Bài giảng công nghệ di truyền chương 6 biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở e coli

Protein dung hợp fusion protein • Đoạn gene mã hóa 2 hoặc nhiều protein... Vector biểu hiện • Trình tự ori tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ.. • Các trình tự kiểm soát dịch mã nh

Biểu hiện của DNA tái tổ hợp ở

E coli

Protein nguyên thể (native)

Protein dung hợp (fusion protein)

• Đoạn gene mã hóa 2 hoặc nhiều protein

Vector biểu hiện

• Trình tự ori tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ

• Gene chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo duy trì vector trong tế bào

• Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gene được tạo dòng

• Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome (rbs) được bố trí thích hợp và codon khởi đầu AUG

• Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào theo hướng chính xác với promoter

Hệ thống biểu hiện ở prokaryote

Promotor

1 lacZ promotor: pUC, M13 vector, vector

lamda hoặc Bluescript

- Điều hòa bởi lacI repressor

2 Lambda PL promotor

3 T7 promotor

4 araBAD promotor

Hệ thống điều hòa bởi 2 promotor

Vector biểu hiện với lacZ

Trình tự gắn với ribosome (ribosomal binding site)

• Cần thiết để khởi đầu dịch mã

• ở E coli thường có trình tự -GAGG- đứng

trước codon khởi đầu dịch mã

• Trình tự Shine-Dalgarno ở E coli: AGGAGGU

• Trình tự Kozak ở Eukaryote: (gcc)gccRccAUGG

Lợi thế của protein dung hợp

• Không cần thiết kế rbs và codon khởi đầu dịch

mã nếu dung hợp ở đầu N-ter

• Tăng sự ổn định, khả năng hòa tan, gấp cuộn, tạo cầu nối disulphide

• Sự sẵn có của các kháng thể của protein dung hợp dùng trong western blot/đánh giá sự biểu hiện của protein

• Giúp tăng khả năng thu nhận tinh sạch

Các thẻ (tag) đánh dấu

• GST (glutathion-S-transferase):

– Kết hợp và bảo vệ protein

– Giúp dễ dàng tinh sạch bằng sắc ký ái lực

• Maltose binding protein

– Kết hợp với protein và vận chuyển ra ngoài periplasmic giúp dễ dàng tinh sạch

– Tinh sạch bằng amylose (1 loại maltose)

• Thioredoxin:

• Histidin tag: 6H, tinh sạch bằng cột nickel

Phát hiện protein dung hợp

• Sàng lọc dòng vi khuẩn bằng enzyme cắt và điện

di trên gel

• Sàng lọc dòng vi khuẩn biểu hiện protein dung hợp

– Nuôi dòng vi khuẩn

– Kích ứng biểu hiện (IPTG hoặc nhiệt độ)

– Tách chiết dịch bằng SDS

– Biến tính và điện di trên gel polyacrylamide (SDS

PAGE)

– Nhận biết bằng nhuộm màu hoặc Western blotting

1 2 3 4 Protein Ladder

Western blot (anti-His tag conjunged HRP)

SP1

- 4oC 16oC 30oC

SP2

- 4oC 16oC 30oC

40kD

70kD

Tinh sạch protein

1 Thể vùi (inclusion)

2 Hòa tan thể vùi

- Phá tế bào

- Tinh sạch thể vùi

- Hòa tan thể vùi

3 Thu nhận protein

Tinh sạch protein