Bài giảng công nghệ di truyền chương 4 thư viện DNA bộ gene (DNA genomic library)

Thư viện DNA gene (DNA genomic library) DNA genomic library gì? • Tập hợp tất đoạn DNA gene sinh vật • Các đoạn DNA tạo dòng vector • Sử dụng nhằm phân lập đoạn DNA xác định vị trí đoạn DNA gene Thực (phage cosmid) RE Siêu âm - B1 Cắt gene RE • Sử dụng RE có trình tự nhận biết gồm nu • Cắt phần để thu lượng lớn gene nguyên vẹn • Sử dụng DNA tách từ loại mô khác • Cắt vector với RE để tạo đầu cố kết • Có thể sử dụng RE để tránh tự kết nối B2 Tạo dòng • Plasmid: hạn chế đoạn DNA kích thước lớn, hiệu suất biến nạp tương đối thấp • Phage : phổ biến nhất, mang DNA ~ 20 kb • Cosmid: mang đoạn DNA ~ 40 – 50 kb • BAC : hữu hiệu – – – – Mang đoạn DNA lớn 100 – 300 kb Ít hình thành thể khảm Hiệu tạo dòng thu hồi DNA Duy trì ổn định DNA gắn vector • YAC : nhận đoạn DNA lớn, khó thao tác B3 Chuyển nạp vào tế bào chủ • Hóa biến nạp • Điện biến nạp • Đóng gói DNA tái tổ hợp (phage  cosmid) cho xâm nhiễm tế bào vi khuẩn cDNA library Tại cần xây dựng thư viện cDNA ? Tách chiết, tinh phân tích RNA 1) Tách chiết RNA tổng số - Nguyên lý: tách rời RNA khỏi hỗn hợp DNA , protein,… Kiểm soát ribonuclease (RNase) = chất ức chế 2) Tách chiết mRNA - Đuôi poly A Tách sắc ký lực oligo dT Thu nhận ly tâm Tạo dòng cDNA adapter HindIII Tạo dòng cDNA primer-adapter Sàng lọc dòng DNA lai nucleic acid – Mẫu dò tương đồng (100 %, biết trình tự) – Mẫu dò tương đồng phần (từ loài kế cận biết trình tự DNA quan tâm) – Mẫu dò tổng hợp nhân tạo (từ trình tự protein biết) Mẫu dò nhân tạo từ trình tự protein biết Sàng lọc dòng DNA lai nucleic acid VD: Southern blotting Sàng lọc dòng DNA lai nucleic acid VD: Southern blotting Phóng xạ tự ghi Digoxygenin dUTP Sàng lọc dòng DNA lai nucleic acid Lai chỗ (In situ hybridization) Tạo probe a) Đánh dấu đuôi đồng vị phóng xạ Tạo probe b) Dịch chuyển điểm đứt (Nick translation) Tạo probe c) Tổng hợp đoạn bổ sung Sàng lọc dòng DNA thử miễn dịch (immunochemical screening) Sàng lọc dòng DNA thử hoạt tính protein lipase Trioleoylglycerol + thuốc nhuộm huỳnh quang chitinase chitin Dòng DNA có dòng mong muốn? Open reading frame Dự đoán trình tự chức Đánh giá chức sản phẩm DNA Xem xét biểu DNA loại mô khác Đột biến đánh giá chức [...]...Tổng hợp cDNA theo pp RNaseH Tổng hợp cDNA self priming Tổng hợp cDNA đuôi trùng hợp Tạo dòng cDNA = hệ thống dG:dC Tạo dòng cDNA bằng 1 linker Tạo dòng cDNA bằng 2 linker Tạo dòng cDNA bằng adapter HindIII Tạo dòng cDNA bằng primer-adapter Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid – Mẫu dò tương đồng (100 %, đã biết trình tự) – Mẫu dò tương đồng từng phần (từ loài kế cận đã biết trình tự DNA quan tâm)... Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid VD: Southern blotting Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid VD: Southern blotting Phóng xạ tự ghi Digoxygenin dUTP Sàng lọc dòng DNA bằng lai nucleic acid Lai tại chỗ (In situ hybridization) Tạo probe a) Đánh dấu ở đuôi bằng đồng vị phóng xạ Tạo probe b) Dịch chuyển điểm đứt (Nick translation) Tạo probe c) Tổng hợp đoạn bổ sung Sàng lọc dòng DNA bằng thử miễn... Sàng lọc dòng DNA bằng thử miễn dịch (immunochemical screening) Sàng lọc dòng DNA bằng thử hoạt tính protein lipase Trioleoylglycerol + thuốc nhuộm huỳnh quang chitinase chitin Dòng DNA có đúng là dòng mong muốn? 1 2 3 4 Open reading frame Dự đoán trình tự và chức năng Đánh giá chức năng của sản phẩm DNA Xem xét sự biểu hiện của DNA ở các loại mô khác nhau 5 Đột biến và đánh giá chức năng