Nghiên cứu biểu hiện protein p53 tái tổ hợp ở nấm men pichia pastoris x33

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- TRẦN THỊ THÚY NGA NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN Pichia pastoris X33 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -- TRẦN THỊ THÚY NGA NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN Pichia pastoris X33 Chuyên ngành Di truyền học Mã số 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐINH NHO THÁI Hà Nội - 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Đinh Nho Thái, thầy trực tiếp giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tận tình cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu để hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy, cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt thầy, cô Bộ môn Di truyền học truyền đạt cho tri thức quý báu thời gian học tập nghiên cứu Trường Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Đỗ Thị Tuyên, Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ thí nghiệm biến nạp gen vào nấm men Tôi xin gửi lời cảm ơn học viên cao học em sinh viên Bộ môn Di truyền học cán bộ em sinh viên Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme Protein nhiệt tình hỗ trợ tơi nhiều thời gian làm việc phịng thí nghiệm Lời cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè nhiệt tình đợng viên, chia sẻ kinh nghiệm ủng hợ tơi hồn thành tốt đề tài nghiên cứu Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2017 Học viên Trần Thị Thúy Nga MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan ung thư đại 1.1.1 Ung thư và tình hình ung thư giới 1.1.2 Các đường hình thành ung thư 1.1.3 Nghiên cứu điều trị ung thư 10 1.2 P53 nghiên cứu biểu p53 ứng dụng điều trị ung thư 12 1.2.1 Tổng quát TP53 và protein tương ứng 12 1.2.2 Trình tự nhận biết đặc hiệu p53 gen mục tiêu 15 1.2.3 Những nghiên cứu biểu protien p53 tái tổ hợp 17 1.3 Hệ thống nấm men Pichia pastoris biểu protein ngo ại lai 19 1.3.1 Đặc điểm hệ thống biểu P pastoris 19 1.3.2 Vector pPICZα biểu protein P pastoris 20 1.3.3 Quá trình chuyển gen vào nấm men P pastoris 21 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu hóa chất 23 2.1.1 Vật liệu 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Các đoạn oligonucleotide 23 2.1.4 Thiết bị dùng nghiên cứu 24 2.1.5 Các môi trường nuôi cấy 25 2.1.6 Các dung dịch và đệm 25 2.2 Phương pháp nghiên c ứu 26 2.2.1 Tách chiết vector biểu từ chủng E coli DH5α 26 2.2.2 Xử lý vector biểu enzyme giới hạn 27 2.2.3 Điện di DNA gel agarose 28 2.2.4 Tinh DNA gel agarose 29 2.2.5 Biến nạp DNA vào tế bào nấm men phương pháp xung điện 29 2.2.6 Tách chiết DNA tổng số nấm men 30 2.2.7 Sàng lọc thể biến nạp kĩ thuật PCR 31 2.2.8 Nghiên cứu điều kiện nhằm biểu p53 tái tổ hợp tốt 32 2.2.9 Điện di protein gel polyacrylamide (SDS – PAGE) 33 2.2.10 Phương pháp EMSA 34 2.2.11 Tinh protein phương pháp sắc ký 36 2.2.12 Định lượng protein phương pháp Bradford 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 Tạo chủng nấm men P pastoris X33 mang cấu trúc pPICZαA-TAT-p53-His 38 3.1.1 Tách chiết plasmid tái tổ hợp từ chủng E coli DH5α và xử lý với SacI 38 3.1.2 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào P pastoris sàng lọc thể biến nạp 40 3.2 Tối ưu quy trình biểu p53 tái tổ hợp nấm men P pastoris X33 44 3.2.1 Lựa chọn dòng biểu p53 tái tổ hợp 44 3.2.2 Tối ưu môi trường biểu p53 tái tổ hợp 46 3.2.3 Tối ưu nồng độ methanol cảm ứng biểu 48 3.3 Tinh và định lượng protein p53 tái tổ hợp thu 49 3.3.1 Tinh protein p53 tái tổ hợp 49 3.3.2 Định lượng protein p53 phương pháp Bradford 50 3.4 Xác định protein p53 tái tổ hợp phương pháp EMSA 53 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 62 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc gen TP53 và protein tương ứng 12 Hình 1.2 Cấu trúc phân tử protein p53 14 Hình 1.3 Vector biểu pPICZα 21 Hình 1.4 Tích hợp gen ngoại lai vào vị trí 5’AOX1 hệ gen P pastoris 22 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR chọn lọc thể tái tổ hợp….……………………38 Hình 3.2 Kết xử lý plasmid tái tổ hợp với enzyme SacI 39 Hình 3.3 Kết biến nạp DNA tái tổ hợp vào P pastoris X33 40 Hình 3.4 Kết điện di DNA tổng số nấm men 41 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi EcoRI-Fw/XhoI-Rv 42 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi AOX1-Fw/AOX1-Rv 43 Hình 3.7 Kết sinh trưởng dòng biểu sau 72 44 Hình 3.8 Kết điện di protein tổng số từ dòng biến nạp 45 Hình 3.9 Kết sinh trưởng chủng X33-36 môi trường biểu 46 Hình 3.10 Kết điện di protein tổng số từ môi trường biểu 47 Hình 3.11 Kết sinh trưởng chủng X33-36 nồng độ methanol 48 Hình 3.12 Kết điện di protein từ dịch nuôi cảm ứng với nồng độ methanol 49 Hình 3.13 Kết điện di khơng biến tính protein p53 tái tổ hợp 54 Hình 3.14 Kết điện di sản phẩm tinh p53 tái tổ hợp từ dịch ngoại bào 50 Hình 3.15 Đường chuẩn Bradford 51 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự đoạn oligonucleotide 24 Bảng 2.2 Thành phần loại môi trường nuôi cấy 25 Bảng 2.3 Thành phần loại dung dịch và đệm 26 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn 28 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 2.6 Thành phần gel polyacrylamide 12% 33 Bảng 2.7 Thành phần gel polyacrylamide cho thí nghiệm EMSA 35 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng EMSA 35 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng Bradford 37 Bảng 3.1 Kết đo nồng độ DNA tổng số tách 41 Bảng 3.2 Kết đo OD595 nm dựng đường chuẩn 51 Bảng 3.3 Kết Bradford trình tinh 52 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Bp Base pair BMMY Buffered Methanol complex medium DNA Deoxy ribonucleotide acid dNTPs Deoxy ribonucleotide triphosphates E coli Escherichia coli EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay EtBr Ethidium bromide IARC International Agency for Research on Cancer Kb Kilo base LB Luria Bertani MM Minimal medium MutS Methanol utilization slow Mut+ Methanol utilization plus NLS Nuclear Localization Signals NES Nuclear Export Signals NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction p53DBD DNA-binding domain of p53 P pastoris Pichia pastoris REs Response Elements TAE Tris base-Acetic-EDTA TBE Tris base-Axit Boric-EDTA WHO World Health Organization YP Yeast extract-Peptone medium YPM Yeast extract-Peptone-Methanol medium YPDM Yeast extract-Peptone-Dextrose-Methanol medium TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ MỞ ĐẦU Trải qua vài thập kỉ tới nay, ung thư trở thành một dạng bệnh lý phổ biến một nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tử vong cao người Theo ước tính thống kê Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm giới có khoảng 9-10 triệu người mắc bệnh ung thư với tỉ lệ tử vong lên đến 50% Cũng theo WHO, Việt Nam xếp vị trí 78/172 quốc gia vùng lãnh thổ khảo sát ung thư với tỉ lệ tử vong lên đến 110/100.000 người Qua năm, số người mắc ung thư Việt Nam có xu hướng ngày mợt gia tăng Trong đó, điều kiện đời sống thấp, việc phát và điều trị ung thư thường xảy ṃn khối u hình thành di Các phương pháp điều trị truyền thống khơng thể loại bỏ hồn tồn tế bào ung thư khỏi thể, sức khỏe bệnh nhân cải thiện chi phí điều trị lại cao Trước tình hình đó, nhiều nhà khoa học và hướng đến nghiên cứu protein đích – loại protein có tác đợng tiêu diệt đặc hiệu tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào bình thường thể Mợt protein đích lựa chọn để nghiên cứu protein p53 với chức quan trọng thể người như: kiểm sốt chu trình tế bào, sửa chữa DNA kích hoạt chương trình apoptosis Protein p53 tái tổ hợp nhiều nghiên cứu chứng minh có hoạt tính sinh học đáp ứng hiệu với tế bào ung thư điều kiện in vitro Trong tự nhiên, p53 giữ vai trị mợt nhân tố phiên mã có nhiều biến đổi sau dịch mã phức tạp trình phosphoryl hóa, acetyl hóa, ubiquitin hóa Vì vậy, hệ thống nấm men Pichia pastoris lựa chọn để biểu protein p53 tái tổ hợp với nhiều ưu điểm bật như: sinh vật nhân thực có nhiều q trình biến đổi sau dịch mã hồn chỉnh, dễ nuôi cấy, rẻ tiền thuận tiện việc tinh protein dạng tiết với khối lượng lớn NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ Với lý trên, đề xuất thực đề tài: “Nghiên cứu biểu protein p53 tái tổ hợp nấm men Pichia pastoris X33” nhằm sản xuất protein p53 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học để nghiên cứu tác động p53 ngoại lai với tế bào ung thư điều kiện in vitro in vivo, đồng thời tạo nguyên liệu cho nghiên cứu liệu pháp điều trị ung thư sau này Đề tài nghiên cứu này thực với nội dung sau:  Tạo chủng Pichia pastoris X33 chứa cấu trúc TAT-p53-His dung hợp vào hệ gen chúng  Nghiên cứu điều kiện biểu tốt protein p53 tái tổ hợp chủng nấm men Pichia pastoris X33  Tinh và định lượng protein p53 tái tổ hợp từ dịch nuôi nấm men Pichia pastoris X33  Kiểm tra hoạt tính protein p53 tái tổ hợp phương pháp EMSA NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ cột tinh Độ TAT-p53-His kiểm tra gel polyacrylamide 12%, nhuộm CBB quan sát mắt thường Hình 3.13 Kết điện di sản phẩm tinh p53 tái tổ hợp từ dịch ngoại bào Chú thích: Giếng M: marker, giếng DC: dịch lên cột, giếng FT: dịch trôi qua cột, giếng W: dịch rửa cột, giếng E5-8: phân đoạn thu đẩy protein khỏi cột Kết điện di SDS-PAGE (Hình 3.13) cho thấy phân đoạn protein gắn cột Niken-Sepharose rửa chiết đệm có chứa imidazol 200 mM có băng 47 kDa protein p53 tái tổ hợp Tuy vậy, hiệu suất gắn cợt chưa cao (có băng 47 kDa p53 tái tổ hợp phân đoạn FT qua cột Niken-Sepharose) dẫn đến hiệu suất thu hồi p53 bị hao hụt Để đánh giá mức độ thu hồi protein, tiếp tục tiến hành định lượng protein thu phương pháp Bradford Kết Bradford giúp thẩm định khả biểu protein p53 tái tổ hợp so sánh hiệu suất với nhóm nghiên cứu trước 3.3.2 Định lượng protein p53 phương pháp Bradford Để xác định hiệu suất tinh qua cột Niken-Sapharose, hàm lượng protein dịch mẫu theo bước tinh xác định theo phương pháp Bradford (Mục 2.2.12) Kết đo mức hấp thụ ánh sáng OD595 nm (Bảng 3.2) ghi nhận sau 40 NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 50 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ phút ủ nhiệt đợ phịng sử dụng để xây dựng đường chuẩn Bradford Chỉ số tin cậy R2 đạt 0,9893 cho thấy đường chuẩn xây dựng đạt độ tin cậy cao Bảng 3.2 Kết đo OD 595 nm dựng đường chuẩn mBSA (µg) 10 20 30 40 50 OD595 nm 0.33 0.455 0.617 0.825 0.944 1.077 Đường chuẩn Bradford xây dựng có phương trình là y = 0.0165x + 0.2806 1.2 y = 0.0165x + 0.2806 R² = 0.9893 OD595 0.8 0.6 0.4 0.2 0 10 20 30 40 50 60 mBSA (µg) Hình 3.14 Đường chuẩn Bradford Dựa vào phương trình đường chuẩn (Hình 3.14), chúng tơi xác định nồng đợ mẫu cần định lượng (X) công thức sau: X (mg/ml) = (𝑦 −0,2806) 0,0165.𝑉 Trong đó, y là giá trị OD595 nm đo mẫu, V (µl) thể tích mẫu sử dụng phản ứng Bradford NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 51 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ Với ml dịch cô đưa lên cột, thu lại ml dịch tinh chứa protein p53 tái tổ hợp sử dụng để làm mẫu đo phản ứng định lượng Bradford Kết đo OD600 nm nồng đợ protein tương ứng trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Kết Bradford trình tinh Dịch cô Dịch trôi cột FT TAT-p53-His Hiệu suất (%) 50 150 50 - OD 595 nm 0,758 0,763 0,545 - Nồng độ (mg/ml) 0,578 0,195 0,321 56 V (µl) Lượng protein tổng số 3ml dịch là: mprotein tổng số = 0,587 x = 1,734 (mg) Lượng protein p53 tái tổ hợp thu 3ml dịch tinh là: mp53 = 0,321 x = 0,963 (mg) Hiệu suất tinh là: H = mp53 : mprotein tổng số = 0,963 : 1,734 = 0,56 Với 40ml dịch cô, lượng protein tổng số là: mprotein tổng số = 40 x 0,578 = 23,12 (mg) Với hiệu suất H= 0,56, tổng lượng p53 tái tổ hợp thu từ 40ml dịch cô là: mp53 = 23,12 x 0,56 = 12,95 (mg) Do vậy, với 200ml môi trường nuôi biểu (tương đương với 40ml dịch cô) nồng đợ p53 tái tổ hợp thu hồi 12,95 mg, tương đương với nồng độ protein p53 tái tổ hợp thu hồi 0,0647 mg/ml Khi so sánh kết với nhóm tác giả NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 52 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ Haowei Yan (2012) [25], nhận thấy khả biểu protein p53 tái tổ hợp sau cải biến tốt so với nhóm nghiên cứu trước (nhóm Haowei Yan thu khoảng 104 mg TAT-p53 2L môi trường nuôi cấy, tương đương với nồng độ 0,052mg/ml) Và đồng thời, điều cho thấy mức đợ biểu prorein hịa tan tương đối cao so với mức độ biểu sinh vật bậc thấp (khoảng 0,008mg/ml) báo cáo trước hệ thống biểu prokaryote (Jiang cộng sự, 2008) 3.4 Xác định protein p53 tái tổ hợp phương pháp EMSA Chúng tiến hành nhân hai đoạn DNA nằm promoter gen mdm2 phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Mục 2.2.10) đoạn DNA thứ (p53RE) có kích thước 187 bp có mang trình tự gắn đặc hiệu p53 (Phụ lục) đoạn DNA thứ hai (DCmdm2) có kích thước 200 bp khơng mang trình tự gắn đặc hiệu p53 Chúng tơi tạo phản ứng bám cho protein p53 tái tổ hợp với trình tự bám đặc hiệu promoter gen mdm2 điều kiện in vitro Theo nguyên tắc, phức hợp protein/DNA tạo thành, DNA có trọng lượng nặng Do đó, chạy điện trường, băng DNA có gắn protein chậm so với băng DNA tự khơng cịn giữ chuẩn kích thước so sánh với thang chuẩn marker Từ kết điện di thể hình 3.15, nhận thấy phức hợp p53/p53RE tạo thành, băng giếng (Hình 3.15) chậm so với giếng đối chứng có chứa đoạn DNA p53RE dạng tự (Giếng 1, Hình 3.15) Do khơng có phản ứng bám Taq p53RE nên băng DNA giếng (Hình 3.15) chuẩn kích thước với băng DNA giếng đối chứng (Giếng 1, Hình 3.15) Để chứng minh bám p53 tái tổ hợp DNA mục tiêu là đặc hiệu, thực thêm phản ứng tương tác p53 tái tổ hợp với đoạn DCmdm2 (đối chứng mdm2) nằm promoter mdm2 không chứa trình tự bám p53 Kết giếng (Hình 3.15) cho hai băng DNA và có kích thước 200 bp, tương ứng với kích thước lý thuyết DCmdm2 Như vậy, p53 tái tổ hợp có hoạt tính bám đặc hiệu vào trình tự đích NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 53 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ protein dạng tự nhiên Kết này tương tự kết nghiên cứu nhóm Arie Zauberman cợng thực năm 1995 [6] với p53 dạng tự nhiên dạng đột biến Với kết đạt kết luận protein p53 tái tổ hợp chúng tơi tổng hợp có hoạt tính sinh học, gắn với DNA mợt nhân tố phiên mã – một chức quan trọng thiết yếu để ứng dụng p53 tái tổ hợp cho nghiên cứu Hình 3.15 Kết điện di khơng biến tính protein p53 tái tổ hợp Chú thích: Giếng M: marker DNA 100 bp, giếng 1: RE, giếng 2: p53 + p53RE, giếng 3: Taq + p53RE, giếng 4: DCmdm2, giếng 5: p53 + DCmdm2 NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 54 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ KẾT LUẬN Đã tách chiết thành công vector biểu pPICZαA/TAT-p53-His với khối lượng lớn từ chủng vi khuẩn E coli DH5α với độ tinh cao đạt yêu cầu cho phản ứng biến nạp vào chủng nấm men P pastoris X33 Cấu trúc biểu pPICZαA/TAT-p53-His dung hợp vào DNA hệ gen P pastoris X33 kiểm tra kĩ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Đã lựa chọn chủng X33-36 chủng biến nạp biểu p53 tái tổ hợp Môi trường tối ưu để biểu protein p53 tái tổ hợp là môi trường BMMY, pH 6,0 với nồng độ cảm ứng methanol 0,5% P53 tái tổ hợp xác định xác phương pháp điện di khơng biến tính gel polyacrylamide 10% Phản ứng bám đặc hiệu p53 tái tổ hợp trình tự bám tương ứng promoter gen mdm2 tạo thành phức hợp protein/DNA dẫn đến phức hợp bị kéo chậm băng DNA tự chạy điện trường Quá trình tinh protein p53 tái tổ hợp thực phương pháp sắc kí lực sử dụng cột Niken-Sepharose Nồng độ protein p53 tái tổ hợp thu sau tinh 0,0647mg/ml với hiệu suất thu hồi đạt 56% KIẾN NGHỊ  Nghiên cứu xác định hoạt tính sinh học ảnh hưởng protein p53 tái tổ hợp phát triển tế bào bình thường tế bào ung thư điều kiện in vitro  Thử nghiệm và đánh giá ảnh hưởng protein p53 tái tổ hợp mơ hình đợng vật phịng thí nghiệm NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 55 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Anh Abdelmoula-Souissi S., Mabrouk I., Gargouri A and Mokdad-Gargouri R (2011), “Expression of the human tumor suppressor p53 induces cell death in Pichia pastoris”, FEMS Yeast Res, 12(1), pp 2-8 Abdelmoula-Souissi S., Zouari N., Miladi-Abdenadher I., Yaich-Kolsi O., AyadiMasmoudi I., Khabir A., Masmoudi H., Frikha M and Mokdad-Gargouri R (2012), “Secreted recombinant P53 protein from Pichia pastoris is a useful antigen for detection of serum p53: autoantibody in patients with advanced colorectal adenocarcinoma”, Mol Biol Rep, 40(5), pp 3865-72 Almazov V P., Kochetkov D V and Chumakov P M (2009), “Use of p53 for Therapy of Human Cancer”, Molekuliarnaia Biologiia (Mosk), pp 5-6 Andreas C J., Fersht A R (2010), “The Tumor Suppressor p53: From Structures to Drug Discovery”, Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(6), pp 1-3 Aramayo R., Sherman M B., Brownless K., Lurz R., Okorokov A L and Orlova E V (2011), “Quaternary structure of the specific p53-DNA complex reveals the mechanism of p53 mutant dominance”, Nucleic Acids Res., 39(20), pp 8960-71 Arie Z., Deborah F., Ygal H., Yaacov B and Moshe O (1995), “A functional p53 responsive intronic promoter is contained within the human mdm2 gene”, Nucleic Acids Research, 23(14), pp 2584-2592 Arie Z., Yaacov B., Naomi R., Naomi L and Moshe O (1993), “Sequence-specific DNA binding by p53: identification of target sites and lack of binding to p53/MDM2 complexes”, The EMBO Journal, 12(7), pp 2799-2808 Balamurugan V., Reddy G R and Suryanarayana V V S (2007), “Pichia pastoris: A notable heterologous expression system for the production of foreign proteins-Vaccines”, Indian Journal of Biotechnology, 6, pp 175-186 NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 56 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ Bei W., Ziwei X and Ee-Chee R (2009), “Redefining the p53 response element”, PNAS, 106(34), pp 14373–14378 10 Bei W., Ziwei X., Hui L K and Ee-Chee R (2010), “The p53 response element and transcriptional repression”, Cell Cycle, 9(5), pp 870-879 11 Bell S., Klein C., Mulle L., Hansen S and Buchner J (2002), “p53 contains large unstructured regions in its native state”, J Mol Biol, 322, pp 917-927 12 Bretthauer R K., Castellino F J (1999), “Glycosylation of Pichia pastoris derived proteins”, Biotechnol Appl Biochem., 30, pp 193-200 13 Cereghino G P., Cereghino J L., Ilgen C and Cregg J M (2002), “Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris”, Curr Opin Biotechnol., 13, pp 329-332 14 Cereghino J L., Cregg J M (2000), “Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol Rev., 24, pp 45-66 15 Collot-Teixeira S., Bass J., Denis F and Ranger-Rogez S (2004), “Human tumor suppressor p53 and DNA viruses”, Rev Med Virol., 14, pp 301-319 16 David P L., Chit F C and Sonia L (2010), “p53-based Cancer Therapy”, Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(9), pp a001222 17 Dimitriadi M., Poulogiannis G., Liu L., Backlund L M., Pearson D M., Ichimura K and Collins V P (2008), “p53-independent mechanisms regulate the P2-MDM2 promoter in adult astrocytic tumours”, British Journal of Cancer, 99, pp 1144 -1152 18 Ferlay J., Soerjomataram I., Ervik M., Dikshit R., Eser S., Rebelo M., Parkin D M., Forman D., Bray F and Mathers C (2013), “Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer”, 11 19 Fred Burz (2008), Principles of cancer genetics, Springer 20 GBD 2015 Risk Factors Collaborators (2016), “Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational, NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 57 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ and metabolic risks or clusters of risks, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015”, Lancet, 388 (10053), pp 1659-1724 21 Ge T., Sun Z J., Fu S H and Liang G D (2005), “Cloning of thrombolytic enzyme (lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 42, pp 20–28 22 Geoffrey M C (2013), The Cell A Molecular Approach 6th Edition, Boston University 23 Goh A M., Coffill C R and Lane D P (2011), “The role of mutant p53 in human cancer”, J Pathol., 223(2), pp 116-26 24 Hainaut P (2013), “TP53 somatic mutations: prognostic and predictive value in human cancers p53 in the Clinics”, Springer 25 Haowei Y., Liu N., Zhao Z., Zhang X., Hao X., Shao B and Yan W (2012), “Expression and purification of human TAT-p53 fusion protein in Pichia pastoris and its influence on HepG2 cell apoptosis”, Biotechnol Lett., 34(7), pp 1217-1233 26 IARC (2012), “Section of Cancer Surveillance”, Globacan 27 IARC (2017), “World cancer report 2014” 28 Ilyas M., Straub J., Tomlinson I P M and Bodmer W F (1999), “Gentic pathways in colorectal and other cancers”, European Journal of Cancer, pp 335–351 29 Isobe M., Emanuel B S., Givol D., Oren M and Croce C M (1986), “Localization of gene for human p53 tumour antigen to band 17p13”, Nature, 320(6057), pp 84-85 30 Itai B., Karin R., Michael L., Lihi S and Tali E H (2010), “Sequence-dependent cooperative binding of p53 to DNA targets and its relationship to the structural properties of the DNA targets”, Nucleic Acids Research, 39(5), pp 1919–1932 31 Jiang L., Ma Y., Wang J., Tao X and Wei D., (2008), “The transduction of HisTAT-p53 fusion protein into the human osteogenic sarcoma cell line (Saos-2) and its influence on cell cycle arrest and apoptosis”, Mol Biol Rep., 35(1), pp 1-8 NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 58 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ 32 Jie L., Wei X., Xueting S., Xingliang Q., Ying C., Shaohua L., Jie D., Hongmei D., Hui L., Aixue H., Xingfeng G., Lvbin H., Chaonan W., Leqiao S., Chenjun B., Xuelian S., Tao F., Yuanlin L., Yi Z., Hongru Z., Hongwen Z and Ningsheng S (2015), “Species-specifc mutual regulation of p53 and miR-138 between human, rat and mouse”, Scientific reports, 6(26187) 33 Joana D A., Joana M X., Clifford J S and Cecilia M R (2010), “The Role of p53 in Apoptosis”, Discov Med, 9(45), pp 145-152 34 Le Tran Ngoan (2007), “Cancer Mortality Pattern in Viet Nam”, Asian Pac J Cancer Prev, 8, pp 535-538 35 Leader B., Baca Q J and Golan D E (2008), “Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification”, Nat Rev Drug Discov., 7(1), pp 21-39 36 Levine A J and Oren M (2009), “The first 30 years of p53: growing ever more complex”, Nature Reviews Cancer, 9, pp 749-758 37 Ling B and Wei-Guo Z (2006), “p53: Structure, Function and Therapeutic Applications”, Journal of Cancer Molecules, 2(4), pp.141-153 38 Masha V P., Chen K., Oleg L., Rachel B., Maria L., Jinwoo A., In-Ja L B., Ronen G., Melissa M., Andrew Z., Lewis M B., Assaf F and Carol P (2010), “The C terminus of p53 binds the N-terminal domain of MDM2”, Nature structural and molecular biology, 17(8), pp 982-989 39 May P., May E (1999), “Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein”, Oncogene, 18, pp 7621-7636 40 Olivier M (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol, 2, pp a001008 41 Petitjean A (2007), Hum Mutat, 28, pp 622–629 42 Pingzuo L., Anukanth A., Xiu-Gong G., Kuppusamy I., Vincent V S., Nejat D and Renugopalakrishnan V (2007), “Expression of Recombinant Proteins in Pichia Pastoris”, Appl Biochem Biotechnol, 142, pp 105–124 NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 59 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ 43 Plummer M., deMartel C., Vignat J., Ferlay J., Bray F and Franceschi S (2016) “Global burden of cancers attributable to infections in 2012: a synthetic analysis”, Lancet Glob Health, 4(9), pp 609-616 44 Ryu J., Lee H J., Kim K A., Lee J Y., Lee K S., Park J and Choi S Y (2004), “Intracellular Delivery of p53 Fused to the Basic Domain of HIV-1 Tat”, Mol Cells, 17(2), pp 353-359 45 Sanjay D S., Hong X., Scott W and Divaker C (2001), “The Gene Encoding p202, an Interferon-inducible Negative Regulator of the p53 Tumor Suppressor, Is a Target of p53-mediated Transcriptional Repression”, The Journal of Biological Chemistry, 276(1), pp 298–305 46 Shinsuke K.,Yuki I., Aiko K., Amador A., Takehiro Y., Shiro N and Molly K M (2001), “Binding to the naturally occurring double p53 binding site of the Mdm2 promoter alleviates the requirement for p53 C-terminal activation”, Nucleic Acids Research, 29(9), pp 1989-1993 47 Souhami R., Tobias J (2005), Cancer and its management, 5, pp 9-12 48 Stefan S (2000), Basic Techniques in Molecular Biology, pp 1-421 49 Stewart B W., Wild C P (2014), “Lyon: International Agency for Research on Cancer”, World cancer report 50 Sue M P., Mariana L F., Brian M and Linda M H (2005), “Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system”, Yeast, 22, pp 249–270 51 Walter D F., Daniel T P., Richard H K., Woodring E W and Jerry W S (1992), “A Transcriptionally Active DNA-Binding Site for Human p53 Protein Complexes”, Molecular and cellular biology, 12(6), pp 2866-2871 52 Yan H., Xiao-Lin M., Jin-Ping X., Wei L and Jian W (2005), “Cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme PM246 in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 43, pp 18–25 NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 60 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ 53 Yu W., Yuangang L., Laura L., Zoe M and Molly K M (1994), “Wild-type alternatively spliced p53: binding to DNA and interaction with the major p53 protein in vitro and in cells”, The EMBO Journal, 13(20), pp 4823-4830 54 Yun W., John F S., Dorothy P., Kristine M and Peter T (1995), “Interaction of p53 with Its Consensus DNA-Binding Site”, Molecular and Cellular Biology, 15(4), pp 2157–2165 55 Zhaorong W., Yueju W., Gangqiang L., Xiaokun L and Dehu L (2008), “Optimized gene synthesis, expression and purification of active salivary plasminogen activator a2 (DSPAa2) of Desmodus rotundus in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 57, pp 27–33 56 http://www.snapgene.com 57 http://www.thermoscientific.com/en 58 https://www.cancer.org 59 https://www.gelifesciences.com 60 https://p53.iarc.fr NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 61 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ PHỤ LỤC PL Trình tự gen TAT-p53-His sau cải biến > TAT-p53-His GAATTCTACGGTCGTAAGAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTATGGAAGAACCCCAGT CCGATCCTTCTGTGGAGCCACCTTTGTCCCAAGAAACCTTCTCTGACCTTTGGAAG TTATTGCCAGAGAATAATGTGTTGTCCCCATTGCCTTCCCAGGCTATGGATGACTT AATGTTATCTCCTGACGACATCGAACAGTGGTTCACTGAGGACCCAGGACCTGAT GAAGCCCCAAGGATGCCTGAGGCCGCTCCACGTGTCGCCCCAGCTCCTGCTGCCC CAACCCCTGCTGCCCCAGCTCCAGCCCCATCTTGGCCATTGTCTTCCTCTGTCCCAT CCCAAAAAACTTACCAAGGATCTTACGGTTTTCGTTTAGGATTCCTTCACTCCGGT ACCGCCAAATCCGTCACTTGTACCTACTCCCCTGCCTTAAATAAGATGTTTTGCCA ATTGGCTAAGACCTGTCCTGTCCAGTTGTGGGTTGACTCCACCCCACCTCCAGGAA CTAGAGTCAGAGCTATGGCTATCTACAAACAATCCCAACACATGACTGAAGTTGT CAGAAGATGCCCACATCATGAGAGATGCTCTGACTCCGATGGATTGGCCCCACCT CAGCACTTAATTCGTGTTGAAGGTAATTTGCGTGTTGAATACTTGGATGATAGAAA TACCTTTCGTCATTCCGTGGTCGTTCCATATGAACCTCCTGAAGTTGGATCTGATT GTACTACCATTCACTATAACTATATGTGTAACTCCTCTTGTATGGGAGGTATGAAT AGACGTCCTATTTTGACCATCATTACTTTAGAAGATTCCTCTGGTAACTTATTGGG TCGTAATTCCTTTGAAGTCCATGTTTGCGCTTGTCCAGGTCGTGATCGTAGAACTG AGGAAGAAAATTTGAGGAAGAAAGGTGAACCTCACCATGAATTACCACCAGGAT CCACCAAAAGAGCTTTATCTAACAACACCTCTTCCTCACCACAGCCAAAGAAGAA ACCACTTGACGGTGAGTATTTCACTCTTCAAATTAGAGGTCGTGAAAGATTCGAG ATGTTTAGAGAGTTGAACGAGGCTCTTGAATTAAAAGACGCCCAAGCTGGTAAAG AACCAGGAGGCTCCAGGGCTCACTCATCTCATTTGAAGTCCAAAAAGGGACAGTC CACTTCAAGACACAAAAAGTTAATGTTCAAGACCGAAGGTCCAGATTCAGATCAT CATCATCATCATCATTGATTTCTAGA NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 62 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ PL Kết kiểm tra số phù hợp CAI Hình PL Kết kiểm tra số CAI trước cải biến trình tự p53 Hình PL Kết kiểm tra số CAI sau cải biến trình tự p53 NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 63 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ PL Cấu trúc promoter gen mdm2 Hình PL Cấu trúc promoter gen mdm2 [6] PL Vị trí bám p53 promoter mdm2 Hình PL Vị trí hai trình tự bám đặc hiệu p53 promoter mdm2 [6] Hình PL Hai motif bám p53 promoter mdm2 [6] NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 64 ... kiện biểu tốt protein p53 tái tổ hợp chủng nấm men Pichia pastoris X33  Tinh và định lượng protein p53 tái tổ hợp từ dịch nuôi nấm men Pichia pastoris X33  Kiểm tra hoạt tính protein p53 tái tổ. .. nguy hiểm cần nghiên cứu nhiều [35, 47] NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 11 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ 1.2 P53 nghiên cứu biểu p53 ứng dụng điều... nạp có khả biểu lượng protein tái tổ hợp cao (Mục 2.2.8) NGHIÊN CỨU BIỂN HIỆN PROTEIN P53 TÁI TỔ HỢP Ở NẤM MEN PICHIA PASTORIS X33 31 TRẦN THỊ THÚY NGA – LUẬN VĂN THẠC SĨ 2.2.8 Nghiên cứu điều