NGHIÊN CỨU CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY CÔM (ELAEOCARPUS GRIFFITHI) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Luận văn Thạc sĩ 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN O0O TRẦN THU TRANG NGHIÊN CỨU CÁC THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY CÔM (ELAEOCARPUS GRIFFITHI) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TSKH Phạm Văn Cƣờng Hà Nội, Năm 2013 LỜI CẢM ƠN Luận văn Thạc sĩ 2013 Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TSKH Phạm Văn Cường người tận tình hướng dẫn tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán phịng Tổng hợp Hữu -Viện Hóa sinh biển ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển động viên giúp đỡ tơi nhiều việc hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới dự án Pháp – Việt, đặc biệt Viện Hóa học Hợp chất Tự nhiên Gif-sur-Yvette (Cộng hịa Pháp) đo mẫu thử hoạt tính gây độc tế bào cặn chiết chất phân lập để tơi hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học thầy cô giáo Khoa Sinh học-Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-ĐHQG Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn đến gia đình bạn bè động viên bên cạnh giúp đỡ tơi lúc khó khăn sống để tơi làm việc tốt hồn thành tốt luận văn Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2013 Trần Thu Trang Luận văn Thạc sĩ 2013 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AMEM Advanced Minimum Essential Medium ATCC Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ CC Column Chromatography (Sắc ký cột) 13 Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy C-NMR (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon) d Dublet dd Dublet dublet dt Dublet triplet dq Dublet quartet DMSO Dimethyl sulfoxyd DEPT Distortionless Enhancement By Polarization Transfer (Phổ DEPT) ED50 Liều tác dụng tối đa 50% đối tượng thử ESI-MS Electron Spray Impact Mas Spectroscopy (Phổ khối va chạm phun mù điện tử) HSQC Heteronuclear Spectroscopy Quantum Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác liên kết dị hạt nhân) H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) H-1H-COSY H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton) IR Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại) IC50 Nồng độ ức chế 50% phát triển cá thể nghiên cứu KB Tế bào ung thư biểu mô MCF-7 Tế bào ung thư vú m Multiplet MS Mass spectrometry Luận văn Thạc sĩ 2013 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) NMR Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng) TMS Tetramethylsilan Trypsin EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) t Triplet TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) SKC Sắc ký cột S Singulet q Quartet J(Hz) Hằng số tương tác tính Hz δ (ppm) Độ chuyển dịch hóa học tính ppm Luận văn Thạc sĩ 2013 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Cây Cơm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Cơm (Elaeocarpaceae) Hình Một số hợp chất alkaloid từ lồi Elaeocarpus grandis Hình Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides Hình Một số hợp chất phân lập từ loài E parvifolius E mastersi Hình 5: Một số hợp chất từ lồi Elaeocarpus habbemensis Hình 6: Chu kỳ tế bào Hình 7: Các tác nhân alkylants Hình 8: Những tác nhân chống lại trình trao đổi chất 10 Hình 9: Ức chế tổng hợp protein 11 Hình 10: Các chất đan xen chuỗi ADN 11 Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I II 12 Hình 12: Cấu trúc hóa học hợp chất F1 13 Hình 13: Cấu trúc hóa học chất F2 26 Hình 14: Cấu trúc hóa học chất F3 27 Hình 15: Cấu trúc hóa học chất F4 29 Hình 16: Khảo sát hoạt tính độc tế bào ung thư vú chất F2 30 Hình 17: Minh họa ảnh hưởng chất F2 dòng tế bào ung thư biểu mơ KB 32 Hình 18: Minh họa ảnh hưởng chất F2 dòng tế bào ung thư vú MCF-7 32 Luận văn Thạc sĩ 2013 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Số liệu phổ H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) DMSO Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) DMSO Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) DMSO Bảng 3.4Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz) 13C-NMR (125 MHz) DMSO chất F1 chất F2 chất F3 chất F4 Luận văn Thạc sĩ 2013 MỞ ĐẦU Ngày nay, với cơng phát triển kinh tế việc chăm sóc sức khỏe ban đầu bảo vệ sức khỏe cộng đồng trở nên cấp thiết quốc gia giới Do vậy, nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa chữa trị bệnh nan y, đặc biệt ung thư ngày cao Hiện nay, hướng để phòng ngừa chữa trị bệnh ung thư nghiên cứu tìm hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên Theo đánh giá Tổ chức Y tế giới (WHO), 80% dân số toàn giới tin dùng loại thảo dược cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu khoảng 60% tác nhân hóa trị liệu dùng điều trị ung thư có nguồn gốc từ hợp chất tự nhiên.[9,15,20] Nước ta có thảm thực vật vơ phong phú đa dạng Theo số liệu thống kê Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), thảm thực vật Việt Nam có 12.000 lồi, có khoảng 3.200 lồi sử dụng dân gian làm thuốc có hoạt tính cao, sử dụng rộng rãi việc điều trị bệnh [34] Ví dụ bật việc phát hai loại hoạt chất tự nhiên Vinblastine Vincristine từ Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don), họ Trúc đào (Apocynaceae) [19] Taxol từ thông đỏ (Taxus brevifolia), họ Thông (Pinaceae) [31], với dẫn xuất bán tổng hợp Taxotere từ 10-deacetyl bacatin III hay gần hoạt chất Vinflunine từ Vinorelbine thức sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư Tuy nhiên, phần lớn thuốc dân gian chưa nghiên cứu cách hệ thống Việc nghiên cứu thành phần hóa học khảo sát hoạt tính sinh học khơng giúp sử dụng thuốc cách hiệu mà sở cịn phân lập hoạt chất để từ tiến hành tổng hợp bán tổng hợp hoạt chất có hoạt tính cao tác dụng phụ điều trị Mơ hình nghiên cứu “Sinh học dẫn đường” nhằm tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học mơ hình nghiên cứu tiên tiến, có định hướng cao, nhằm làm sáng tỏ chất khoa học nguồn tài nguyên thiên nhiên, góp phần đưa nhanh kết nghiên cứu vào áp dụng thực tiễn Việc nghiên cứu kế thừa phát huy vốn quí dân tộc đặt lúc vừa vận hội thách thức nhà Luận văn Thạc sĩ 2013 khoa học nói chung cho nhà nghiên cứu phát triển cơng nghiệp nói riêng Với mong muốn đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học thảo dược dân tộc, tiến hành đề tài : “Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào Côm (Elaeocarpus griffithi) với nội dung nghiên cứu sau: Nội dung - Nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc hợp chất dịch chiết etylaxetat Côm (Elaeocarpus griffithi), thuộc họ Cơm (Elaeocarpaceae) - Khảo sát hoạt tính độc tế bào dịch chiết etylaxetat tổng chất phân lập Luận văn Thạc sĩ 2013 CHƢƠNG1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Côm 1.1.1 Mô tả thực vật Côm(Elaeocarpus griffithii) loại đại mộc cao khoảng 10-25m, thân thẳng, gốc có bạnh bè thấp, cành non màu nâu nhạt, nhánh non có lơng mịn Lá có phiến mỏng hình mác dài 7-10 cm, rộng 2,5-3,5 cm, đầu có mũi nhọn, mép lượn sóng, có cưa mềm, hoa mọc thành chùm nách hay đầu cành, đài hoa có năm đài hình tam giác, nhị nhiều Quả hình thận dài 1,5 cm, đường kính 0,8 – 1cm, chín có màu đen Gỗ màu trắng vàng dựng làm nhà, đóng đồ mộc thơng thường xẻ ván Nhân dân nhiều nơi thường chặt hạ để mục rừng để gây trồng nấm hương[1,2] Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae) 1.1.2 Phân bố sinh thái Côm (Elaeocarpus griffithii) loại nhiệt đới cận nhiệt đới, với ơn đới Phần lớn lồi thường xanh Cây mọc rải rác rừng thứsinh độ cao từ 400 m trở xuống Cây ưa sáng, mọc nhanh, thích hợp với đất Luận văn Thạc sĩ 2013 sét pha Tái sinh hạt tốt, hoa vào tháng 8-9, có chín tháng 12 đến tháng năm sau [1,2] Chúng tìm thấy Madagascar, Đơng Nam Á, Malaysia, miền đông Australia, New Zealand, Tây Ấn Chile Họ chứa khoảng 605 loài thân gỗ bụi 12 chi Ở Việt Nam có 38 loài phân bố từ Tuyên Quang đến Phú Quốc Các lồi họ Elaeocarpaceae phần lớn lồi có hoa lưỡng tính khác gốc chúng mọc thành cụm [1,2] 1.2 Những nghiên cứu trƣớc Cơm (Elaeocarpus griffithii) Cho đến nay, chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học cơng bố lồi thực vật Các nghiên cứu loài khác thuộc chi cho thấy thành phần hóa học hợp chất chi Elaeocarpus đa dạng Nổi bật thành phần hóa học lồi chi hợp chất alkaloid Các chất phân lập từ loài Elaeocarpus grandislà rudrakine (1), grandisines A (2), Isoelaeocarpiline (3), grandisines C, D, E, F, and G (4-8)cho thấy khả liên kết mạnh với quan thụcảm δ-opioid người với giá trị IC50 nằm khoảng 9,9 - 75,4µg/ml Các nhà khoa học chứng minh quan thụ cảm δ-opioid có liên quan chặt chẽ tới triệu chứng đau kinh niên [6,23] Hình Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 27: Phổ 1H-NMR chất F3 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 28: Phổ 1Hex-NMR chất F3 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 29: Phổ 13C-NMR chất F3 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 30: Phổ 13Cex-NMR chất F3 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 31: Phổ DEPT chất F3 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 32: Phổ MS chất F3 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 33: Phổ 1H- NMR chất F4 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 34: Phổ 1Hex- NMR chất F4 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 35: Phổ 13C-NMR chất F4 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 36: Phổ 13Cex-NMR chất F4 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 37: Phổ DEPT chất F4 Luận văn Thạc sĩ 2013 Phụ lục 38 : Phổ MS chất F4 Luận văn Thạc sĩ 2013 Luận văn Thạc sĩ 2013 Luận văn Thạc sĩ 2013 ... muốn đóng góp vào việc nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học thảo dược dân tộc, tiến hành đề tài : ? ?Nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào Côm (Elaeocarpus griffithi). .. chuyển dịch hóa học C ; δHm Độ chuyển dịch hóa học H multiplet Luận văn Thạc sĩ 2013 3.2 Kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập đƣợc từ dịch EtOAc Các tế bào ung thư tế bào biệt hóa phân... nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học cơng bố lồi thực vật Các nghiên cứu loài khác thuộc chi cho thấy thành phần hóa học hợp chất chi Elaeocarpus đa dạng Nổi bật thành phần hóa học lồi