Bài giảng công nghệ di truyền chương 6 biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở e coli

Biểu DNA tái tổ hợp E coli Protein nguyên thể (native) Protein dung hợp (fusion protein) • Đoạn gene mã hóa nhiều protein Vector biểu • Trình tự ori tạo nhiều tế bào vật chủ • Gene thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo trì vector tế bào • Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp tac) cho phép sản xuất lượng lớn mRNA từ gene tạo dòng • Các trình tự kiểm soát dịch mã trình tự liên kết ribosome (rbs) bố trí thích hợp codon khởi đầu AUG • Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào theo hướng xác với promoter Hệ thống biểu prokaryote Promotor lacZ promotor: pUC, M13 vector, vector lamda Bluescript - Điều hòa lacI repressor Lambda PL promotor T7 promotor araBAD promotor Hệ thống điều hòa promotor Vector biểu với lacZ Vector biểu với lacZ Trình tự gắn với ribosome (ribosomal binding site) • Cần thiết để khởi đầu dịch mã • E coli thường có trình tự -GAGG- đứng trước codon khởi đầu dịch mã • Trình tự Shine-Dalgarno E coli: AGGAGGU • Trình tự Kozak Eukaryote: (gcc)gccRccAUGG Lợi protein dung hợp • Không cần thiết kế rbs codon khởi đầu dịch mã dung hợp đầu N-ter • Tăng ổn định, khả hòa tan, gấp cuộn, tạo cầu nối disulphide • Sự sẵn có kháng thể protein dung hợp dùng western blot/đánh giá biểu protein • Giúp tăng khả thu nhận tinh Các thẻ (tag) đánh dấu • GST (glutathion-S-transferase): – Kết hợp bảo vệ protein – Giúp dễ dàng tinh sắc ký lực • Maltose binding protein – Kết hợp với protein vận chuyển periplasmic giúp dễ dàng tinh – Tinh amylose (1 loại maltose) • Thioredoxin: • Histidin tag: 6H, tinh cột nickel Phát protein dung hợp • Sàng lọc dòng vi khuẩn enzyme cắt điện di gel • Sàng lọc dòng vi khuẩn biểu protein dung hợp – – – – Nuôi dòng vi khuẩn Kích ứng biểu (IPTG nhiệt độ) Tách chiết dịch SDS Biến tính điện di gel polyacrylamide (SDS PAGE) – Nhận biết nhuộm màu Western blotting Protein Ladder Western blot (anti-His tag conjunged HRP) 70kD 40kD 30oC 16oC - 4oC 30oC SP2 16oC - 4oC SP1 Tinh protein Thể vùi (inclusion) Hòa tan thể vùi - Phá tế bào - Tinh thể vùi - Hòa tan thể vùi Thu nhận protein Tinh protein [...]... lực • Maltose binding protein – Kết hợp với protein và vận chuyển ra ngoài periplasmic giúp dễ dàng tinh sạch – Tinh sạch bằng amylose (1 loại maltose) • Thioredoxin: • Histidin tag: 6H, tinh sạch bằng cột nickel Phát hiện protein dung hợp • Sàng lọc dòng vi khuẩn bằng enzyme cắt và điện di trên gel • Sàng lọc dòng vi khuẩn biểu hiện protein dung hợp – – – – Nuôi dòng vi khuẩn Kích ứng biểu hiện (IPTG... thế của protein dung hợp • Không cần thiết kế rbs và codon khởi đầu dịch mã nếu dung hợp ở đầu N-ter • Tăng sự ổn định, khả năng hòa tan, gấp cuộn, tạo cầu nối disulphide • Sự sẵn có của các kháng thể của protein dung hợp dùng trong western blot/đánh giá sự biểu hiện của protein • Giúp tăng khả năng thu nhận tinh sạch Các thẻ (tag) đánh dấu • GST (glutathion-S-transferase): – Kết hợp và bảo vệ protein... dịch bằng SDS Biến tính và điện di trên gel polyacrylamide (SDS PAGE) – Nhận biết bằng nhuộm màu hoặc Western blotting Protein Ladder 1 2 3 4 Western blot (anti-His tag conjunged HRP) 70kD 40kD 30oC 16oC - 4oC 30oC SP2 16oC - 4oC SP1 Tinh sạch protein 1 Thể vùi (inclusion) 2 Hòa tan thể vùi - Phá tế bào - Tinh sạch thể vùi - Hòa tan thể vùi 3 Thu nhận protein Tinh sạch protein