Bài giảng công nghệ di truyền chương 3 simple cloning

Simple cloning Tp Hồ Chí Minh 24-9-2014 Vector pUC • Ori: vùng tự tái • ampR or bla (betalactamase) : gen kháng ampiciline • lacZ’: betagalactosidase gene • MCS: multi cloning site • lacI: lac repressor gene Vai trò gene • bla: mã hóa beta-lactamase, enzyme thủy phân vòng beta-lacta ampiciline Vai trò gene • lacZ’: mã hóa beta-galactosidase, enzyme thủy phân đường đôi bao gồm X-gal tạo màu xanh Cấu trúc của… (c) IPTG: isopropyl --D-thiogalactoside Cắt vector DNA Nối ligase được… … hay… … cuối là… … DNA tái tổ hợp (recombinant) Chuyển tất cấu trúc vào E.coli • Hóa biến nạp (competence cell + thermal shock) • Điện biến nạp (electroporation) phage lamda Bacteriophage lamda Bacteriophage lamda Nếu loại bỏ không ảnh hưởng đến sinh sản làm tan tế bào chủ phage Bacteriophage lamda Chèn thêm đoạn DNA ngoại lai vào Bacteriophage lamda Chèn thêm đoạn DNA ngoại lai vào Vector cải tiến từ phage  Cosmid = plasmid + đầu cos • Dùng tạo dòng đoạn DNA kích thước lớn • Thành phần – Marker kháng kháng sinh – Trình tự ori – Đoạn DNA mang đầu cos phage lamda • Kích thước nhỏ, chứa đoạn DNA eukaryote khoảng 45 kb Tạo dòng cosmid Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) vectors • Yếu tố F (Fertility factor): plasmid, di chuyển sang tế bào không diện yếu tố F nhờ tiên mao giới tính (sex pilus) • Có khả chèn vào chromosome tế bào chủ • Mang DNA ngoại lai lớn (300 kb) • Chuyển vào E coli xung điện • Số thấp 1-2 • Ổn định E coli Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) vectors • parA, parB, parC : kiểm soát số • oriS repE: cần thiết cho tái Yeast Artificial Chromosomes (YAC) vectors • Dựa cấu trúc NST nấm men • Có thể nhận DNA 2000 kb [...]... 7 Tàn tật , không có khả năng chuyển sang tế bào vi khuẩn khác (loại bỏ những trình tự tham gia trong quá trình tiếp hợp) Vector nhân tạo đầu tiên, pBR322 Polycloning vector • Chứa vùng polylinkers hay multicloning sites • Chứa đoạn DNA ngoại lai từ 3 -10 kb Nhóm pUC Nhóm pUC Nhóm pGEM Nhóm pBluescript Biến nạp (transformation) • Lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào: – Số lượng DNA tái tổ hợp – Kiểu... theo chiều mong muốn  thuận lợi cho việc biểu hiện protein  Sử dụng hệ thống vector chứa multicloning site (MCS) hoặc polylinker 3) Nhân dòng sản phẩm PCR - Tạo dòng với sản phẩm PCR đầu bằng hiệu quả thấp  Thêm trình tự nhận biết của RE vào primer và tạo dòng bằng hệ thống polylinker  Hoặc thêm A vào đầu 3 sản phẩm PCR và tạo dòng bằng hệ thống TA vector Vector chứa RS của topoisomerase 5) Hệ thống... Hiệu quả biến nạp - Khả năng tiếp nhận DNA, (chưa hiểu rõ) Hiện di n hệ thống phân hủy DNA nội sinh  sử dụng các dòng E coli đột biến làm giảm khả năng phân hủy DNA ngoại sinh 2 Sự bền vững của plasmid trong tế bào vật chủ - Hệ thống tái tổ hợp của tế bào vật chủ  Sử dụng các dòng đột biến hạn chế sự tái tổ hợp Tính chất của tế bào chủ 3 Dị tật: hạn chế khả năng sống sót khi phát tán ra bên ngoài 4... hợp + ampiciline + IPTG + XGal Blue + White Systems Khẳng định dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp – Dùng enzyme cắt và điện di – Colony PCR (dùng primer chuyên biệt) Yêu cầu cần có của Vector 1 Điểm khởi đầu nhân đôi (an origin of replication) 2 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker) 3 Những trình tự nhận biết duy nhất của các RE (suitable single restriction sites) 4 Kích thước phù hợp (suitable size) 5