Trình bày quá trình biểu hiện protein- enzyme tái tổ hợp ở nấm,tế bào côn trùng, tế bào động vật có vú, động vật, thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC    TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME Đề tài: Trình bày quá trình biểu hiện protein- enzyme tái tổ hợp ở nấm, tế bào côn trùng, tế bào động vật có vú, động vật, thực vật Giáo viên hướng dẫn: TS. Đặng Xuân Nghiêm Sinh viên thực hiện : Trương Thị Thủy Lớp : CNSH55A MSV : 550404 A. Đặt vấn đề Mặc dù các tế bào vi khuẩn biểu hiện thành công rất nhiều protein từ tế bào nhân chuẩn, vẫn có những trường hợp protein tái tổ hợp được biểu hiện tốt nhất ở các tế bào nhân chuẩn. Một số protein nhân chuẩn không bền hay bất hoạt sau khi được biểu hiện ở vi khuẩn. Điều này đặc biệt đúng với những protein cần sự biến đổi sau dịch mã (posttranslational modification). Có nhiều loại biến đổi sau dịch mã ở nhân chuẩn xảy ra sau khi chuỗi polypeptide đã được tạo ra. Chúng bao gồm: (a) Biến đổi hóa học tạo thành amino acid mới trong chuỗi polypeptide. (b) Hình thành cầu nối disulfide giữa hai gốc cysteine đúng (ví dụinsulin). (c) Đường hóa (glycosylation), là quá trình thêm gốc đường vào các vịtrí nhất định trên phân tử protein. Rất nhiều protein trên bề mặt tế bào được đường hóa và sẽ không lắp ráp chính xác lên màng hay hoạt động chức năng được nếu thiếu thành phần đường. (d) Gắn thêm nhiều loại nhóm chức khác nhau như các chuỗi acid béo, các nhóm acetyl, phosphate và sulfate. (e) Cắt tiền chất protein. Việc này có thểxảy ra ởvài bước như được minh họa bởi insulin. Việc cắt bỏnày có thểliên quan đến việc tiết, cuộn gấp đúng và/hoặc hoạt hóa protein. Các enzyme cần cho quá trình cải biến và xửlý thường vắng mặt trong tếbào vi khuẩn, nên cần phải biểu hiện chúng trong tếbào nhân chuẩn. Các enzyme xửlý sau dịch mã có liên quan thường hiện diện ởmột loạt sinh vật bậc cao; do đó rất ít trường hợp cần biểu hiện protein tái tổhợp ở đúng sinh vật đó. Ở đây chúng ta quan tâm đến việc sản xuất protein ở tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, người ta có thể biến đổi gene của toàn bộmột động vật hay thực vật để sản xuất protein tái tổhợp. Thuận lợi tiếp theo trong việc sử dụng hệ thống biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn loại bỏ được nguy cơ nhiễm tạp các protein vi khuẩn. Mặc dù được tinh sạch, các protein vi khuẩn tồn dư với lượng rất nhỏ sẽ gây độc hay sẽ kích hoạt hệ thống miễn dịch của sinh vật nhân chuẩn, gây sốt. Các vector con thoi (shuttle vector) được thiết kế đểdi chuyển gen qua lại giữa các nhóm sinh vật khác nhau. Bởi vì thao tác gene ở tế bào nhân chuẩn khó khăn hơn nên hầu hết các vector biểu hiện ở nhân chuẩn là vector con thoi Những vector như vậy cho phép việc cải biến gene diễn ra ởvi khuẩn, thường là E. coli, và cho phép chuyển vào các sinh vật khác đểbiểu hiện gene. Chúng ta sẽ xem xét tếbào nấm men, côn trùng và động vật có vú nhưlà những hệthống biểu hiện protein tái tổ hợp (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology- applying the genetic revolution. Academic Press) B. NỘI DUNG I. Nấm men I.1 Đặc điểm Nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng như một sinh vật nhân chuẩn mẫu trong nghiên cứu sinh học phân tử. Bộ gene của nấm men đã được giải trình tự và nhiều gene đã được nghiên cứu đặc điểm. Dưới góc độ công nghệ sinh học, vài yếu tố tạo thành ưu thế của nấm men trong việc biểu hiện một số protein nhân chuẩn tái tổ hợp. (a) Nấm men có thể nuôi dễ dàng cả ở quy mô nhỏ lẫn các nồi lên men sinh học lớn. (b) Sau nhiều ngàn năm sử dụng để lên men rượu bia và bánh mỳ, nấm men được công nhận là sinh vật an toàn với con người. Chúng có thể được dùng để biểu hiện các protein dùng trong y học mà không cần sự chấp thuận thêm của các nhà quản lý. (c) Nấm men tiết rất ít protein. Do vậy nếu biến đổi gene để nó có thể sản xuất một protein tái tổhợp tiết ra môi trường thì việc tinh sạch sẽ dễ dàng. (d) Nấm men có thể được chuyển gene vào dễ dàng nhờ nhiều phương pháp khác nhau sau khi đã phân hủy thành tế bào bằng enzyme hay các chất hóa học, hay tạo lỗ nhờ sung điện. (e) Nấm men có plasmid 2 micron tự nhiên để làm cơ sở cho việc thiết kế các vector biểu hiện. (f) Nhiều promoter của nấm men đã được nghiên cứu kỹ và có thể dùng để kiểm soát việc biểu hiện protein tái tổ hợp. (g) Mặc dù là sinh vật nhân chuẩn đơn bào nguyên thủy, nấm men vẫn thực hiện nhiều quá trình biến đổi protein sau dịch mã đặc trưng cho sinh vật nhân chuẩn, như thêm các gốc đường (quá trình glycosylation). Tuy nhiên nấm men chỉ đường hóa các protein tiết. Protein tái tổhợp có thểthiết kế để được tiết bởi nấm men (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press) II.2. Các hệ thống vector Có nhiều vector sử dụng cho nấm men đã được tạo ra và thương mại hóa. Các vector này đều sử dụng phương pháp chọn lọc khuyết dưỡng Chúng có thể được chia thành 3 loại chính: Các vector plasmid (YEp) được sửdụng nhiều nhất. Các vector dung nhập vào nhiễm sắc thể nấm men (Yip) Nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC). 1. YEp( yeast episomal plasmids ) Đặc điểm: - Dựa vào plasmid 2µm - Vị trí đa nhân dòng (MCS) - Promoter điều khiển quá trình phiên mã và dịch mã - Gốc tái bản trong E.coli và trong nấm men ori.E và ori.2µ plasmid - Gen chọn lọc kháng ampiciline - Gen mã hóa cho leuxin 2 (LEU2) - Trong gen đích cần cài vào vector ngoài đoạn DNA quan tâm còn có các trình tự như : + Có đoạn DNA mã hóa cho trình tự amino acid giúp protein sau khi tạo thành sẽ đi ra khỏi tế bào giải phóng ra môi trường → thuận lợi cho việc tinh sạch , trình tự sử dụng là gen nhân tố giao phối α + Đoạn DNA làm tăng độ bền của protein + Các trình tự amino acid được bổ sung nhằm tăng độ bền và tăng khả năng tinh sạch sẽ được cắt bỏ bởi các protease đặc hiệu 2. YIp (yeast integrating plasmid ) Do các plasmid có thể mất đi, đặc biệt trong các mẻ môi trường nuôi cấy lớn, nên ứng dụng vector dung nhập sẽ làm tăng sự ổn định của gene ngoại lai. Điều bất lợi là chỉ một bản sao của gene chuyển có mặt, trừ khi các cấu trúc lặp lại liên tiếp được sử dụng. Những trình tự lặp liên tiếp này lại không ổn định vì xảy ra trao đổi chéo (Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”- Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản năm 2007) hp://www.discoverbiotech.com/wiki/-/wiki/Main/Cloning+Vectors 3. YAc (yeast artificial chromosome ) - Sử dụng để nhân dòng những đoạn DNA có kích thước lớn - Có độ bền cao dùng để lập bản đồ vật lý của AND hệ gen người, phân tích các đơn vị phiên mã lớn, lập thư viện gen người - Nó giống NST bình thường vì có vùng khởi đầu sao chép(ARS) , trình tự tâm động của nấm men (CEN), Các telomere nằm ở cuối nhiễm sắc thể, bảo vệ DNA khỏi tác động của nuclease (TEL) - Ngoài ra còn có các gen đánh dấu chọn lọc và vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn (Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”- Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản năm 2007) hp://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/YAC.php Ứng dụng Protein hỗn hợp cho người bây giờ đã được sản xuất nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae. Chúng bao gồm insulin, yếu tố đông máu XIIIa, vài yếu tố sinh trưởng và protein virus (từ HIV, viêm gan B, C, v.v.) được sử dụng như là các vacine hay trong chuẩn đoán. Mặc dù nhiều protein tái tổhợp đã được biểu hiện thành công ở nấm men, năng suất của chúng thường thấp. (Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press) Các khó khăn bao gồm: (a) Sự thất thoát plasmid biểu hiện trong quá trình sinh trưởng trong các nồi lên men lớn. (b) Các protein được cho là sẽ được tiết thường bị giữ lại ở khoảng giữa màng và thành tế bào chứ không thoát ra ngoài môi trường. (c) Quá trình đường hóa protein thường quá đà và sản phẩm protein tái tổ hợp thường có quá nhiều gốc đường để có thể hoạt động đúng Vì sự biểu hiện trong S.cerevisiae có một số nhược điểm là : - sự biểu hiện thấp năng suất không đáng kể - sự gắn gốc đường không chính xác làm biến đổi chức năng và làm cho protein tái tổ hợp có tình kháng nguyên - protein tái tổ hợp thường bị giữ lại tại nhu chất do đó làm tăng thời gian và chi phí để tinh sạch - trong quá trình sinh trưởng S.cerevisiae sản sinh ra etanol là chất độc đối với tế bào → giảm lượng protein tiết ra vì vậy người ta tìm kiếm các hệ thống nấm men khác để khắc phục những nhược điểm của S.serevisiae và P.pastoris có những ưu điểm - có promoter hiểu quả cao - không tổng hợp etanol - tiết rất ít loại protein nên dễ tinh sạch có rất nhiều vector biểu hiện của P. pastoris đã được thiết kế cấu trúc của mối loại đều có những điểm chung như: - các plasmid cài nhập - có gen quan tâm chịu sự điều khiển của promoter - trình tự kết thúc phiên mã từ gen AOX1 của P.pastoris - gen đánh dấu chọn lọc trong nấm men (Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”- Bernard R.Glick & Jack J. Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản năm 2007) cấu tạo của vector biểu hiện trong P.pastoris hp://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3118338_1472-6750-11-47-6&req=4 II. BIỂU HIỆN PROTIEN Ở TẾ BÀO CÔN TRÙNG II.1 Đặc điểm Các tế bào động vật có vú khá mỏng manh và có các đòi hỏi dinh dưỡng phức tạp. Điều này làm cho việc nuôi cấy chúng khó khăn và đắt đỏ so với tế bào nấm men hay vi khuẩn. Tuy nhiên tế bào côn trùng khá khỏe và có thể được nuôi cấy trong các môi trường đơn giản hơn các tếbào động vật. Kết quả là, các hệ thống biểu hiện dựa vào côn trùng đã được phát triển. Những hệ thống này có thêm thuận lợi là có thể tiến hành các biến đổi sau dịch mã giống với các hệ thống ở tế bào động vật có vú. Các vector được sử dụng trong các tế bào vi khuẩn hầu hết đều có nguồn gốc từ một họ virus có tên là baculovirus, chỉxâm nhiễm côn trùng (và các động vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ PROTEIN - ENZYME

Đề tài : Trình bày quá trình biểu hiện protein- enzyme tái tổ hợp ở nấm,

tế bào côn trùng, tế bào động vật có vú, động vật, thực vật

Giáo viên hướng dẫn: TS Đặng Xuân Nghiêm

Sinh viên thực hiện : Trương Thị Thủy

Lớp : CNSH55A

MSV : 550404

A Đặt vấn đề

Mặc dù các tế bào vi khuẩn biểu hiện thành công rất nhiều protein từ tế bào nhân chuẩn, vẫn có những trường hợp protein tái tổ hợp được biểu hiện tốt nhất

ở các tế bào nhân chuẩn Một số protein nhân chuẩn không bền hay bất hoạt sau khi được biểu hiện ở vi khuẩn Điều này đặc biệt đúng với những protein cần

sự biến đổi sau dịch mã (posttranslational modification) Có nhiều loại biến đổi sau dịch mã ở nhân chuẩn xảy ra sau khi chuỗi polypeptide đã được tạo ra Chúng bao gồm:

(a) Biến đổi hóa học tạo thành amino acid mới trong chuỗi polypeptide

(b) Hình thành cầu nối disulfide giữa hai gốc cysteine đúng (ví dụinsulin) (c) Đường hóa (glycosylation), là quá trình thêm gốc đường vào các vịtrí nhất định trên phân tử protein Rất nhiều protein trên bề mặt tế bào được đường hóa

và sẽ không lắp ráp chính xác lên màng hay hoạt động chức năng được nếu thiếu thành phần đường

(d) Gắn thêm nhiều loại nhóm chức khác nhau như các chuỗi acid béo, các nhóm acetyl, phosphate và sulfate

(e) Cắt tiền chất protein Việc này có thểxảy ra ởvài bước như được minh họa bởi insulin Việc cắt bỏnày có thểliên quan đến việc tiết, cuộn gấp đúng và/hoặc hoạt hóa protein Các enzyme cần cho quá trình cải biến và xửlý thường vắng mặt trong tếbào vi khuẩn, nên cần phải biểu hiện chúng trong tếbào nhân chuẩn Các enzyme xửlý sau dịch mã có liên quan thường hiện diện ởmột loạt sinh vật bậc cao; do đó rất ít trường hợp cần biểu hiện protein tái tổhợp ở đúng sinh vật

đó Ở đây chúng ta quan tâm đến việc sản xuất protein ở tế bào nuôi cấy Tuy nhiên, người ta có thể biến đổi gene của toàn bộmột động vật hay thực vật để sản xuất protein tái tổhợp Thuận lợi tiếp theo trong việc sử dụng hệ thống biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn loại bỏ được nguy cơ nhiễm tạp các

protein vi khuẩn Mặc dù được tinh sạch, các protein vi khuẩn tồn dư với lượng rất nhỏ sẽ gây độc hay sẽ kích hoạt hệ thống miễn dịch của sinh vật nhân chuẩn, gây sốt Các vector con thoi (shuttle vector) được thiết kế đểdi chuyển gen qua lại giữa các nhóm sinh vật khác nhau Bởi vì thao tác gene ở tế bào nhân chuẩn khó khăn hơn nên hầu hết các vector biểu hiện ở nhân chuẩn là vector con thoi Những vector như vậy cho phép việc cải biến gene diễn ra ởvi khuẩn, thường

là E coli, và cho phép chuyển vào các sinh vật khác đểbiểu hiện gene Chúng ta

sẽ xem xét tếbào nấm men, côn trùng và động vật có vú nhưlà những hệthống biểu hiện protein tái tổ hợp

(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P Clark and Nanette J

Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution Academic Press)

B NỘI DUNG

I.1 Đặc điểm

Nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng như một sinh vật nhân chuẩn mẫu trong nghiên cứu sinh học phân tử Bộ gene của nấm men đã được giải trình tự và nhiều gene đã được nghiên cứu đặc điểm Dưới góc độ công nghệ sinh học, vài yếu tố tạo thành ưu thế của nấm men trong việc biểu hiện một số protein nhân chuẩn tái tổ hợp

(a) Nấm men có thể nuôi dễ dàng cả ở quy mô nhỏ lẫn các nồi lên men sinh học lớn (b) Sau nhiều ngàn năm sử dụng để lên men rượu bia và bánh mỳ, nấm men được công nhận là sinh vật an toàn với con người Chúng có thể được dùng để biểu hiện các protein dùng trong y học mà không cần sự chấp thuận thêm của các nhà quản lý (c) Nấm men tiết rất ít protein Do vậy nếu biến đổi gene để nó có thể sản xuất một protein tái tổhợp tiết ra môi trường thì việc tinh sạch sẽ dễ dàng

(d) Nấm men có thể được chuyển gene vào dễ dàng nhờ nhiều phương pháp khác nhau sau khi đã phân hủy thành tế bào bằng enzyme hay các chất hóa học, hay tạo lỗ nhờ sung điện

(e) Nấm men có plasmid 2 micron tự nhiên để làm cơ sở cho việc thiết kế các vector biểu hiện

(f) Nhiều promoter của nấm men đã được nghiên cứu kỹ và có thể dùng để kiểm soát việc biểu hiện protein tái tổ hợp

(g) Mặc dù là sinh vật nhân chuẩn đơn bào nguyên thủy, nấm men vẫn thực hiện nhiều quá trình biến đổi protein sau dịch mã đặc trưng cho sinh vật nhân chuẩn, như thêm các gốc đường (quá trình glycosylation) Tuy nhiên nấm men chỉ đường hóa các protein tiết Protein tái tổhợp có thểthiết kế để được tiết bởi nấm men

(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P Clark and Nanette J Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution Academic Press)

II.2 Các hệ thống vector

Có nhiều vector sử dụng cho nấm men đã được tạo ra và thương mại hóa Các vector này đều sử dụng phương pháp chọn lọc khuyết dưỡng

Chúng có thể được chia thành 3 loại chính:

Các vector plasmid (YEp) được sửdụng nhiều nhất

Các vector dung nhập vào nhiễm sắc thể nấm men (Yip)

Nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC)

1 YEp( yeast episomal plasmids )

Đặc điểm:

- Dựa vào plasmid 2µm

- Vị trí đa nhân dòng (MCS)

- Promoter điều khiển quá trình phiên mã và dịch mã

- Gốc tái bản trong E.coli và trong nấm men ori.E và ori.2µ plasmid

- Gen chọn lọc kháng ampiciline

- Gen mã hóa cho leuxin 2 (LEU2)

- Trong gen đích cần cài vào vector ngoài đoạn DNA quan tâm còn có các trình

tự như :

+ Có đoạn DNA mã hóa cho trình tự amino acid giúp protein sau khi tạo thành

sẽ đi ra khỏi tế bào giải phóng ra môi trường → thuận lợi cho việc tinh sạch , trình tự sử dụng là gen nhân tố giao phối α

+ Đoạn DNA làm tăng độ bền của protein

+ Các trình tự amino acid được bổ sung nhằm tăng độ bền và tăng khả năng tinh sạch sẽ được cắt bỏ bởi các protease đặc hiệu

2 YIp (yeast integrating plasmid )

Do các plasmid có thể mất đi, đặc biệt trong các mẻ môi trường nuôi cấy lớn, nên ứng dụng vector dung nhập sẽ làm tăng sự ổn định của gene ngoại lai Điều bất lợi là chỉ một bản sao của gene chuyển có mặt, trừ khi các cấu trúc lặp lại liên tiếp được sử dụng Những trình tự lặp liên tiếp này lại không ổn định vì xảy ra trao đổi chéo

(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”-

Bernard R.Glick & Jack J Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản

năm 2007)

http://www.discoverbiotech.com/wiki/-/wiki/Main/Cloning+Vectors

3 YAc (yeast artificial chromosome )

- Sử dụng để nhân dòng những đoạn DNA có kích thước lớn

- Có độ bền cao dùng để lập bản đồ vật lý của AND hệ gen người, phân tích các đơn vị phiên mã lớn, lập thư viện gen người

- Nó giống NST bình thường vì có vùng khởi đầu sao chép(ARS) , trình tự tâm động của nấm men (CEN), Các telomere nằm ở cuối nhiễm sắc thể, bảo vệ DNA khỏi tác động của nuclease (TEL)

- Ngoài ra còn có các gen đánh dấu chọn lọc và vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn

(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ

hợp”- Bernard R.Glick & Jack J Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ

thuật xuất bản năm 2007)

http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/YAC.php

Ứng dụng Protein hỗn hợp cho người bây giờ đã được sản xuất nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae Chúng bao gồm insulin, yếu tố đông máu XIIIa, vài yếu tố sinh trưởng và protein virus (từ HIV, viêm gan B, C, v.v.) được sử dụng như là các vacine hay trong chuẩn đoán Mặc dù nhiều protein tái tổhợp đã được biểu hiện thành công ở nấm men, năng suất của chúng thường thấp

(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved

Reference: David P Clark and Nanette J Pazdernik.2010.Biotechnology-applying the genetic revolution Academic Press)

Các khó khăn bao gồm:

(a) Sự thất thoát plasmid biểu hiện trong quá trình sinh trưởng trong các nồi lên men lớn

(b) Các protein được cho là sẽ được tiết thường bị giữ lại ở khoảng giữa màng và thành tế bào chứ không thoát ra ngoài môi trường

(c) Quá trình đường hóa protein thường quá đà và sản phẩm protein tái tổ hợp thường

có quá nhiều gốc đường để có thể hoạt động đúng

Vì sự biểu hiện trong S.cerevisiae có một số nhược điểm là :

- sự biểu hiện thấp năng suất không đáng kể

- sự gắn gốc đường không chính xác làm biến đổi chức năng và làm cho protein tái tổ hợp có tình kháng nguyên

- protein tái tổ hợp thường bị giữ lại tại nhu chất do đó làm tăng thời gian và chi phí để tinh sạch

- trong quá trình sinh trưởng S.cerevisiae sản sinh ra etanol là chất độc đối với tế bào → giảm lượng protein tiết ra

vì vậy người ta tìm kiếm các hệ thống nấm men khác để khắc phục những nhược điểm của S.serevisiae và P.pastoris có những ưu điểm

- có promoter hiểu quả cao

- không tổng hợp etanol

- tiết rất ít loại protein nên dễ tinh sạch

có rất nhiều vector biểu hiện của P pastoris đã được thiết kế cấu trúc của mối loại đều

có những điểm chung như:

- các plasmid cài nhập

- có gen quan tâm chịu sự điều khiển của promoter

- trình tự kết thúc phiên mã từ gen AOX1 của P.pastoris

- gen đánh dấu chọn lọc trong nấm men

(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ

hợp”- Bernard R.Glick & Jack J Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ

thuật xuất bản năm 2007)

cấu tạo của vector biểu hiện trong P.pastoris

http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=3118338_1472-6750-11-47-6&req=4

II BIỂU HIỆN PROTIEN Ở TẾ BÀO CÔN TRÙNG

II.1 Đặc điểm

Các tế bào động vật có vú khá mỏng manh và có các đòi hỏi dinh dưỡng phức tạp Điều này làm cho việc nuôi cấy chúng khó khăn và đắt đỏ so với tế bào nấm men hay

vi khuẩn Tuy nhiên tế bào côn trùng khá khỏe và có thể được nuôi cấy trong các môi trường đơn giản hơn các tếbào động vật Kết quả là, các hệ thống biểu hiện dựa vào côn trùng đã được phát triển Những hệ thống này có thêm thuận lợi là có thể tiến hành các biến đổi sau dịch mã giống với các hệ thống ở tế bào động vật có vú

Các vector được sử dụng trong các tế bào vi khuẩn hầu hết đều có nguồn gốc từ

một họ virus có tên là baculovirus, chỉxâm nhiễm côn trùng (và các động vật

không xương có họ hàng như lớp nhện và giáp xác) Baculovirus có kiểu hình thành hạt virus dị thường dạng polyhedrons (đa diện) Nhưng khi côn trùng bị chết, các hạt virus được giải phóng gắn vào một chất nền protein Protein chất nền được gọi là polyhedrin, và cấu trúc polyhedron bảo vệ các hạt virus khi chúng ở ngoài môi trường Khi được nuốt bởi các côn trùng khác, polyhedrin bị dung giải nhờ quá trình tiêu hóa

và polyhedron tách ra Quá trình này giúp giải phóng các hạt virus có thể xâm nhiễm các tế bào côn trùng mới Gene mã hóa polyhedrin có một promoter khỏe, và giai đoạn muộn của quá trình dịch mã, protein polyhedrin được tạo ra với lượng rất lớn

Do polyhedrin không thật sự cần thiết cho việc xâm nhiễm của virus vào tế bào côn trùng nuôi cấy, polyhedrin promoter có thể được sử dụng để biểu hiện các protein tái

tổ hợp Trình tự mã hóa cho polyhedrin được loại bỏ và thay bằng cDNA mã hóa cho protein tái tổ hợp quan tâm Có rất nhiều loại baculovirus khác nhau, và loại thường

được sử dụng nhiều nhất là MNPV (multi nuclear polyhedrosis virus) Virus này xâm nhiễm rất nhiều tế bào côn

trùng và sinh sôi tốt ở nhiều dòng tế bào côn trùng nuôi cấy Một dòng tế bào phổ thông được sử dụng để nhân virus này lên là từ loài sâu fall armyworm (sâu keo-Spodoptera frugiperda) Sản lượng của polyhedrin-và cũng là sản lượng của protein tái tổhợp sử dụng polyhedrin promoter thường đặc biệt cao trong các dòng tế bào này

(Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P Clark and Nanette J Pazdernik.2010.Biotechnology- applying the genetic revolution Academic Press)

II.2 Hệ thống vectoter biểu hiện baculovirut

DNA Vector

DNA 5’ Pp MCS Pt DNA 3’

AcMNPV AcMNPV

a Cấu trúc một đơn vị biểu hiện của một vector chuyển nạp

baculovirus(AcMNPV ), MCS vị trí đa nhân dòng, Pp promoter gen polyheđrin,Pt trình tự kết thúc phiên mã gen polyheđrin 5’,3’ DNA AcMNPV là trình tự khởi đầu và kết thúc phiên mã

Sự thay thế gen polyheđrin AcMNPV bằng một đơn vị biểu hiện từ một vector chuyển nạp Trao đổi chéo kép(x) giữa các đoạn DNA tương đồng của vector chuyển nạp và

hệ AcMNPV dẫn đến sự cài nhập của đơn vị biểu hiện vào bộ gen AcMNPV GOI là đoạn gen quan tâm

Các tế bào côn trùng sau khi được cấy AcMNPV tái tổ hợp sẽ tạo ra các vết tan trong quá trình chọn lọc do do các tế bào được có AcMNPV tái tổ hợp thì gen polyheđrin bị bất hoạt, còn những tế bào không có AcMNPV tái tổ hợp thì gen polyheđrin hoạt động bình thường

Việc định loại các vết tan bằng mắt dễ gây mệt mỏi và mang tính chủ quan vì vậy người ta đã thêm một số tác nhân chọn lọc khác như gen lacZ của E.coli ,gen mã hóa cho β-galactosidase, đặt dưới sự kiểm soát của promoter trong baculovirus, bản thiết

kế này được gắn trong DNA đích →những tế bào côn trùng có AcMNPV tái tổ hợp thì tạo ra các vết tan và có màu xanh trên môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm X-gal

b Để tăng sản lượng baculovirus tái tổ hợp có nhiều quy trình được tìm ra trong

đó có phương pháp thẳng hóa bộ gen AcMNPV trước khi chuyển nhiễm vào trong tế bào côn trùng

Sử dụng Bsu36I để cắt bộ gen AcMNPV tại hai vị trí của gen polyheđrin,một là gen

603 và vị trí kia là gen 1629 cần thiết cho sự nhân lên của virus, khi DNA từ

baculovirus này được xử lý với Bsu36I và chuyển nhiễm vào các tế bào côn trùng , sự nhân lên của virus không xảy ra do thiếu gen 1629 Vector chuyển nạp gồm có gen quan tâm có thể có gen đánh dấu chọn lọc các vector chuyển nạp này được đưa vào tế bào côn trùng trước đó được chuyển nhiễm với hệ gen AcMNPV đã thẳng hóa Sự trao đổi kép vừa tạo nên phiêm bản có chức năng của gen 1629 vừa gắn kết gưn nhân dòng vào bộ gen AcMNPV Với hệ thống này, tới 99% các vết tan baculovirus là virut tái tổ hợp

Quá trình tạo baculovirus tái tổ hợp

c Vector con thoi baculovirus E.coli –tế bào côn trùng

- hệ thống có khả năng thực hiện các thao tác di truyền để tạo vector biểu hiện baculovirus trong E.coli được phát triển, các tế bào côn trùng chỉ cần cho việc tạo ra protein tái tổ hợp

- plasmid tái E.coli được thiết kế gồm gen kháng Kanamycine, vị trí cài nhập (att) được chèn vào gen lacZ mà không làm mất chức năng của nó ( hình A)

- sau qua trình tái tổ hợp kép giữa DNA AcMNPV và plasmid E.coli sẽ tạo nên vector con thoi baculovirut E.coli – tế bào côn trùng được gọi là bacmit

Trong quá trình chuyển nạp của đoạn gen cho vào bacmit cần phải có

- plasmid cho (plasmid E.coli ), gồm có gen kháng gentamycine đơn vị biểu hiện gen đích được chặn hai đầu bằng trình tự cài nhập và gen kháng ampiciline nằm ngoài vị trí gắn

- và plasmid phụ trở gồm có các gen chuyển vị, và gen kháng tetraciline

các tế bào virus được biến nạp kép, đoạn DNA được chuyển vị vào vị trí gắn của bacmit Sự gắn kết của đoạn DNA plasmid cho với với đơn vị biểu hiện và gen kháng gentamicine vào vị trí gắn của bacmit sẽ phá vỡ khung đọc của gen lacZ Vì vậy,vi khuẩn chứa bacmit tái tổ hợp tạo ra khuẩn lạc trắng trong môi trường có IPTG và X-Gal, ngoài ra các khuẩn lạc trắng kháng với kanamicine và nhảy cảm với

ampiciline và tetraciline chỉ mang bacmit tái tổ hợp mà không mang plasmid cho hay trở giúp.Sau tất cả các thao tác này, sự gắn kết của gen nhân dòng có thể được khẳng định bằng PCR Cuối cùng bacmit tái tổ hợp có thể được chuyển nhiễm vào các tế bào côn trùng ở đây các gen nhân dòng được phiên mã và protein tái tổ hợp được tạo ra

(Sách ”Công nghệ sinh học phân tử- nguyên lí và ứng dụng của ADN tái tổ hợp”-

Bernard R.Glick & Jack J Pasternak nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật xuất bản

năm 2007)

QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA (glycosylation)

Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn được đường hóa sau dịch mã Quá trình đường hóa là cần thiết cho chức năng của một sốprotein Một thuận lợi khi biểu hiện protein tái tổ hợp của sinh vật nhân chuẩn ở tế bào côn trùng là chúng có một hệ thống/con