng ngừa tiêu chảy lợn chế phẩm sinh học Paciflor (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP, 109 CFU/g) Pacicoli (thành phần 100% bào tử Bacillus CIP, 109 CFU/g + kháng sinh: Colistin 4mg + Lincomycin 3mg) Chế phẩm Paciflor bổ sung thức ăn lợn mang thai giai đoạn cuối liên tục 28 ngày sau sinh làm giảm số lượng E coli phân lợn nái lợn con, giảm tỉ lệ tiêu chảy lợn theo mẹ; lợn ăn thức ăn có bổ sung Paciflor Pacicoli có số lượng E coli phân giảm, giảm tỉ lệ tiêu chảy cải thiện tăng trọng Tạ Thị Vịnh cs (2002), sử dụng chế phẩm VITOM 1.1 VITOM (chứa B subtilis chủng VKPMV-7092) để phòng, trị bệnh đường tiêu hóa lợn gà cho thấy VITOM cải thiện tăng trọng 6%, tỉ lệ tiêu chảy phân trắng giảm 11%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 100% khơng có tái phát (với lợn); cải thiện tăng trọng 11,8%, tỉ lệ khỏi bệnh đạt 99% (ở gà) 54 Nguyễn Như Pho Trần Thị Thu Thủy (2003) sử dụng probiotic Oganic Green lợn sau cai làm giảm số lượng E coli phân, giảm tỉ lệ tiêu chảy, cải thiện tăng trọng giảm tiêu tốn thức ăn Trần Quốc Việt cs (2009) nghiên cứu sản xuất probiotic enzyme tiêu hóa dùng chăn ni Kết tìm quy trình sản xuất chế phẩm probiotic làm tăng sinh trưởng vật nuôi 10%, tăng hiệu sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỉ lệ bệnh đường tiêu hóa vật ni Hội chứng tiêu chảy sau cai sữa ảnh hưởng lớn đến chăn nuôi lợn nhiều tác giả nghiên cứu hiệu chế phẩm probiotic đến tác dụng cải thiện vấn đề Trong kết thí nghiệm cho thấy số mắc tiêu chảy, tỷ lệ mắc tổng số ngày tiêu chảy nhóm bổ sung PBW thấp nhóm đối chứng (các số cao 50%) Kết nghiên cứu cho thấy PBW có ảnh hưởng tích cực đến giảm tình trạng tiêu chảy đàn qua giảm chi phí thú y cải thiện hiệu chăn nuôi lợn sau cai sữa 4.3.4 Kết tác động chế phẩm PBW đến hình thái kích thước biểu mơ niêm mạc ruột lợn sau cai sữa 4.3.4.1 Tác động chế phẩm PBW đến hình thái biểu mơ niêm mạc ruột lợn sau cai sữa Đánh giá cấu trúc vi thể biểu mô niêm mạc ruột cho thấy biểu mô niêm mạc tá tràng, không tràng hồi tràng nhóm bổ sung PBW nhóm đối chứng nghiên cứu trạng thái bình thường lợn sau cai sữa: Các lông nhung rõ, không đứt nát, tế bào biểu mơ khơng bị bong tróc; khe lông nhung rõ ràng (4.11 4.12) a b c c b a Bộ môn Giải phẩu – Tổ chức Bộ mơn Giải phẩu – Tổ chức Hình 4.11 Biểu mô niêm mạc không tràng lợn 56 ngày tuổi (HE x 400) 55 c c b a b a Bộ môn Giải phẩu – Tổ chức Bộ mơn Giải phẩu – Tổ chức Hình 4.12 Biểu mơ niêm mạc hồi tràng lợn 56 ngày tuổi (HE x 400) Ký hiệu: “a” thành ruột, “b” lớp cơ, “c” lớp biểu mô niêm mạc Cai sữa giai đoạn gây stress cho lợn thay đổi chế độ ăn, mơi trường ruột hình thái ruột, dẫn đến tỷ lệ tăng trưởng thấp, tỷ lệ mắc tiêu chảy cao cân vi sinh vật đường ruột (Giang et al., 2012 ) Theo Huang et al., (2012), bổ sung E faecium EF1 làm giảm phản ứng viêm ruột non lợn theo mẹ Vi khuẩn Lactic giúp bảo vệ tính tồn vẹn biểu mơ niêm mạc ruột thông qua chế bám dinh lên thủ thể tế bào biểu mô, hạn chế tác động vi khuẩn gây bệnh đường ruột (Lebeer et al., 2008) Khi bổ sung Lactobacillus reuteri I5007 cho thấy gắn kết mạnh vi khuẩn với dịch nhầy niêm mạc ruột số dòng tế bào tế bào Caco-2, tế bào IPEC-J2 tế bào IEC-6 (Hou et al., 2014; Li et al., 2008) Trạng thái lơng nhung tồn vẹn biểu ổn định ống tiêu hóa, khả hấp thu dinh dưỡng tương ứng với tỷ lệ mắc hội chứng tiêu chảy thấp lợn sau cai sữa 4.3.4.2 Tác động chế phẩm PBW đến chiều cao lông nhung biểu mô ruột lợn sau cai sữa Chiều cao lông nhung biểu mô tá tràng, khơng tràng hồi tràng nhóm bổ sung PBW tương ứng 0,50; 0,44 0,44mm Trong đó, nhóm đối chứng có chiều cao lơng nhung tá tràng, không tràng hồi tràng 0,43; 0,31 0,36mm (hình 4.13) Sai khác chiều cao lơng nhung tá tràng khơng tràng nhóm bổ sung PBW so với nhóm đối chứng có ý nghĩa thống kê (P