Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn azospirillum sp từ rễ lúa (oryza) có khả năng sinh iaa để kích thích tăng trưởng vi tảo chlorella vulgaris

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG VÕ THỊ NHƢ HUỲNH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM SP TỪ RỄ LÚA (ORYZA) CÓ KHẢ NĂNG SINH IAA ĐỂ KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG VI TẢO CHLORELLA VULGARIS Đà Nẵng – Năm 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG VÕ THỊ NHƢ HUỲNH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM SP TỪ RỄ LÚA (ORYZA) CÓ KHẢ NĂNG SINH IAA ĐỂ KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG VI TẢO CHLORELLA VULGARIS CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Giảng viên hƣớng dẫn: TS PHẠM THỊ MỸ Đà Nẵng – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu khóa luận trung thực chưa công bố cơng trình khác Đà Nẵng, tháng năm 2019 Tác giả luận văn VÕ THỊ NHƢ HUỲNH LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới cô TS Phạm Thị Mỹ ngƣời hƣớng dẫn, trực tiếp truyền đạt kinh nghiệm quý báu động viên tơi suốt q trình thực đồ án Xin cảm ơn cô ThS Lê Thị Mai, thầy ThS Vũ Đức Hoàng, thầy TS Trịnh Đăng Mậu, thầy ThS Hồng Ngọc Sơn nhiệt tình hƣớng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Sinh - Môi trƣờng - Đại học Sƣ Phạm - Đại học Đà Nẵng tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức, tạo điều kiện cho học tập năm đại học Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln giúp đỡ động viên suốt thời gian làm đồ án Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên thực Võ Thị Nhƣ Huỳnh MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu đề tài Ý nghĩa đề tài .2 3.1 Ý nghĩa khoa học .2 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN AZOSPIRILLUM SP 1.1.1 Lịch sử phát phân loại vi khuẩn Azospirillum sp 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lí 1.1.4 Một số đặc điểm IAA vi khuẩn Azospirillum sp .5 1.1.5 Một số ứng dụng vi khuẩn Azospirillum sp 1.2 KHÁI QUÁT VỀ VI TẢO CHLORELLA VULGARIS .7 1.2.1 Sơ lược về vi tảo Chlorella vulgaris 1.2.2 Ứng dụng vi tảo Chlorella vulgaris 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN AZOSPIRILLUM SP TRONG NƢỚC VÀ THẾ GIỚI .12 1.3.1 Một số nghiên cứu nước 12 1.3.2 Một số nghiên cứu giới 12 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VI TẢO CHLORELLA VULGARIS TRONG NƢỚC VÀ THẾ GIỚI .14 1.4.1 Một số nghiên cứu nước 14 1.4.2 Một số nghiên cứu giới 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.1 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .17 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .17 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 17 2.3.2 Phương pháp thu mẫu 19 2.3.3 Phương pháp phân lập 19 2.3.4 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng phân lập 20 2.3.5 Phương pháp định danh chủng vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử……… .23 2.3.6 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng chủng vi khuẩn định danh 26 2.3.7 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn định danh .27 2.3.8 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng vi khuẩn đến sinh trưởng vi tảo Chlorella vulgaris .27 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 29 3.1 PHÂN LẬP VI KHUẨN AZOSPIRILLUM SP TỪ MẪU RỄ LÚA 29 3.2 NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO, SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƢỢC…………………………………… 32 3.3 ĐỊNH DANH CHỦNG VI KHUẨN AZO09 BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 38 3.3.1 Tách chiết khuếch đại gen 38 3.3.2 Phân tích gel sản phẩm PCR 38 3.3.3 Giải trình tự đoạn gen 16S- rRNA định danh loài 39 3.4 KHẢO SÁT ĐƢỜNG CONG SINH TRƢỞNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM BRASILENSE……………………………………………………41 3.5 KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ pH ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TRƢỞNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM BRASILENSE .42 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 42 3.4.2 Ảnh hưởng pH môi trường 43 3.6 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM BRASILENSE KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG VI TẢO CHLORELLA VULGARIS 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .48 KẾT LUẬN 48 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49 PHỤ LỤC…………………………………………………………………………… 56 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid ACC 1-aminocyclopropane-1-carboxylic Azo Azospirillum CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide C Chlorella DNA DeoxyriboNucleic Acid ĐBSCL Đồng sông Cửu Long EtBr Ethidium bromide IAA Indole - - acetic acid IBA Indole - - butyric acid IpyA Indole-3-pyruvate NFb Nitrogen Free brothymol PAB Plant Associated Bacteria PCR Polymerase Chain Reaction PGPB Plant Growth Promoting Bacteria Trp Tryptophan UV Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Kí hiệu bảng Tên bảng Trang 2.1 Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng để khuếch đại vùng gen 25 16S rRNA 3.1 Đặc tính khuẩn lạc dòng vi khuẩn Azospirillum 31 3.2 Tổng hợp đặc tính sinh học chủng vi khuẩn 37 (Azo09) DANH MỤC CÁC HÌNH Số Tên hình hiệu Trang 1.1 Vi khuẩn Azospirillum brasilense 1.2 Vi tảo Chlorella vulgaris 1.3 Sơ đồ thể quan tế bào vi tảo Chlorella 2.1 Rễ lúa 17 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 18 2.3 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giũa hàm lƣợng IAA chuẩn OD530nm 23 2.4 Dãy pha loãng IAA chuẩn thành nồng độ 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 23 17,5; 20; 22,5; 25; 27,5; 30; 32,5µg/ml 3.1 Sinh khối vi khuẩn phân lập từ rễ lúa môi trƣờng NFb bán 29 lỏng 3.2 Hình dạng khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu rễ lúa 30 Azo01, Azo02, Azo03, Azo04, Azo05, Azo06, Azo07, Azo08, Azo09 3.3 Tế bào dƣới kính hiển vi chủng vi khuẩn Azo01, Azo02, Azo03, 32 Azo04, Azo05, Azo06, Azo07, Azo08, Azo09 3.4 Thử nghiệm oxidase chủng vi khuẩn Azo01, Azo02, Azo03, 33 Azo04, Azo05, Azo06, Azo07, Azo08, Azo09 3.5 Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Azo01, Azo02, Azo07, Azo08, 34 Azo09 3.6 Mẫu nuôi cấy môi trƣờng chứa tryptopan chủng vi khuẩn 34 Azo01, Azo08, Azo09 3.7 Khả sinh IAA chủng vi khuẩn Azospirillum 35 3.8 Phản ứng màu IAA với thuốc thử Salkowski chủng vi khuẩn Azo09 35 qua ngày 3.9 Hàm lƣợng IAA dịch nuôi cấy (µg/ml) theo thời gian 36 3.10 Khả di động chủng vi khuẩn Azo09 37 3.11 Sinh khối chủng vi khuẩn Azo09 38 3.12 Sản phẩm PCR chủng vi khuẩn (Azo09) 39 3.13 Tìm kiếm trình tự tƣơng đồng chủng vi khuẩn Azospirillum 40 chế hoạt động hệ enzyme, làm thay đổi khả trao đổi chất chúng Do làm vi sinh vật khả phát triển sinh sản Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu nƣớc [17], [18], [20] Nhƣ khoảng nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng chủng Azospirillum brasilense 30-35C 3.4.2 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng pH yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới sinh lý vi sinh vật [6] Thí nghiệm đƣợc tiến hành môi trƣờng dịch thể Dobereiner có pH thay đổi khoảng từ – 9, nuôi 32 ± 2C Sự ảnh hƣởng pH đƣợc thể hình 3.16 A brasilense CFU/ml (106) 5 5.5 6.5 pH 7.5 8.5 Hình 3.16 Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng chủng vi khuẩn Azospirillum brasilense Qua đồ thị hình 3.16 cho thấy chủng vi khuẩn Azospirillum brasilense có khả sinh trƣởng phổ pH rộng (từ 5,5 – 8,5), pH tối ƣu cho sinh trƣởng chủng dao động từ 6,5 – 7.0 (đều thuộc khoảng trung tính) Chủng vi khuẩn Azospirillum brasilense thu đƣợc sinh khối cực đại giá trị pH = 6,5 với mật độ tế bào đạt 8x106 Điều phù hợp với kết nghiên cứu trƣớc khoảng pH tối ƣu cho sinh trƣởng vi khuẩn thuộc chi Azospirilum Theo nghiên cứu Bashan công vi khuẩn Azospirillum sp sinh trƣởng môi trƣờng với pH tối ƣu 6,5-7 [17], [20] 43 Từ kết nghiên cứu đây, nhận thấy chủng vi khuẩn Azospirillum brasilense sinh trƣởng môi trƣờng Dobereiner pH 6,5-7, nhiệt độ 30-35C 3.6 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM BRASILENSE KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG VI TẢO CHLORELLA VULGARIS Thí nghiệm khảo sát khả kích thích tăng trƣởng vi tảo Chlorella vulgaris vi khuẩn Azospirillum brasilense đƣợc thiết lập việc đồng cố định hai chủng vào hạt alginate Alginate loại polymer sinh học có nguồn gốc từ tảo nâu biển Alginate polysacharit có nguồn gốc từ tảo nấu, đƣợc sử dụng phổ biến kỹ thuật cố định enzyme vi sinh vật Phƣơng pháp cố định gel alginate khơng hịa tan phƣơng pháp nhanh chóng, khơng độc hại, có hoạt tính tƣơng hợp sinh học cao, không tốn [19] Đồng cố định vi khuẩn Azospirillum brasilense vi tảo Chlorella vulgaris vào hạt alginate nhằm đảm bảo gần gũi vi khuẩn vi tảo từ kích thích tăng trƣởng vi tảo mơi trƣờng ni cấy BBM có bổ sung 0,01% tryptophan Hạt alginate sau đồng cố định vi khuẩn vi tảo đƣợc thể hình 3.17 Hình 3.17 Hạt alginate cố định vi tảo Chlorella vulgaris vi khuẩn Azospirillum brasilense Hạt alginate sau đồng cố định hai loại vi sinh vật có kích thƣớc khoảng mm màu xanh nhạt (màu vi tảo) Sau cố định xong, mẫu hạt alginate ngẫu nhiên đƣợc cắt ngang lát mỏng đƣợc gắn lam kính nhiệt độ phịng thí nghiệm quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng đại 100x Vị trí Chlorella vulgaris tế bào vi khuẩn Azospirillum brasilense hạt đƣợc xác định bên rìa lát cắt trƣớc sau nhuộm với fucshin (hình 3.18) 44 Hình 3.18.Lát cắt hạt alginate cố định vi khuẩn Azospirillum brasilense vi tảo Chlorella vulgaris trước sau nhuộm với fucshin kính hiển vi độ phóng đại 100x Trong q trình hóa rắn alginate thành hạt, khoảng trống có kích thƣớc khác đƣợc hình thành ngẫu nhiên cho phép chất dinh dƣỡng môi trƣờng dễ dàng khuếch tán vào hạt làm vi khuẩn vi tảo bị giữ lại hạt mà phát triển bình trƣờng Sự khuếch tán oxy bị giới hạn bên hạt gel, điều giải thích phần lớn tăng sinh Chlorella vulgaris có xu hƣớng xảy rìa hạt [19] Điều hạt nhỏ tốt để tăng sinh khối vi tảo Vi khuẩn Azospirillum brasilense vi khuẩn sinh trƣởng điều kiện hiếu khí kị khí nên có xu hƣớng phát triển hạt alginate Khảo sát A brasilense kích thích sinh trƣởng vi tảo Ch Vulgaris Vi tảo C vulgaris đƣợc nuôi cấy vào môi trƣờng BBM lơ thí nghiệm cố định hạt alginate vi khuẩn A brasilense không cố định hạt alginate với nồng độ tảo ban đầu 1,28x106 tế bào/ml (hình 3.19) nhằm khảo sát biến thiên nồng độ tảo ảnh hƣởng vi khuẩn kích thích tăng trƣởng vi tảo C vulgaris Sau ngày tiến hành thí nghiệm, kết phát triển vi tảo C.vulgaris đƣợc theo dõi thông qua đếm mật độ tế bào buồng đếm hồng cầu [19] đƣợc thể hình 3.20 45 Hình 3.19 Vi tảo C vulgaris ni cấy vào môi trường BBM cố định hạt alginate vi khuẩn A brasilense không cố định hạt alginate 25 Tế bào/ml (106) 20 15 10 0 Thời gian (ngày) Cố định Khơng cố định Hình 3.20 Sự sinh trưởng vi tảo C vulgaris đồng cố định với vi khuẩn hạt alginate Dựa vào kết hình 3.20 nhận thấy rằng, ngày đầu nuôi cấy, mẫu vi tao không cố định có tốc độ sinh trƣởng mạnh mẫu vi tảo cô định hạt alginate Tuy nhiên tiếp tục kéo dài thời gian nuôi cấy lại nhận thấy vi tảo đƣợc cố định có sức sinh trƣởng mạnh Sau ngày nuôi cấy mật độ tế bào đạt 21,6.106 tế bào/ml cao gấp 1,2 lần so với mẫu không cố định (mật độ tế bào đạt 18,72.10 tế bao/ml) Nhƣ tăng trƣởng C vulgaris đƣợc cố định vi khuẩn A 46 brasilense hạt alginate môi trƣờng BBM cho sinh khối cao mẫu không kết hợp với vi khuẩn ngày thứ nhờ phytohormone vi khuẩn sinh mà cịn có khả dễ dàng thu hoạch vi tảo cách thu hạt alginate lắng xuống bình ni cấy Các kết thu đƣợc phù hợp với nghiên cứu Bashan cộng [22], [23] 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trên sở kết thu đƣợc, rút số kết luận sau đây: Phân lập, định danh đƣợc chủng vi khuẩn Azo09 (Azospirillum brasilense) từ mẫu rễ lúa địa bàn tỉnh Quảng Nam Xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu cho chủng môi trƣờng Dobereiner nhiệt độ 32°C ± 2°C, pH= 6.8 Xác định đƣợc hàm lƣợng IAA mà chủng Azospirillum brasilense tổng hợp sau ngày đạt 31,82µg/ml Đã xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng cho chủng Azospirillum brasilense, xác định thời gian thu sinh khối sau 72h nuôi cấy Đã tiến hành đồng cố định vi khuẩn Azospirillum brasilense vi tảo Chlorella vulgaris hạt alginate nhận thấy sau ngày nuôi cấy môi trƣờng BBM vi tảo đƣợc cố định có mức sinh trƣởng mạnh, mật độ tế bào đạt 21,6.106 cao gấp 1,2 lần so với vi tảo không cố định KIẾN NGHỊ Nghiên cứu tách chiết IAA từ môi trƣờng nuôi cấyvi khuẩn Azospirillum brasilense Khảo sát hiệu xử lý nƣớc thải vi tảo đồng cố định với vi khuẩn Azospirillum brasilense 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Bùi Huy Đáp (1980), Cây lúa Việt Nam, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội [2] Bùi Văn Lệ, Lê Thị Mỹ Phƣớc, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Vũ Hồng Liên (1999), Giáo trình thực tập sinh hóa, ngành cơng nghệ sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia TP.HCM [3] Lê Duy Linh, Trần Thị Hƣờng,Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng (2001), Thực tập vi sinh sở, NXB Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh [4] Nguyễn Đức Lƣợng (2002), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh, tr 3-67, 260-291 [5] Nguyễn Hữu Hiệp Cao Ngọc Điệp (2002), Giáo trình thực tập Vi sinh vật đại cương, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Cần Thơ, TP Cần Thơ, Việt Nam [6] Nguyễn Lân Dũng cộng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội [7] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục [8] Nguyễn Mỹ Nhung (2007), Ảnh hưởng vi khuẩn Azospirillum amazonense Burkholderia kururiensis lên sinh trưởng suất lúa cao sản (giống ma lâm 213) trồng đất thịt pha cát thành phố Tuyên Hòa, tỉnh Phú Yên [9] Nguyễn Phƣớc Tƣơng (1989), Sự cố định đạm cộng sinh họ Đậu ứng dụng thực tiễn, NXB Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, tr 120-124 [10] Nguyễn Thị Phƣơng Tâm (2006), Phân lập tuyển chọn số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum lipoferum bắp, Luận văn cử nhân ngành Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Cần Thơ [11] Phạm Thị Ngọc Lan Lý Kim Bảng (2004), Tìm hiểu vi khuẩn cố định Nitơ sơng tự phân lập từ đất trồng lúa, Tạp chí sinh học.26 (1), Viện Công nghệ sinh học, trƣờng đại học Khoa học, Đại học Huế: tr 63-66 [12] Trần Đình Toại, Châu Văn Minh (2004), Tiềm rong biển Việt Nam NXB Khoa học Kỹ thuật [13] Trần Văn Vĩ (1995), Thức ăn tự nhiên, Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội 49 [14] Võ Thị Kiều Thanh, Nguyễn Duy Tân, Vũ Thị Lan Anh, Phùng Huy Huấn (2012), Ứng dụng tảo Chlorella sp Daphnia sp lọc chất thải hữu xử lý nước thải từu trình chăn ni lợn sau xử lý USAB, Tạp chí sinh học (34) [15] TCVN 8551:2010 - Tiêu chuẩn Việt Nam trồng – phương pháp lấy mẫu chuẩn bị mẫu TÀI LIỆU TIẾNG ANH [16] Barbieri, P., T Zanelli, E Galli, and G Zanetti (1986), ―Wheat inoculation with Azospirillum brasilense Sp6 and some mutants altered in nitrogen fixation and indole3-acetic acid production”, FEMS Microbiol Lett, pp.87-90 [17] Baldani, V L D., J I Baldani and J Dobereiner (1987), ―Inoculation of fieldgrown wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum spp in Brazil‖, Biol Fert Soils, pp.37-40 [18] Bashan and Levanony (1990), ―Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge for agriculture‖, Can J Microbiol, pp.591608 [19] Bashan, Y (1986) “Alginate beads as synthetic inoculant carriers for the slow release of bacteria that affect plant growth‖, Appl Environ Microbiol 51: 1089– 1098 [20] Becking, J H (1982) ―Azospirillum lipoferom are appraisal In Azospirillum Genetics, physiology, ecology‖, Edited by W Klingmüller Birkh Auser Verlag, Basel pp: 130-149 [21] Becker, E W (1994), “Microalgae: biotechnology and microbiology‖, Vol 10 Cambridge University Press [22] Beijerinck, M W (1890), "Culturversuche mit Zoochlorellen, Lichenengonidien und anderen niederen Algen", Bot Zeitung 48: 781–785 [23] Bettman, H., and H J Rehm (1984), “Degradation of phenol by polymer entrapped microorganisms‖, Appl Microbiol Biotechnol 20:285–290 [24] Boddy M Boddey (1995), ―Biological nitrogen fixation m sugarcane: a key to energetically biofuel producation‖, Crit Rev Plant Sci, pp.263-279 [25] Breenner, D.J., Krieg, N.R & Staley, J.T (2005), ―The Proteobacteria, Part A Introductory Essay‖, In G.M Garity (ed.), Bergey’s of Systematic Bacteriology, Second Edition, Spinger, New York: [i]-xxvi, pp 1-304 50 [26] Carcano-Montiel and M A Mascarua-Esparza (1992), ―Field inoculation of wheat (Triticum aestivum) with Azospirillum brasilense under temperate climate Symbiosis‖, pp 243-253 [27] Claudine Franche, Krisrina Lindstrom, Claudine Elmerich (2008), “Nitrogenfixing Bacteria in Non-leguminous Crop Plants‖, Springer-Verlag, Berlin 320 pp [28] Demirbas, M F (2011), "Biofuels from algae for sustainable development", Applied Energy 88 (10): 3473–3480 [29] Dhanya and Padmavathy (2014), ―Impact of Endophytic Microorganisms on Plants, Environment and Humans‖, The Scientific World Journal [30] Favilli, Osmar (1989), ―Esperienzecpluriennalidi batterizzazione in camp Azospirillum sp Dicoltore cerealicole‖, Anna Microbiol, pp 169-181 [31] Fernandes, B., Dragone, G., Abreu, A P., Geada, P., Teixeira, J., & Vicente, A (2012), "Starch determination in Chlorella vulgaris—a comparison between acid and enzymatic methods" Journal of Applied Phycology 24 (5): 1203–1208 [32] Fox, Sidney W.; Bullock, Milon W (1951), "Synthesis of Indoleacetic Acid from Glutamic Acid and a Proposed Mechanism for the Conversion", Journal of the American Chemical Society 73 (6): 2754–2755 [33] Fradique, M., Batista, A P., Nunes, M C., Gouveia, L., Bandarra, N M., & Raymundo, A (2010), "Incorporation of Chlorella vulgaris and Spirulina maxima biomass in pasta products Part 1: Preparation and evaluation", Journal of the Science of Food and Agriculture 90 (10): 1656–1664 [34] Gillis M., Kersters K., Hoste B., Janssens D., Kroppenstedt R.M., Stephan M.P., Teixeira K.R S., Dobereiner J and Deley J (1989) “Acetobactev diazotrophicus sp nov., a Nitrogen-Fixing Acetic Acid Bacterium Associated with Sugarcane‖, International Journal of Systematic Bacteriology, Vol 39, No 3, pp 361-364 [35] Glickmann, E and Y Dessaux (1995), “A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria‖, Appl Environ Microbiol, 61(2):793-796 [36] Gonzalez, L E., R O Canizares, and S Baena (1997), ―Efficiency of ammonia and phosphorus removal from Colombian agroindustrial wastewater by the microalgae Chlorella vulgaris and Scenedesmus dimorphus‖ Biores Technol 60:259–262 51 [37] Hill, S (1992), “Physiologyn of nitrogen fixation in free-living heterotrophs in Biological Nitrogen Fixation‖, Chapman and Hall, New York [38] Hingsinger et al (2009), ―Endophytic bacteria in cacti seeds can improve the development of cactus seedlings‖, Environmental and Experimental Botany, pp.402408 [39] Holland M A., Polacco J C (1994), “PPFMs and other coveư contaminants: is there more to plant physiology than just plant?‖, Plant Physiology, Vol 45, pp 197209 [40] Ivonne Cruz, Yoav Bashan, Gustavo Hernàndez-Carmona, Luz E de-Bashan (2013), “Biological deterioration of alginate beads containing immobilized microalgae and bacteria during tertiary wastewater treatment”, Appl Microbiol Biotechnol 97:9847–9858 [41] Jeffrey J Tarrand And Noel R Kriec (1978), ―A taxonomic study of the Spirillum lipoferum group, with descriptions of a new genus, Azospirillum gen nov and two species, Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb nov and Azospirillum brasilense sp nov.‖ Department of Biology, Virginia Polytechnic Institate University, Blacksburg, pp 967-980 [42] Johanna Dobereiner , Vera L D, Baldani, Veronica (1995), ―Endophytic occurrence of diazotrophic bacteria in non-leguminous crops‖, In: Azospirillum VI and relate microorganisms, Fendrik I; M del Gallo J Vanderleyden and M de Zamarocy (eds.), pp 3-14 Springer Verlag, Berlin, Germany 230 pp [43] Johnson, Herbert E.; Crosby, Donald G (1964), "Indole-3-acetic Acid" Organic Syntheses‖, 44: 64.; Collective Volume, 5, p 654 [44] Justo, G Z., Silva, M R., & Queiroz, M L S (2001), "Effects of the green algae Chlorella vulgaris on the response of the host hematopoietic system to intraperitoneal Ehrlich ascites tumor transplantation in mice" Immunopharmacology and Immunotoxicology 23 (1): 119–132 [45] Kerchev P, Muhlenbock P, Denecker J, Morreel K, Hoeberichts FA, van der Kelen K, Vandorpe M, Nguyen L, Audenaert D, van Breusegem F (2015), "Activation of auxin signalling counteracts photorespiratory H2O2-dependent cell death", Plant Cell Environ 38 (2): 253–65 52 [46] Kitada, K., Machmudah, S., Sasaki, M., Goto, M., Nakashima, Y., Kumamoto, S., & Hasegawa, T (2009), "Supercritical CO2 extraction of pigment components with pharmaceutical importance from Chlorella vulgaris" Journal of Chemical Technology and Biotechnology 84 (5): 657–661 [47] Konishi, F., Tanaka, K., Himeno, K., Taniguchi, K., & Nomoto, K (1985), "Antitumor effect induced by a hot water extract of Chlorella vulgaris (CE): resistance to Meth-A tumor growth mediated by CE-induced polymorphonuclear leukocytes", Cancer Immunology, Immunotherapy 19 (2): 73–78 [48] Krieg, N R and J Döbereiner (1984), ―Genus Azospirillum in Bergey’s manual of Systematic Bacteriology 1, N R Krieg and J G Holt Eds‖, Williams and Wilkins, Baltimore 690 pp 32 [49] Lamb HFS, DK Barnes, MP Russelle, CP Vance, GH Heichal and KI Henjum (1995), ―Ineffectively and effectively nodulated alfalfa demonstrate biological nitrogen fixation continues with high nitrogen fertilization‖ Crop Sci, pp 153-157 [50] Lebuhn Hartmann (1993), ―Method for the determination of indole-3-acetic acid and related compounds of l-tryptophan catabolism in soils”, pp 255-266 [51] Li, H.-B., Jiang, Y., & Chen, F (2002), "Isolation and purification of lutein from the microalga Chlorella vulgaris by extraction after saponification" Journal of Agricultural and Food Chemistry 50 (5): 1070–1072 [52] Luz E de-Bashan, Manuel Morenoa, Juan-Pablo Hernandeza, Yoav Bashana (2001), ―Removal of ammonium and phosphorus ions from synthetic wastewater by the microalgae Chlorella vulgaris coimmobilized in alginate beads with the microalgae growth-promoting bacterium Azospirillum brasilense‖, pp 2941-2948 [53] Luz E Gonzalez1 and Yoav Bashan (2000), ―Increased Growth of the Microalga Chlorella vulgaris when Coimmobilized and Cocultured in Alginate Beads with the Plant-Growth-Promoting Bacterium Azospirillum brasilense‖, pp 1527-1531 [54] Majima, Rikō; Hoshino, Toshio (1925), "Synthetische Versuche in der IndolGruppe, VI.: Eine neue Synthese von β-Indolyl-alkylaminen" Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft (A and B Series) 58 (9): 2042–6 [55] Meza, B., de-Bashan, L.E., and Bashan, Y (2015), “Involvement of indole-3acetic acid produced by Azospirillum brasilensis accumulsting intracellular ammonium in Chlorella vulgaris‖ 166: 72-83 53 [56] Morimoto, T., Nagatsu, A., Murakami, N., Sakakibara, J., Tokuda, H., Nishino, H., & Iwashima, A (1995), "Anti-tumour-promoting glyceroglycolipids from the green alga, Chlorella vulgaris" Phytochemistry 40 (5): 1433–1437 [57] Morris, H J., Almarales, A., Carrillo, O., & Bermúdez, R C (2008) "Utilisation of Chlorella vulgaris cell biomass for the production of enzymatic protein hydrolysates" Bioresource Technology 99 (16): 7723–7729 [58] Muthukumarasamy R., Revathi G., Seshadri S and Lakshminarasimhan C., (2002) “Gluconacetobacter diazotrophicus (syn Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte in tropics‖, Current Science, Vol 83, No 2, pp 137-145 [59] Okon Kapulnik (1986), “Development and function of Azospirilluminoculated roots‖, Plant and soil 90, pp 3-16 [60] Okon Labandera-Gonzalez (1994), “Agronomic apllications of Azospirillum: An evaluation of 20 years worldwide field inoculation‖, Soil Biol Biochem., pp 1591- 1601 [61] Pekker, MD; Deshaies, RJ (2005), "Function and regulation of cullin-RING ubiquitin ligases" Plant Cell (1): 9–20 [62] Pokorny Robert (1941), "New Compounds Some Chlorophenoxyacetic Acids" J Am Chem Soc 63 (6): 1768 [63] Safi, C., Zebib, B., Merah, O., Pontalier, P Y., & Vaca-Garcia, C (2014), "Morphology, composition, production, processing and applications of Chlorella vulgaris: A review", Renewable and Sustainable Energy Reviews 35: 265–278 [64] Servaites, J C., Faeth, J L., & Sidhu, S S (2012), "A dye binding method for measurement of total protein in microalgae", Analytical Biochemistry 421 (1): 75– 80 [65] Seyfabadi, J., Ramezanpour, Z., & Khoeyi, Z A (2011), "Protein, fatty acid, and pigment content of Chlorella vulgarisunder different light regimes", Journal of Applied Phycology 23 (4): 721–726 [66] Simon, Sibu; Petrášek, Jan (2011), "Why plants need more than one type of auxin", Plant Science 180 (3): 454–60 [67] Singh, A., Nigam, P S., & Murphy, J D (2011), "Renewable fuels from algae: An answer to debatable land based fuels", Bioresource Technology 102 (1): 10–16 54 [68] Singh, A., Singh, S., & Bamezai, R (1999), "Inhibitory potential of Chlorella vulgaris (E-25) on mouse skin papillomagenesis and xenobiotic detoxication system", Anticancer Research 19 (3A): 1887–1891 [69] Templeman W G.; Marmoy C J (2008), "The effect upon the growth of plants of watering with solutions of plant-growth substances and of seed dressings containing these materials" Annals of Applied Biology 27 (4): 453–471 [70] Tiwari, SB; Hagen, G; Guilfoyle, TJ (2004), "Aux/IAA proteins contain a potent transcriptional repression domain" Plant Cell 16 (2): 533–43 [71] Ulmasov, T; Hagen, G; Guilfoyle, TJ (1997), "ARF1, a transcription factor that binds to auxin response elements" Science 276 (5320): 1865–68 [72] Wang, K G., Brown, R C., Homsy, S., Martinez, L., & Sidhu, S S (2013) "Fast pyrolysis of microalgae remnants in a fluidized bed reactor for bio-oil and biochar production", Bioresource Technology 127: 494–499 [73] Yasukawa, K., Akihisa, T., Kanno, H., Kaminaga, T., Izumida, M., Sakoh, T., Tamura, T., & Takido, M (1996) "Inhibitory effects of sterols isolated from Chlorella vulgaris on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced inflammation and tumor promotion in mouse skin" Biological and Pharmaceutical Bulletin 19 (4): 573–576 [74] Yoav Bashan, Gina Holguin, and Luz E de-Bashan (2004), ―Azospirillum Plant relationships: Physiological, molecular, agriculture, and environmental advances 1997-2003” Can J Microbiol, pp 521-577 55 PHỤ LỤC Thành phần môi trƣờng Môi trƣờng vô đạm NFb (nitrogen – fixing broth) (MT1) Thành phần môi trƣờng (g/l) D,L malic acid 5,0 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H20 0,2 CaCl2 0,02 NaCl 0,1 Bromothymol blue (0.5%) KOH 0.2M 2ml Dung dịch vitamin(1) 1ml Dung dịch khoáng vi lƣợng (2) 2ml 1,64% dung dịch FeETDA 4ml KOH 4,5ml Agar 0,0175-0,5% pH 6,5 (1) Trong 100 ml, dung dịch vitamin chứa: Biotin 10mg Pyridoxol-HCl 20mg Hòa tan chậu nƣớc 1000C (2) Trong lít, dung dịch khống vi lƣợng chứa: CuSO4.5H2O 40mg ZnSO4.7H2O 0.12g H3BO3 1,4g NaMoO4 1,0g MnSO4.H2O 1,175g Môi trƣờng NFb rắn có bổ sung congo đỏ (MT2) Mơi trƣờng có thành phần mơi trƣờng đặc (15g agar/l) NFb có bổ sung 15ml dung dịch đỏ congo 0,25% cao nấm men 50mg/lít mơi trƣờng Môi trƣờng Dobereiner cộng (1976) (g/l) (MT3) Acid malic 5,0 K2HPO4 0,4 56 MgSO4.7H20 0,2 CaCl2.7H2O 0,02 NaCl 0,1 FeCl3.6H2O 0,01 NaMoO4 0,002 Bromothymol blue (0.5%) 2ml KOH 4,0 Agar 1,75 pH 6,8 Môi trƣờng BBM Môi trƣờng nuôi vi tảo vi khuẩn đƣợc chuẩn bị 950ml nƣớc cất, bổ sung thành phần theo bảng Định mức đến 1000ml Hấp khử trùng STT Thành phần Dung dịch Stock (g/l) Hàm lƣợng (ml/l) KH2PO4 17.5 10 K2HPO4 7.5 10 NaCl 2.5 10 CaCl2.2H2O 2.5 10 MgSO4.7H2O 7.5 10 NaNO3 25 10 H3BO3 8.05 10 Na2ETDA 10 KOH 6.2 FeSO4.7H2O 4.98 H2SO4 1ml MnCl2.4H2O 1.81 ZnSO4 7H2O 0.222 CuSO4 5H2O 0.079 Co(NO3)2.6H2O 0.0494 1 0,2 57 ... KHOA SINH – MÔI TRƢỜNG VÕ THỊ NHƢ HUỲNH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN AZOSPIRILLUM SP TỪ RỄ LÚA (ORYZA) CÓ KHẢ NĂNG SINH IAA ĐỂ KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG VI TẢO CHLORELLA VULGARIS. .. tiêu nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Azospirillum sp có khả sinh IAA để kích thích tăng trƣởng vi tảo Chlorella vulgaris, từ tạo liệu khoa học có tính hệ thống chủng phân lập đƣợc,... trên, tiến hành thực đề tài: ? ?Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn Azospirillum sp từ rễ lúa (oryza) có khả sinh IAA để kích thích tăng trƣởng vi tảo Chlorella vulgaris? ?? Mục tiêu đề tài