Ứng dụng kỹ thuật pcr phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 gây bệnh hemophilia a

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ XINH ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN ĐẢO ĐOẠN INTRON 22 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ XINH ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN ĐẢO ĐOẠN INTRON 22 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A Chuyên ngành: XÉT NGHIỆM Y HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.BS NGUYỄN THỊ BĂNG SƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2016 i LỜI CAM ĐOAN: Tôi xin cam đoan chương trình nghiên cứu tơi thực trực tiếp hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Thị Băng Sương Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình nghiên cứu Người thực Lê Thị Xinh ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt: BN : Bệnh nhân TW: Trung Uơng TPHCM: thành phố Hồ Chí Minh PTN: Phịng thí nghiệm Tiếng Anh: aPTT: activated Partial Thromboplastin Time bp: Base pair DIC: Disseminated Intravascular Coagulation DNA: Deoxyribonucleic acid FVIII: Factor VIII I-PCR : Inverse - PCR kD: Kilo dalton mRNA: Messenger Ribonucleic acid NCBI: National Center for Biotechnology Information OD: Optical Density PCR : Polymerase Chain Reaction iii MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc, chức gen FVIII protein FVIII: 1.2 Lịch sử bệnh Hemophilia A: 1.3 Đặc điểm bệnh học bệnh Hemophilia A: 1.3.1 Cơ chế đông – cầm máu: 1.3.2 Đặc điểm di truyền bệnh Hemophilia A: 11 1.3.3 Chẩn đoán bệnh Hemophilia A: 13 1.3.3.1 Chẩn đoán xác định: 13 1.3.3.2 Chẩn đoán thể bệnh: 16 1.3.3.3 Chẩn đoán phân biệt: 18 1.4 Bệnh học phân tử bệnh Hemophilia A thể nặng (đột biến đảo đoạn intron 22 gen FVIII): 19 1.4.1 Đột biến đảo đoạn intron 22: 19 1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử phát đột biến đảo đoạn intron 22: 21 1.5 Điều trị bệnh Hemophilia A: 21 1.6 Tổng quan tình hình nghiên cứu: 23 iv 1.6.1 Ngoài nước: 23 1.6.2 Trong nước: 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu: 26 2.1.1 Chọn mẫu nghiên cứu: 26 2.1.2 Cách lấy mẫu : 27 2.1.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu: 27 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu: 27 2.2.1 Dụng cụ: 27 2.2.2 Trang thiết bị: 27 2.2.3 Phần mềm trình tự sử dụng: 28 2.2.4 Hóa chất sinh phẩm: 28 2.2.4.1 Xử lý bệnh phẩm: 28 2.2.4.2 Hóa chất Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: 28 2.2.4.3 Hóa chất tinh DNA: 29 2.2.4.4 Hóa chất cắt DNA enzyme BclI: 29 2.2.4.5 Hóa chất nối DNA (Ligation): 30 2.2.4.6 Hóa chất thực kỹ thuật PCR: 30 v 2.2.4.7 Hóa chất điện di gel Agarose: 30 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 30 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu : 30 2.3.2 Sơ đồ bước nghiên cứu: 30 2.3.3 Áp dụng quy trình Inverse – PCR (Rossetti 2005) phát đột biến đảo đoạn intron 22 điều kiện phịng thí nghiệm 31 2.3.3.1 Thu nhận mẫu máu: 32 2.3.3.2 Khảo sát kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi: 32 2.3.3.3 Kiểm tra đoạn mồi: 33 2.3.3.4 Khảo sát phản ứng Inverse- PCR: 33 2.3.4 Ứng dụng quy trình khảo sát để thực phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 gen FVIII bệnh nhân mắc Hemophilia A thể nặng 38 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 40 3.1 Những đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh nhân Hemophilia A thể nặng): 40 3.1.1 Đặc điểm nhóm tuổi phát bệnh: 40 3.1.2 Đặc điểm giới tính: 41 3.2 Kết áp dụng quy trình Inverse – PCR (Rossetti 2005) phát đột biến đảo đoạn intron 22 điều kiện phịng thí nghiệm 41 3.2.1 Kết khảo sát phương pháp tách chiết DNA: 41 vi 3.2.2 Kết kiểm tra đoạn mồi: 42 3.2.3 Kết khảo sát phản ứng Inverse - PCR 44 3.2.3.1 Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp: 44 3.2.3.2 Kết khảo sát lượng DNA khuôn mẫu phản ứng Inverse –PCR: 45 3.3 Ứng dụng kỹ thuật Inverse –PCR khảo sát để phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 gen FVIII bệnh nhân mắc Hemophilia A thể nặng 46 3.3.1 Kết tách chiết DNA từ máu ngoại vi 32 bệnh nhân thể nặng : 47 3.3.2 Kết đo nồng độ độ tinh DNA sau thực phản ứng nối T4 DNA Ligase 32 bệnh nhân thể nặng: 48 3.3.3 Kết phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 nhóm bệnh nhân Hemophilia A thể nặng kỹ thuật Inverse- PCR: 49 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 53 4.1 Những đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh nhân Hemophilia A thể nặng): 54 4.1.1 Đặc điểm tuổi phát bệnh: 54 4.1.2 Đặc điểm giới: 55 4.2 Kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến đảo đoạn intron 22 gen FVIII: 56 4.3 Áp dụng quy trình Inverse – PCR (Rossetti 2005) phát đột biến đảo đoạn intron 22 điều kiện phịng thí nghiệm.: 58 vii 4.3.1 Quy trình kỹ thuật tách chiết DNA tổng số: 58 4.3.2 Kiểm tra đoạn mồi: 59 4.3.3 Kết khảo sát phản ứng Inverse – PCR 60 4.3.3.1 Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp: 60 4.3.3.2 Kết khảo sát lượng DNA khuôn mẫu phản ứng Inverse –PCR: 60 4.4 Ứng dụng kỹ thuật Inverse –PCR khảo sát để phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 gen FVIII bệnh nhân mắc Hemophilia A thể nặng: 61 4.4.1 Kết tách chiết DNA nhóm bệnh nhân: 61 4.4.2 Kết phát đột biến đảo đoạn intron 22 32 bệnh nhân chẩn đoán Hemophilia A thể nặng: 62 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Phụ lục 1: Các bước tiến hành tách chiết DNA từ máu ngoại vi QIAamp® DNA Kit a Phụ lục 2: Các bước tiến hành tách chiết DNA từ máu ngoại vi Phenol/ Chloroform c Phụ lục 3: Các bước tiến hành tách chiết DNA từ máu ngoại vi kit Promega: e Phụ lục 4: Danh sách bệnh nhân tham gia nghiên cứu g viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các yếu tố đông máu 10 Bảng 1.2: Yếu tố liên quan chẩn đoán bệnh Hemophilia A 17 Bảng 2.1: Trình tự mồi sử dụng phản ứng Inverse PCR 33 Bảng 3.1: Phân bố mẫu nghiên cứu theo nhóm tuổi 40 Bảng 3.2: Kết kiểm tra thông số mồi mồi ID,ED, IU 43 Bảng 3.3: Giá trị ΔG cấu trúc Selfdimer Hetero-dimer mồi ID, ED, IU .43 Bảng 3.4: Kết đo nồng độ DNA độ tinh DNA sau tách chiết máu ngoại vi nhóm bệnh nhân 47 Bảng 3.5: Kết đo nồng độ DNA độ tinh DNA sau thực phản ứng nối T4 DNA Ligase nhóm bệnh nhân 48 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM 65 KIẾN NGHỊ Từ việc thành công phát đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật Inverse- PCR ta tiếp tục: - Ứng dụng kỹ thuật Inverse- PCR tiến hành nghiên cứu phả hệ gia đình bệnh nhân để phát bệnh đặc biệt người lành mang mầm bệnh - Trong thời gian có hạn thực đề tài, số lượng mẫu thu thập cịn nên nghiên cứu mở rộng số lượng mẫu, ứng dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác để phát bất thường gen FVIII gây Hemophilia A thể nặng (ngoài đột biến đảo đoạn intron 22), Hemophilia A thể trung bình nhẹ nghiên cứu phả hệ cho thành viên gia đình bệnh nhân - Tư vấn di truyền trước hôn nhân trước sinh cho bệnh nhân mang gen bệnh - Tham gia chương trình ngoại kiểm để đánh giá chất lượng xét nghiệm phân tích gen FVIII Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM i TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nước: Bùi Thị Thu Hương, Trần Vân Khánh, Nguyễn Viết Tiến, Nguyễn Thị Hà, Tạ Thành Văn (2013), "Phát người lành mang gen bệnh Hemophilia A " Tạp chí Nghiên cứu Y học, 83(2): 1-6 Đ.T.P.v, Chăm sóc bệnh nhân Hemophilia Hội thảo thành lập Hội Hemophilia 1996: Viện Huyết học truyền máu Trung Ương Nguyễn Thị Hương Quế, Phạm Quang Vinh, Nguyễn Thị Mai ( 2009) "Nghiên cứu tác dụng không mong muốn bệnh nhân Hemophilia truyền chế phẩm máu viện Huyết Học-Truyền máu Trung Ương giai đoạn 2004-2008.", Tạp chí Y học Việt Nam, 2:tr.155-159 Phạm Quang Vinh (2006) Bài giảng Huyết học -truyền máu, Nhà xuất y học, 270-279 Tạ Minh Hiếu, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn (2011) "Áp dụng quy trình xác đinh đột biến gen mã hóa yếu tố VIII gây bệnh Hemophilia A ", Tạp chí Nghiên cứu Y học, 74 (3), pp: 37-43 Trần Thị Phương Tuý, Nguyễn Ngọc Minh, Nguyễn Văn Tránh, Ngô Tứ Cương, Tôn Nữ Trà Mai, Trần Thị Nhung (2007) "Tìm hiểu tính chất gia đình bệnh nhân Hemophilia điều trị bệnh viện Trung Ương Huế" Tạp chí Nghiên cứu y học 4(51):tr 20 - 25 Trần Thị Phương Túy, Nguyễn Văn Tránh, Nguyễn Văn Bông, Nguyễn Ngọc Minh, Trần Thị Hồng Hạnh, Phan Hoàng Duy, Hoàng Thị Thanh Trang, Trần Ngọc Vũ ( 2009) "Tìm hiểu đặc điểm xương khớp bệnh nhân Hemophilia điều trị trung tâm huyết học truyền máu ", Tạp chí Y học Việt Nam , 2: tr 108-114 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM ii Trương Thiên Phú, Nguyễn Tự, Trần Văn Bảo, Phan Bích Liên (2009;) "Đánh giá hiệu điều trị tủa lạnh bệnh nhân Hemophilia A bệnh viện Chợ Rẫy" Tạp chí Y Học Việt Nam., 2: tr 104-107 Tài liệu tham khảo nước ngoài: Anne Goodeve (2008) "Molecular Genetic Testing of Hemophilia A” Semin Thromb Hemost 34(6):491-501 10 Antonarakis SE, Rossiter JP, Young M, et al (1995) “Factor VIII gene inversions in severe hemophilia A: results of an international consortium study” Blood 86: 2206– 12 11 Antonarakis SE, et al (1995) " Molecular etiology of factor VIII deficiency in Hemophilia A" Hum Mutat ;5(1):1-22 12 Azza A.G Tantawy (2010) " Molecular genetics of hemophilia A: Clinical perspectives".The Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 11(2), 105–114 13 Barbara A Konkle, MD, Neil C Josephson, MD, and Shelley Nakaya Fletche, (2000 Sep 21[updated 2014 Jun 5]), Hemophilia A, University of Washington, Seattle; 1993-2015 14 Benedik- Dolnicar, M and M Benedik (2007)"Haematuria in patients with haemophilia and its influence on renal function and proteinuria" Haemophilia, 13(5): p.489-92 15 Biggs R (1967)"Thirty years of haemophilia treatment in Oxford" Br J Haematol;13(4):452–463 16 Bontempo FA, et al (1987 Jun), “Liver transplantation in Hemophilia A” Blood ,69(6):1721-4 17 Boekhorst, J.,et al (2008) " Factor VIII genotype and inhibitor development in patients with haemophilia A : highest risk in patients with splice site mutations" Haemophilia, 14(4): p 729-35 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM iii 18 Chambost H, et al, (2002 Oct)"What factors influence the age at diagnosis of hemophilia? Results of the French hemophilia cohort" J Pediatr, 141(4):548-52 19 Citron M, Godmilow L, Ganguly T, Ganguly A ( 2002) "High throughput mutation screening of the factor VIII gene (F8C) in hemophilia A: 37 novel mutations and genotype-phenotype correlation", Hum Mutat, 20(4):267-74 20 Darby SC, et al (2007 Aug 1) "Mortality rates, life expectancy, and causes of death in people with hemophilia A or B in the United Kingdom who were not infected with HIV" Blood ;110(3):815-25 21 Duga S, Salomon O (2013) "Congenital factor XI deficiency: an update" Semin Thromb Hemost.;39:621–31 22 D J Bowen (2002 Apr) "Haemophilia A and haemophilia B: molecular insights" Mol Pathol; 55(2): 127–144 23 Franchini M, et al ( 2014 Jul ) "The history of hemophilia" Semin Thromb Hemost ;40(5):571-6 24 Fukuda, et al., (2004 Apr) "Inversions of the factor VIII gene in Japanese patients with severe hemophilia A" Int J Hematol, 79(3):303-6 25 Gitschier, J, et al (1984), “Characterization of the human factor- VIII gene” Nature, 312(5992): p.326 - 330 26 Goedert JJ, et al (2007 Jun 15) "Reconstruction of the hepatitis C virus epidemic in the US hemophilia population, 1940-1990" Am J Epidemiol ;165(12):1443-53 27 Habart D (2005) "Molecular diagnosis of haemophilia A in clinical practice” Cas Lek Cesk 2005;144(12):795-800 28 Hay CR, Palmer B, Chalmers E, Liesner R, Maclean R, Rangarajan S, Williams M, Collins PW (2011) “Incidence of factor VIII inhibitors throughout life in severe hemophilia A in the United Kingdom” Blood ; 117(23):6367-70 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM iv 29 Hwang SH, Kim MJ, Lim JA, Kim HC, Kim HS (2009) "Profiling of factor VIII mutations in Korean haemophilia A" Haemophilia, 15(6):1311-7 30 H Poláková, et al., (2003)" Long Distance PCR in Detection of Inversion Mutations of F8C Gene in Hemophilia A Patients" Gen Physiol Biophys, 22(2):243-53 31 Husain N (2009), "Carrier analysis for hemophilia A: ideal versus acceptable" Expert Rev Mol Diagn; 9(3):203–7 32 I PLUG, et al (2006 Mar) " Mortality and causes of death in patients with hemophilia, 1992–2001: a prospective cohort study" J Thromb Haemost ;4(3):510-6 33 Jayandharan G, Shaji RV, Baidya S, Nair SC, Chandy M, Srivastava A (2005) " Identification of factor VIII gene mutations in 101 patients with haemophilia A: mutation analysis by inversion screening and multiplex PCR and CSGE and molecular modelling of 10 novel missense substitutions", Haemophilia, 11(5):48191 34 Jenkins, et al (1994 Oct 1)" Analysis of intron 22 inversions of the factor VIII gene in severe hemophilia A: implications for genetic counseling" Blood.;84(7):2197-201 35 Jerry S Powell (2009) "Recombinant factor VIII in the management of hemophilia A: current use and future promise" Ther Clin Risk Manag.; 5: 391–402 36 Jenkins PV, et al (1994 Oct 1) "Analysis of intron 22 inversions of the factor VIII gene in severe hemophilia A: implications for genetic counseling" Blood ;84(7):2197-201 37 Kempton CL (2010)” Inhibitors in previously treated patients: a review of the literature” Haemophilia.; 16(102):61-5 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM v 38 Keeney, et al., (2005 Jul) "The molecular analysis of haemophilia A: a guideline from the UK haemophilia centre doctors organization haemophilia genetics laboratory network" Hemophilia A; 11(4):387-97 39 Kulkarni, et al (2003 Nov), "Renal disease among males with haemophilia" Haemophilia.; 9(6):703-10 40 Lakich, D ,et al.,(1993) “Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A” Nat Genet, 5(3): p 236-41 41 Lenting, P.J, J.A van Mourik, and K Mertens (1988), “The life cycle of coagulation factor VIII in view of its structure and function” Blood, 92(11):p.398396 42 Liu Q, Nozari G, Sommer SS (1998) "Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in haemophilia A".Blood; 92(4):1458-9 43 Liu, M.L, et al (2000), “Hemophilia factor VIII C1- and C2- doain missense mutations and their modeling to the 1.5-angstrom human C2 -domain crystal structure” Blood, 96(3):p.979-87 44 Mansouritorghabeh H (2015 May), “Clinical and laboratory approaches to hemophilia” Iran J Med Sci.;40(3):194-205 45 Ma GC, et al (2008 Jul) " The spectrum of the factor (F8) defects in Taiwanese patients with haemophilia A" Hemophilia ;14(4):787-95 46 Mulder K, et al (2004 Oct) "The target joint" Haemophilia ;10 Suppl 4:152-6 47 Peyvandi, et al (2012 Apr)" Coagulation factor activity and clinical bleeding severity in rare bleeding disorders: results from the European Network of Rare Bleeding Disorders" J Thromb Haemost ;10(4):615-21 48 Radic CP, Rossetti LC, Larripa IB, De Brasi CD.( 2005) "Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR " Clin Chem; 51(7): 154-158 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM vi 49 Rossiter JP, et al (1994 Jul) "Factor VIII gene inversions causing severe hemophilia A originate almost exclusively in male germ cells" Hum Mol Genet.; 3(7):1035-9 50 Schwarz J, Astermark J, Menius ED, Carrington M, Donfield SM, Gomperts ED, Nelson GW, Oldenburg J, Pavlova A, Shapiro AD, Winkler CA, Berntorp E Hemophilia Inhibitor Genetics Study Combined Cohort (2013) “F8 haplotype and inhibitor risk: results from the Hemophilia Inhibitor Genetics Study (HIGS) Combined Cohort” Haemophilia.;19(1):113-8 51 Stevens RF (1999), “The history of haemophilia in the royal families of Europe” Br J Haematol;105(1):25–32 52 Tagariello G, Belvini D, Salviato R, Are A, De Biasi E, Goodeve A, Davoli P (2000) " Experience of a single Italian center in genetic counseling for hemophilia: from linkage analysis to molecular diagnosis" Haematologica 85(5):525-9 53 Tuddenham EG, et al (1994 Sep) " Haemophilia A: database of nucleotide substitutions, deletions, insertions and rearrangements of the factor VIII gene, second edition" Nucleic Acids Res ;22(17):3511-33 54 Van de Water NS, et al (1995 Jan) " Factor VIII gene inversions in severe hemophilia A patients" Pathology; 27(1):83-5 55 Vehar, G.A., et al, (1984) “Structure of human factor VIII” Nature, 312(5992): p.337-342 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM a PHỤ LỤC Phụ lục 1: Các bước tiến hành tách chiết DNA từ máu ngoại vi QIAamp® DNA Kit Bước 1: Cho vào tube 1.5 ml: 20µl QIAGEN protease (Proteinase K) 200 µl máu tồn phần (vortex mẫu đều) Vortex 15 giây 200 µl Buffer AL Bước 2: Ủ tube 560C /10 phút Spin giây để loại bỏ bọt khí Bước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 – 100%) vào tube, vortex 15 giây, spin giây Bước 4: Chuyển hỗn hợp sang cột lọc chứa tube ml Quay ly tâm 8000 vòng/ phút Bước : Chuyển cột sang tube 2ml mới, cho 500 µl Buffer AW1 vào cột lọc Quay ly tâm 8000 vòng/ phút Bước 6: Chuyển cột sang tube 2ml mới, cho 500 µl Buffer AW2 vào cột lọc Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM b Quay ly tâm 14.000vòng/ phút Bước 7: Chuyển cột sang tube 2ml mới, quay ly tâm 14.000vòng/ phút Bước 8: Chuyển sang cột thu 1.5 ml Thêm 200 µl Buffer AE, ủ nhiệt phòng phút Quay ly tâm 8.000 vòng / phút Bước 9: Thu DNA bảo quản nhiệt độ - 200C Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM c Phụ lục 2: Các bước tiến hành tách chiết DNA từ máu ngoại vi Phenol/ Chloroform Bước 1: Cho vào tube 1.5ml 0.5 ml máu toàn phần ủ đá 10 phút 0.5 ml dung dịch Lysis Buffer Bước 2: Ly tâm 8.000 vòng/ phút/ 40C, loại bỏ dịch nổi, thu cặn, lặp lại lần Bước : Cho vào 0.5 ml dung dịch K ly tâm 8.000 vòng / 10 phút/ 0C, loại bỏ dịch nổi, thu cặn Bước 4: Cho 0.5 mL Lysis buffer; 12.5 μL SDS 10%; 10 μL proteinase K, sau ủ 2h 560C Bước 5: Cho 0.5 ml phenol: Chloroform: isoamyl, ly tâm 10000 vòng/ 10 phút/ 40C , hỗn hợp chia làm phần , hút lớp dịch chứa DNA Bước 6: Cho 0.5 mL chloroform: isoamyl, ly tâm mẫu 10.000 vòng/10 phút/ 40C, hút lấy phần dịch Bước 7: Tủa DNA mL cồn tuyệt đối, cho thêm 50 μl sodium acetat, để lạnh -200C/4 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM d Bước 8: Ly tâm 13.000 vòng/ 20 phút/4 0C, đổ dịch phía trên, thu tủa Bước 9: Rửa tủa cồn 700C Tủa DNA hoà tan 30 μl nước tinh khiết Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM e Phụ lục 3: Các bước tiến hành tách chiết DNA từ máu ngoại vi kit Promega: Bước 1:Bổ sung 2ml mẫu máu vào 6ml Cell Lysis Lắc nhẹ tube -6 lần Bước 2:Ủ t0 phòng 10 phút (lắc nhẹ -6 lần) Ly tâm 2000 vòng /5 phút Bước 3:Đổ dịch nhẹ nhàng (V:10-20µl), cạ nhanh ống lên giá để tan cặn lắng Bước 4: Thêm 2ml Cell Lysis Lắc nhẹ tube – lần Ly tâm 2000 vòng /5 phút Bước 5: Đổ dịch nhẹ nhàng, đậy nắp, cạ nhanh ống giá để tan cặn lắng Bước 6: Thêm 2ml Nuclei Lysis, mix nhẹ Bước 7: Thêm 15µl Proteinase K, mix nhẹ ủ 560C/1 Bước 8: Thêm 670 µl Protein Precipitation, vortex kỹ/ 20 giây Ly tâm 2000 vòng / phút Bước 9: Chuyển dịch sang tube chứa 2ml Isopropanpol, lắc nhẹ Bước 10: Dùng pipette tách lấy DNA, chuyển sang tube chứa 1ml Ethanol 70% Bước 11: Ly tâm 2000 vòng /1 phút, loại dịch để khô tube Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM f Bước 12:Thêm 150 µl dung dịch DNA Rehydration Ủ 650C/1h Bước 13: Kiểm tra độ tinh DNA lưu mẫu 20C – 80C Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM g Phụ lục 4: Danh sách bệnh nhân tham gia nghiên cứu STT Tên bệnh nhân Năm sinh Giới tính Trần Như Q 2001 Nam Lê Huỳnh Thái B 1998 Nam Nguyễn Văn H 2005 Nam Trần Hoàng A 2000 Nam Nguyễn Minh T 2003 Nam Hồ Huỳnh V 2001 Nam Vĩnh K 2006 Nam Nguyễn Nhật H 1999 Nam Lâm Huỳnh B 2005 Nam 10 Hoàng Văn D 2001 Nam 11 Nguyễn Hậu N 2002 Nam 12 Lê Minh T 2006 Nam 13 Lý Văn N 1999 Nam 14 Huỳnh Văn D 2001 Nam 15 Dương Hoài N 2005 Nam 16 Trần Bảo A 2006 Nam 17 Đỗ Văn T 2007 Nam 18 Thái Văn K 2003 Nam 19 Dương Xuân N 2001 Nam 20 Huỳnh Như Hồng T 2001 Nam 21 Lâm Văn Y 2005 Nam 22 Nguyễn Thiện N 2011 Nam 23 Lê Trần V 2009 Nam 24 Nguyễn Văn M 2005 Nam 25 Lý Hoài X 2007 Nam Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại Học Y Dược TP HCM h 26 Hoàng Văn K 2004 Nam 27 Tăng Như H 2007 Nam 28 Lê Như V 2002 Nam 29 Nguyễn Trần Như P 2006 Nam 30 Trần Văn H 2007 Nam 31 Lê Văn Q 2005 Nam 32 Lê Minh H 2004 Nam Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... PTN Phát đột biến đảo đoạn Ứng dụng kỹ thuật Inverse PCR phân mẫu DNA chứng xác định tích đột biến đảo đoạn intron 22 bị đột biến đảo đoạn intron 22 BN Có đột biến đảo Khơng có đột biến đoạn intron. .. Hemophilia A phát đột biến gen FVIII 101 bệnh nhân Trong có 51 bị đột biến đảo đoạn intron 22, bệnh nhân bị đảo đoạn intron 1, bệnh nhân bị đoạn gen 44 bệnh nhân mang đột biến điểm Trong đột biến phát. .. PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN ĐẢO ĐOẠN INTRON 22 GÂY BỆNH HEMOPHILIA A? ?? với mục tiêu sau: Áp dụng quy trình Inverse – PCR (Rossetti 2005) phát đột biến đảo đoạn intron 22 gen FVIII bệnh nhân mắc bệnh Hemophilia