ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Nhóm các mẫu DNA chứng :
Mẫu DNA chứng được chiết tách từ nam giới đã được phân tích gen FVIII tại khoa Di truyền, bệnh viện Maastricht, Hà Lan Nghiên cứu bao gồm mẫu bệnh nhân có đột biến đảo đoạn intron 22 và mẫu người bình thường không mang đột biến gen FVIII.
Trong khoảng thời gian từ tháng 8/2015 đến tháng 7/2016, nghiên cứu đã thu thập được 32 mẫu bệnh nhân được chẩn đoán mắc Hemophilia A thể nặng.
Các bệnh nhân này được chọn từ kết quả chẩn đoán dựa trên các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như sau:
+ Bệnh nhân dễ bị xuất huyết, khi đã xuất huyết thì máu khó đông.
+ Xuất huyết có thể tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ.
+ Đặc điểm xuất huyết là đám bầm máu dưới da, chảy máu ở khớp.
+ Xét nghiệm thời gian đông máu kéo dài.
+ Bệnh nhân chấp nhận tham gia nghiên cứu.
+ Các bệnh nhân bị bệnh giảm tiểu cầu bẩm sinh hay mắc phải.
+ Bệnh nhân mắc bệnh lý rối loạn đông máu di truyền bẩm sinh khác.
+ Bệnh nhân mắc bệnh rối loạn đông máu mắc phải: thiếu vitamin K, kháng đông lưu hành, DIC, suy gan.
+ Bệnh nhân không hợp tác tham gia nghiên cứu.
Mỗi bệnh nhân đã chẩn đoán Hemophilia A thể nặng được lấy 2 ml máu chống đông bằng EDTA.
2.1.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu:
Trung tâm Y sinh học phân tử - ĐH Y Dược TPHCM.
Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu
- Pipetman P10, P20, P200, P1000 và đầu tip vô trùng tương ứng.
- Thiết bị điện di (khay, lược…).
- Găng tay vô trùng, khẩu trang, áo choàng.
- Ống lấy máu chống đông EDTA
- Máy tính kết nối với máy NanoDrop 2000
- Máy luân nhiệt Eppendorf 6325: nhân bản DNA.
- Máy ly tâm lạnh Eppendorf 5417R
- Hệ thống phân tích và lưu giữ kết quả điện di GelDoc-It® Imager của hãng UVP
- Tủ an toàn sinh học cấp II Esco AC2.
- Máy ly tâm thường Sigma.
- Máy lắc IKA model : HS 260B
2.2.3 Phần mềm và các trình tự sử dụng:
Phần mềm trực tuyến OligoAnalyzer 3.1 trên trang web của IDT.
2.2.4 Hóa chất và các sinh phẩm:
Máu ngoại vi được xử lý bằng chất chống đông EDTA 1.5 ng/ml trong tube 2ml và được ly trích trong vòng 24 giờ.
2.2.4.2 Hóa chất Tách chiết DNA từ máu ngoại vi:
1 Wizard® Genomic DNA Purification kit: Hãng Promega - USA
- Các thành phần khác ( không kèm theo bộ Kit) : Ethanol 70%, Proteinase K
2 QIAamp® DNA kit:Hãng QIAGEN – Đức
- Buffers: AL, AW1, AW2, AE.
- Dung dịch chloroform: isoamyl ( tỷ lệ 24 : 1)
2.2.4.3 Hóa chất tinh sạch DNA:
- Dung dịch Phenol : Chloroform (tỉ lệ 1:1)
2.2.4.4 Hóa chất cắt DNA bằng enzyme BclI:
2.2.4.5 Hóa chất nối DNA (Ligation):
2.2.4.6 Hóa chất thực hiện kỹ thuật PCR:
- Mồi có trình tự thiết kế từ phần mềm LightScanner Primer do công ty IDT tổng hợp.
- Takara Taq Polymerase (5U/àl) của hóng Takara.
2.2.4.7 Hóa chất điện di trên gel Agarose:
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu hàng loạt ca, cách lấy mẫu thuận tiện.
2.3.2 Sơ đồ các bước nghiên cứu:
Quá trình nghiên cứu gồm 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1 của nghiên cứu áp dụng quy trình Inverse – PCR theo phương pháp Rossetti (2005) nhằm phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen FVIII ở bệnh nhân mắc bệnh Hemophilia A thể nặng trong điều kiện phòng thí nghiệm.
- Giai đoạn 2: Ứng dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán đột biến gen FVIII
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
2.3.3 Áp dụng quy trình Inverse – PCR (Rossetti 2005) phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đột biến đảo đoạn intron 22 có thể được phát hiện bởi các phương pháp Southern Blot, Long distance – PCR và Inverse- PCR Southern –Blot được
Bệnh nhân (BN) Hemophilia A thể nặng (nồng độ yếu tố VIII < 1%) Ứng dụng kỹ thuật Inverse PCR phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 ở những BN này
Kỹ thuật Inverse PCR xác định đột biến đảo đoạn intron 22.
Phát hiện được đột biến đảo đoạn trên mẫu DNA chứng đã xác định bị đột biến đảo đoạn intron 22
Có đột biến đảo đoạn intron 22
Không có đột biến đảo đoạn intron 22 Á p dụ n g q u y tr ìn h In v er se – P C R ( R o s- se tti 2 00 5) đ iề u k iệ n
Phương pháp thu thập số liệu và phân tích kết quả là tiêu chuẩn vàng trong việc phát hiện các đột biến gây bệnh và người mang gen bệnh, nhưng tốn nhiều thời gian (khoảng 1 tuần) và công sức, đồng thời có thể gây hại do sử dụng hóa chất phóng xạ Long-PCR là một phương pháp nhanh hơn và tiện lợi hơn so với Southern Blot trong việc phát hiện đảo đoạn intron 22, nhưng lại nhạy cảm với chất lượng PCR và yêu cầu sản phẩm PCR có kích thước dài (khoảng 10kb – 12kb), cần bổ sung chất ổn định enzyme DNA polymerase và hóa chất tinh khiết cao Ngược lại, Inverse-PCR phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 nhanh hơn và cho kết quả ổn định hơn mà không phụ thuộc vào chất lượng DNA như Long-PCR Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng quy trình I-PCR của tác giả Rossetti để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22.
Thu nhận 2 ml máu ngoại vi và chứa trong chất chống đông EDTA nắp xanh dương, mẫu máu được bảo quản trong tủ mát 4 0 C.
2.3.3.2 Khảo sát kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi:
Máu ngoại vi sau khi được thu nhận sẽ tiến hành tách chiết DNA bằng phương pháp:
Tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng QIAamp® DNA Kit.
Tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng Phenol/ Chloroform.
Tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng Promega Kit.
Quy trình thực hiện từng phương pháp tách chiết được trình bày rõ ở phục lục 1, phụ lục 2 và phụ lục 3.
Sản phẩm ly trích được kiểm tra độ tinh sạch bằng máy NanoDrop 2000, với mẫu DNA được đưa lên bộ phận nhận mẫu và đọc kết quả Chỉ những mẫu có độ tinh sạch cao trong khoảng 1.8 – 2.0 (đo ở bước sóng 260/280) mới được tiến hành điện di để kiểm tra sự nguyên vẹn trên gel 0.8% trong 1 giờ.
2.3.3.3 Kiểm tra các đoạn mồi:
Trình tự mồi của phản ứng Inverse – PCR xác định đột biến đảo đoạn intron
Bảng 2.1 : Trình tự các mồi sử dụng trong phản ứng Inverse PCR
Primer Trình tự GenBank Sản phẩm
487 bp (ID / IU): Bình thường
559 bp (ED / IU): Đảo đoạn intron
Cỏc mồi được pha ở nồng độ 5àM và được bảo quản ở t 0 = -20 0 C.
Kiểm tra tiêu chuẩn của các đoạn mồi :
Mồi sẽ được kiểm tra bằng phần mềm OligoAnalyzer 3.1 của IDT ® để xác định các giá trị ∆G của cấu trúc thứ cấp, chiều dài, tỷ lệ %GC và nhiệt độ nóng chảy (Tm).
2.3.3.4 Khảo sát phản ứng Inverse- PCR:
Thực hiện phản ứng Inverse – PCR
Phương pháp Inverse-PCR bao gồm ba bước chính: đầu tiên, DNA được cắt bằng enzyme giới hạn BclI; sau đó, các đoạn DNA được nối lại với nhau; cuối cùng, DNA vòng được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại bằng các mồi đặc biệt IU, ID và ED Kết quả cho thấy, người mang kiểu gen bình thường sẽ có sản phẩm khuếch đại 487bp từ cặp mồi IU và ID, trong khi người mang đột biến đảo đoạn intron 22 sẽ cho sản phẩm 559bp từ cặp mồi IU và ED (Hình 2.1).
STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
1 DNA genome (1500ng/àl) Vừa đủ (1.5 àgDNA)
Tinh sạch sản phẩm cắt bằng Phenol /Chloroform
STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
Vortex, ly tâm 15000 vòng /5 phút (Thực hiện trên máy ly tâm lạnh ở 4 0 C).
Tiếp tục hút lớp dịch nổi và tủa bằng Ethanol tuyệt đối, CH3COONa, hòa tan sản phẩm trong 20àl nước cất.
STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
Sản phẩm nối được tinh sạch bằng phương pháp Phenol/chloroform, sau đó tủa bằng Ethanol tuyệt đối và CH3COONa Cuối cùng, hòa sản phẩm trong 20 μl nước cất, thực hiện các bước tinh sạch tương tự như đối với sản phẩm cắt.
Sau khi tinh sạch sản phẩm nối, nồng độ DNA và độ tinh sạch được đo trên máy NanoDrop 2000 ở bước sóng A260/A280 Chỉ những sản phẩm nối có độ tinh sạch từ 1.8 đến 2.0 mới đủ điều kiện để tham gia vào phản ứng PCR tiếp theo.
- Đảm bảo tất cả các hóa chất được đặt trong khay lạnh trong khi tiến hành phản ứng PCR.
- Enzym Taq polymerase được cho vào sau cùng.
- Thực hiện kỹ thuật trong tủ an toàn sinh học.
- Mỗi phản ứng PCR cú thể tớch 15àl gồm cỏc thành phần:
Thành phần phản ứng Inverse – PCR:
STT Thành phần phản ứng Thể tớch (àl)
Sản phẩm nối Mồi ID Mồi ED Mồi IU Nước cất
Chu trình nhiệt: Biến tính ở 98 o C trong 5 phút, sau đó là 40 chu kỳ gồm
98 o C trong 10 giây, 58 o C trong 20 giây, 72 o C trong 30 giây, và giai đoạn kết thúc gồm 72 o C trong 2 phút.
Các sản phẩm nhân bản từ phản ứng Inverse PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 2% Các băng phân tách được nhuộm bằng ethidium bromide, và kích thước của các sản phẩm được xác định so với thang chuẩn 1kb plus (Invitrogen) cùng với mẫu chứng dương và âm để phục vụ cho việc chẩn đoán Kết quả cho thấy người bình thường có kích thước sản phẩm 487bp, trong khi người mang đảo đoạn intron có sự khác biệt.
22 cho băng có kích thước 559bp.
Hình 2.1 Phản ứng Inverse – PCR phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22
Khảo sát phản ứng PCR: o Khảo sát nhiệt độ bắt cặp:
Khảo sát nhiệt độ gắn mồi bằng cách chạy gradient nhiệt độ gắn mồi, nhiệt độ gắn mồi được chia tự động trên máy luân nhiệt Eppendorf 6325 từ 55 0 C/
58 0 C/61 0 C/63 0 C cùng với các điều kiện của phản ứng Inverse- PCR đã được nêu ở trên, riêng chu kỳ nhiệt được thực hiện như sau:
Biến tính mẫu DNA ở 98 o C trong 5 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ với nhiệt độ 98 o C trong 10 giây, sau đó là 55 o C, 58 o C, 61 o C, và 63 o C trong 20 giây, và 72 o C trong 30 giây Giai đoạn kết thúc được thực hiện ở 72 o C trong 2 phút Sản phẩm PCR được bảo quản tạm thời ở 4 o C Nghiên cứu này nhằm khảo sát lượng DNA khuôn mẫu trong phản ứng Inverse-PCR.
Khảo sát lượng DNA mẫu được thực hiện bằng phản ứng PCR với các lượng DNA khuôn mẫu khác nhau (100/200/300/400/500ng) Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel Agarose 2% sử dụng đệm TBE 0.5X, chạy kèm với thang DNA 1kb plus để so sánh kích thước Quá trình điện di diễn ra trong 30 phút với hiệu điện thế 100V, sau đó chụp ảnh gel để ghi lại kết quả.
Hình 2.2 Thang DNA 1kb plus (Invitrogen)
2.3.4 Ứng dụng quy trình đã được khảo sát để thực hiện phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen FVIII của bệnh nhân mắc Hemophilia A thể nặng.
Sau khi thu nhận, máu ngoại vi được bảo quản trong ống chống đông EDTA nắp xanh dương và cần được ly trích trong vòng 24 giờ Quá trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi được thực hiện bằng bộ kít Promega, chi tiết cụ thể có trong phần phụ lục 3.
Sau khi tách chiết, độ tinh sạch của phân tử DNA được kiểm tra bằng phương pháp đo quang ở bước sóng A260/A280 Chỉ những mẫu có độ tinh sạch cao từ 1.8 đến 2.0 mới được phép tiếp tục các thí nghiệm nhằm xác định đột biến đảo đoạn intron 22.
Thực hiện kỹ thuật Inverse- PCR với các điều kiện đã được khảo sát để xác định đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen FVIII.
Điện di kiểm tra kích thước sản phẩm trên gel Agarose 2% và chụp ảnh gel.
3.1 Những đặc điểm chung về đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh nhân Hemo- philia A thể nặng):
3.1.1 Đặc điểm về nhóm tuổi được phát hiện bệnh:
Trong nghiên cứu về 32 bệnh nhân được chẩn đoán mắc Hemophilia A thể nặng, dựa trên kết quả lâm sàng và cận lâm sàng, chúng tôi đã phân tích sự phân bố nhóm tuổi của các bệnh nhân được phát hiện.
Bảng 3.1 Phân bố mẫu nghiên cứu theo nhóm tuổi
Nhóm tuổi được phát hiện bệnh Số lượng bệnh nhân Tỉ lệ phần trăm
3.1.2 Đặc điểm về giới tính:
Tất cả 32 bệnh nhân được chẩn đoán Hemophilia A thể nặng tham gia nghiên cứu đều là nam giới chiếm tỉ lệ 100%.
Hình 3.2 Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc Hemophilia A thể nặng theo giới tính
3.2 Kết quả áp dụng quy trình Inverse – PCR (Rossetti 2005) phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trong điều kiện phòng thí nghiệm.
3.2.1 Kết quả khảo sát phương pháp tách chiết DNA:
Tách chiết DNA tổng số bằng các phương pháp QIAamp® DNA kit, Phenol/Chloroform, Promega Kit (quy trình thực hiện được nêu rõ trong phụ lục 1,
Sau khi tách chiết, sản phẩm DNA có độ tinh sạch từ 1.8 đến 2.0 sẽ được điện di trên gel Agarose 0.8% trong thời gian 1 giờ để kiểm tra sự nguyên vẹn của nó.
Hình 3.3 : Kết quả khảo sát phương pháp tách chiết
Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng (1): Tách bằng QIAamp® DNA kit; Giếng 2: Tách bằng Phenol/Chloroform; Giếng 3: Tách bằng Promega Kit
Thực hiện so sánh kết quả 3 phương pháp tách chiết DNA sau khi điện di trên gel Agarose 0.8% và nhuộm bằng Ethidium bromide như sau:
KẾT QUẢ
Những đặc điểm chung về đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh nhân Hemophilia
3.1.1 Đặc điểm về nhóm tuổi được phát hiện bệnh:
Trong một nghiên cứu về 32 bệnh nhân mắc Hemophilia A thể nặng, việc chẩn đoán được thực hiện dựa trên kết quả lâm sàng và cận lâm sàng, cho thấy sự phân bố nhóm tuổi của các bệnh nhân được phát hiện.
Bảng 3.1 Phân bố mẫu nghiên cứu theo nhóm tuổi
Nhóm tuổi được phát hiện bệnh Số lượng bệnh nhân Tỉ lệ phần trăm
3.1.2 Đặc điểm về giới tính:
Tất cả 32 bệnh nhân được chẩn đoán Hemophilia A thể nặng tham gia nghiên cứu đều là nam giới chiếm tỉ lệ 100%.
Hình 3.2 Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc Hemophilia A thể nặng theo giới tính
Kết quả áp dụng quy trình Inverse – PCR (Rossetti 2005) phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trong điều kiện phòng thí nghiệm
3.2.1 Kết quả khảo sát phương pháp tách chiết DNA:
Tách chiết DNA tổng số bằng các phương pháp QIAamp® DNA kit, Phenol/Chloroform, Promega Kit (quy trình thực hiện được nêu rõ trong phụ lục 1,
Sau khi tách chiết, sản phẩm DNA có độ tinh sạch từ 1.8 đến 2.0 sẽ được điện di trên gel Agarose 0.8% trong vòng 1 giờ để kiểm tra sự nguyên vẹn của nó.
Hình 3.3 : Kết quả khảo sát phương pháp tách chiết
Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng (1): Tách bằng QIAamp® DNA kit; Giếng 2: Tách bằng Phenol/Chloroform; Giếng 3: Tách bằng Promega Kit
Thực hiện so sánh kết quả 3 phương pháp tách chiết DNA sau khi điện di trên gel Agarose 0.8% và nhuộm bằng Ethidium bromide như sau:
Sản phẩm điện di DNA genome sử dụng bộ kit Promega mang lại băng điện di nguyên vẹn, rõ ràng và sắc nét với độ sáng cao Phương pháp này cho kết quả tách chiết DNA tốt hơn so với hai phương pháp khác, bao gồm kit QIAamp® DNA và phương pháp Phenol/Chloroform.
3.2.2 Kết quả kiểm tra các đoạn mồi:
Kiểm tra các thông số lý thuyết của mồi:
Các mồi sẽ được kiểm tra các thông số lý thuyết như chiều dài, nhiệt độ nóng chảy (Tm 0C), tỷ lệ GC, khả năng tạo cấu trúc kẹp tóc, khả năng tự bắt cặp và khả năng hình thành hetero-dimer thông qua phần mềm Oligo Analyzer (IDT, Hoa Kỳ) Kết quả của các kiểm tra này được tóm tắt trong bảng 3.2 và bảng 3.3.
Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra thông số mồi của các mồi ID, ED, IU.
Tên mồi Trình tự mồi
Bảng 3.3 Giá trị ΔG cấu trúc selfdimer và Hetero-dimer của mồi ID, ED, IU
(ΔG,kcal.mol -1 ) ID ED IU
Giá trị ΔG giao nhau giữa hàng ngang và hàng dọc của cùng một mồi thể hiện giá trị ΔG cấu trúc Self-dimer của mồi khảo sát Ngược lại, giá trị ΔG giao nhau giữa hàng ngang và hàng dọc của hai mồi khác nhau phản ánh giá trị ΔG cấu trúc Hetero-dimer của hai mồi khảo sát.
Kết quả kiểm tra mồi:
Kích thước: các mồi có chiều dài 19 – 21 bp.
Nhiệt độ biến tính Tm: cao nhất 53.5 0 C; thấp nhất 51.5 0 C.
%GC: các mồi có %GC nằm trong từ 38% – 53%.
- Cấu trúc hairpin: Tất cả các mồi đều hình thành cấu trúc thứ cấp trong nội bộ mồi và giá trị ΔG đều lớn hơn -6kcal mol -1
- Cấu trúc Self- dimer: Các cấu trúc self- dimer phân tích bằng OligoAnalyzer đều có giá trị ΔG lớn hơn -10kcal.mol -1
- Cấu trúc Hetero- dimer: Qua kiểm tra thì giá trị ΔG của các cặp mồi đều lớn hơn -9 kcal mol -1
3.2.3 Kết quả khảo sát phản ứng Inverse - PCR
3.2.3.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp:
Thực hiện khảo sát nhiệt độ bắt cặp ở 55 o C/58 o C/61 o C/63 o C cùng với một số điều kiện như sau:
Thành phần phản ứng gồm 0.1 μl Taq Takara, 2 μl buffer 10X, 1.5 μl dNTPs, 1 μl chứng dương, 0.5 μl mồi ID, 0.5 μl mồi ED, 0.5 μl mồi IU, bổ sung nước cất cho đủ thể tích 15 μl.
Chu trình nhiệt: Biến tính ở 98 o C trong 5 phút, sau đó là 40 chu kỳ gồm
98 o C trong 10 giây; 55/58/61/63 o C trong 20 giây; 72 o C trong 30 giây, và giai đoạn kết thúc gồm 72 o C trong 2 phút.
Hình 3.4 : Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp.
Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm; Giếng 1: Nhiệt độ 55 o C; Giếng 2: Nhiệt độ 58 o C; Giếng 3: Nhiệt độ 61 o C; Giếng 4: Nhiệt độ 63 o C
Ở bốn nhiệt độ khảo sát (55 o C, 58 o C, 61 o C, 63 o C), nhiệt độ 58 o C cho kết quả điện di tốt nhất với băng đặc hiệu kích thước 559 bp của chứng dương, hiển thị băng sản phẩm sáng rõ mà không có sản phẩm phụ.
3.2.3.2 Kết quả khảo sát lượng DNA khuôn mẫu của phản ứng Inverse –PCR:
Khảo sát lượng DNA sản phẩm nối của bệnh nhân Hemophilia A đã được thực hiện bằng phản ứng Inverse-PCR với các nồng độ 100, 200, 300, 400 và 500 ng, kèm theo một số điều kiện thí nghiệm nhất định.
Thành phần phản ứng gồm 0.1 μl Taq Takara, 2 μl buffer 10X, 1.5 μl dNTPs, 100/200/300/400/500ng sản phẩm nối, 0.5 μl mồi ID, 0.5 μl mồi
ED, 0.5 μl mồi IU, bổ sung nước cất cho đủ thể tích 15 μl.
Chu trình nhiệt: Biến tính ở 98 o C trong 5 phút, sau đó là 40 chu kỳ gồm
98 o C trong 10 giây; 58 o C trong 20 giây; 72 o C trong 30 giây, và giai đoạn kết thúc gồm 72 o C trong 2 phút.
Hình 3.5 Kết quả khảo sát lượng DNA khuôn mẫu của phản ứng Inverse-PCR
Giếng T: Thang 1 Kb Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm (nước cất); Giếng 1: 100 ng;
Giếng 2: 200ng; Giếng 3: 300ng; Giếng 4: 400ng; Giếng 5: 500ng;
Khảo sát lượng DNA khuôn mẫu trong phản ứng Inverse-PCR cho thấy khi sử dụng 500ng DNA đích, sản phẩm điện di đạt kích thước mục tiêu 559bp với độ sáng rõ ràng, không xuất hiện băng phụ.
Ứng dụng kỹ thuật Inverse –PCR đã được khảo sát để phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen FVIII ở bệnh nhân mắc Hemophilia A thể nặng
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phân tích 32 bệnh nhân nam mắc Hemophilia A thể nặng Tất cả các bệnh nhân được chọn dựa trên kết quả chẩn đoán từ các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình.
Kết quả phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 ở những bệnh nhân nam mắc Hemophilia A thể nặng nói trên:
3.3.1 Kết quả tách chiết DNA từ máu ngoại vi ở 32 bệnh nhân thể nặng :
Sau khi tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng kit Promega, mỗi bệnh nhân sẽ được kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 260nm/280nm Chỉ những mẫu có độ tinh sạch từ 1.8 đến 2.0 mới đủ tiêu chuẩn để thực hiện các kỹ thuật tiếp theo.
Bảng 3.4 Kết quả đo nồng độ DNA và độ tinh sạch DNA sau khi tách chiết máu ngoại vi của nhóm bệnh nhân
Nồng độ DNA (ng/μl) Độ tinh sạch (A 260 /A 280 )
Nồng độ DNA (ng/μl) Độ tinh sạch
Kết quả mật độ quang của tất cả các mẫu DNA từ bệnh nhân sau khi tách chiết từ máu ngoại vi cho thấy giá trị ở bước sóng 260nm/280nm dao động từ 1.77 đến 1.97 Nồng độ DNA thu được sau quá trình tách chiết nằm trong khoảng 530 đến 1240 ng/µl.
3.3.2 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA sau khi thực hiện phản ứng nối bằng T4 DNA Ligase ở 32 bệnh nhân thể nặng:
Bảng 3.5 Kết quả đo nồng độ DNA và độ tinh sạch DNA sau thực hiện phản ứng nối bằng T4 DNA Ligase của nhóm bệnh nhân
Nồng độ DNA (ng/μl) Độ tinh sạch (A 260 /A 280 )
Nồng độ DNA (ng/μl) Độ tinh sạch (A 260 /A 280 )
Kết quả mật độ quang của tất cả các mẫu DNA bệnh nhân sau phản ứng nối cho thấy giá trị đo ở bước sóng 260nm/280nm dao động từ 1.81 đến 1.99 Nồng độ DNA thu được sau khi tách chiết nằm trong khoảng từ 73 đến 251 ng/µl.
3.3.3 Kết quả phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 trên nhóm bệnh nhân Hemophilia A thể nặng bằng kỹ thuật Inverse- PCR:
Kỹ thuật Inverse-PCR đã được thực hiện trên nhóm bệnh nhân với các điều kiện PCR được khảo sát, bao gồm nhiệt độ bắt cặp mồi là 58 oC và lượng DNA khuôn mẫu là 500ng Sản phẩm nhân bản từ Inverse-PCR được điện di trên gel Agarose 2%, với các băng phân tách được nhuộm bằng ethidium bromide Kích thước của sản phẩm khuếch đại được phân tích bằng cách so sánh với thang chuẩn 1kb plus (Invitrogen) và mẫu đối chứng.
Trong nghiên cứu về Hemophilia A thể nặng, 32 bệnh nhân đã được chẩn đoán và xét nghiệm bằng kỹ thuật Inverse – PCR Kết quả cho thấy có 15 bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22, trong khi 17 bệnh nhân không có đột biến này.
Kết quả điện di sản phẩm Inverse - PCR ở bệnh nhân HA-19 mang đột biến đảo đoạn intron22 :
Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR có đột biến đảo đoạn intron 22
Giếng (T): Thang DNA 1kb plus; Giếng (-): Chứng âm( nước cất); Giếng HA19: Bệnh nhân HA-19; Giếng BT: Người bình thường; Giếng (+): Chứng dương
Kết quả điện di sản phẩm Inverse - PCR ở bệnh nhân HA-21 không mang đột biến đảo đoạn intron22 :
Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR không mang đột biến đảo đoạn intron 22
Giếng (T): Thang DNA 1kb plus; Giếng (-): Chứng âm (nước cất); Giếng (+): Chứng dương; Giếng BT: Người bình thường; Giếng HA21: Bệnh nhân HA-21
Nghiên cứu cho thấy trong số 32 bệnh nhân nam mắc Hemophilia A thể nặng, 15 bệnh nhân (chiếm 47%) có đột biến đảo đoạn intron 22, được xác định qua kỹ thuật Inverse – PCR với băng điện di kích thước 559bp Ngược lại, 17 bệnh nhân còn lại không mang đột biến này, thể hiện qua băng điện di kích thước 487bp.
Bệnh nhân mang đột biến đảo đoạn intron 22
Bệnh nhân không mang đột biến đảo đoạn intron 22
Hình 3.8 Phân bố tỷ lệ đột biến được phát hiện đảo đoạn intron 22 và không phát hiện được đảo đoạn intron 22 ở 32 bệnh nhân Hemophilia A thể nặng.
Bệnh Hemophilia A là một rối loạn đông máu di truyền do thiếu hụt yếu tố đông máu FVIII, dẫn đến chảy máu ở nhiều vị trí trên cơ thể, đặc biệt là tại các khớp, gây đau đớn và có thể dẫn đến tàn tật hoặc tử vong Mặc dù Việt Nam đã có những tiến bộ trong chăm sóc và điều trị, nhưng việc tìm ra phương pháp điều trị hiệu quả cho Hemophilia A vẫn là một thách thức lớn Chẩn đoán sớm và xác định nguyên nhân gây bệnh là vấn đề cấp thiết, bởi nếu bệnh nhân được phát hiện và điều trị đúng cách, họ có thể sống và làm việc như người khỏe mạnh, đồng thời hạn chế các biến chứng không mong muốn.
Kỹ thuật sinh học phân tử đã mang lại thành công lớn trong chẩn đoán bệnh, đặc biệt là các bệnh di truyền, nhờ vào khả năng xác định vị trí đột biến với độ tin cậy cao Việc ứng dụng phân tích gen trong nghiên cứu bệnh Hemophilia A, cùng với hiểu biết về cơ chế bệnh học phân tử và cấu trúc gen FVIII, đã giúp xác định vị trí đột biến trên gen này Điều này không chỉ mở ra cơ hội chẩn đoán sớm và phát triển phương pháp điều trị hiệu quả cho Hemophilia A, mà còn có ý nghĩa quan trọng trong tư vấn di truyền, giảm tỷ lệ mắc bệnh và gánh nặng cho cộng đồng và xã hội.
BÀN LUẬN
Những đặc điểm chung về đối tượng nghiên cứu (nhóm bệnh nhân Hemophilia
4.1.1 Đặc điểm về tuổi được phát hiện bệnh:
Trong một nghiên cứu về 32 bệnh nhân mắc Hemophilia A thể nặng, việc chẩn đoán dựa trên kết quả lâm sàng và cận lâm sàng cho thấy sự phân bố độ tuổi phát hiện bệnh như sau.
- Từ 05 tuổi đến 11 tuổi: 16/32 chiếm tỉ lệ 50%
- Từ 12 tuổi đến 15 tuổi: 12/32 chiếm tỉ lệ 37.5%
- Từ 16 tuổi đến 18 tuổi: 4 /25 chiếm tỉ lệ 12.5%
Theo thống kê, bệnh nhân Hemophilia A thể nặng thường được phát hiện ở độ tuổi từ 5 đến 11, chiếm tỷ lệ cao nhất Điều này hợp lý vì đây là giai đoạn trẻ em hiếu động, thích khám phá và tìm tòi Nếu không có sự kiểm soát từ cha mẹ, các hoạt động của trẻ dễ dẫn đến thương tổn và chảy máu bất thường, khiến gia đình đưa trẻ đi khám và phát hiện bệnh.
Sự thay đổi về độ tuổi phát hiện bệnh Hemophilia A ở trẻ em có thể liên quan đến khả năng tự bảo vệ của trẻ, sự hiểu biết của phụ huynh về chăm sóc sức khỏe, và điều kiện sống của từng gia đình Đặc biệt, bệnh nhân Hemophilia A thể nặng thường được phát hiện sớm hơn do có tần suất chảy máu tự phát cao hơn, khiến họ dễ dàng nhận ra triệu chứng và tìm đến cơ sở y tế kịp thời Điều này cho thấy tầm quan trọng của việc nâng cao nhận thức về bệnh và cải thiện điều kiện chăm sóc sức khỏe cho trẻ em trong cộng đồng.
Một nghiên cứu tại Pháp đã phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến độ tuổi chẩn đoán bệnh Hemophilia, cung cấp thông tin dịch tễ học quan trọng Kết quả cho thấy trong số 559 bệnh nhân sinh ra từ năm 1980 đến 1994, độ tuổi trung bình được chẩn đoán là 7.7 tháng, trong khi bệnh nhân thể nặng có độ tuổi chẩn đoán trung bình là 5.8 tháng.
Vào những thập niên 80 và đầu thập niên 90, với sự phát triển của mức sống và cơ sở vật chất y tế tại Pháp, bệnh Hemophilia đã được chú trọng và chẩn đoán sớm Việc chẩn đoán sớm có ý nghĩa quan trọng trong điều trị, phòng ngừa và tư vấn di truyền cho bệnh nhân Hemophilia A Tuy nhiên, không phải quốc gia nào cũng thực hiện được điều này, đặc biệt là ở những nước kém phát triển hoặc đang phát triển, nơi cơ sở vật chất còn hạn chế và ngân sách cho ngành y tế chưa cao.
Tất cả bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều là nam giới mắc Hemophilia A thể nặng, điều này phù hợp với đặc điểm di truyền của bệnh Hemophilia A là rối loạn đông máu di truyền liên quan đến nhiễm sắc thể X, khiến nam giới dễ mắc hơn nữ giới Nam giới chỉ cần một gen đột biến để biểu hiện bệnh, trong khi nữ giới có hai nhiễm sắc thể X, nên cần hai gen đột biến mới có thể phát bệnh.
Khi một người mang gen bệnh Hemophilia A, nhiễm sắc thể X thứ hai vẫn có khả năng tổng hợp yếu tố VIII, dẫn đến việc phụ nữ dị hợp tử thường không biểu hiện bệnh nhưng có nguy cơ di truyền gen bệnh cho con trai cao Nguy cơ mắc bệnh phụ thuộc vào tình trạng gen của người mẹ; chỉ trong trường hợp cả cha và mẹ đều mang gen bệnh, con gái mới có khả năng biểu hiện bệnh, tuy nhiên, tình huống này rất hiếm Do đó, trong gia đình có tiền sử Hemophilia A, đặc biệt là thể nặng, tất cả bé trai sinh ra từ mẹ lành mang gen bệnh hoặc mẹ bị bệnh cần được kiểm tra sớm để phát hiện đột biến gen FVIII Nghiên cứu của Rossiter JP và cộng sự cũng cho thấy đột biến intron 22 thường gây Hemophilia A thể nặng chủ yếu xuất hiện ở nam giới.
Bệnh Hemophilia A, đặc biệt là thể nặng, gây ra nhiều thiệt thòi cho trẻ em, ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của các em và ngăn cản họ trải nghiệm những điều tuyệt vời như những đứa trẻ bình thường Việc chẩn đoán sớm và xác định chính xác dạng đột biến là rất quan trọng, không chỉ giúp tìm ra nguyên nhân gốc rễ của bệnh mà còn hỗ trợ bác sĩ lâm sàng xây dựng phác đồ điều trị và dự phòng hiệu quả Thêm vào đó, tư vấn di truyền có thể giúp giảm thiểu các biến chứng nghiêm trọng mà bệnh Hemophilia A gây ra.
Kỹ thuật sinh học phân tử phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen FVIII
Đối với đột biến đảo đoạn có nhiều kỹ thuật xác định như:
Long distance – PCR (LD- PCR)
Mỗi phương pháp đều có ưu nhược điểm riêng khi thực hiện.
Phương pháp Southern Blot, được phát triển bởi Lakich và cộng sự vào năm 1993, là kỹ thuật đầu tiên dùng để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22, nhưng tốn nhiều thời gian và yêu cầu sử dụng chất phóng xạ, gây ảnh hưởng đến sức khỏe của kỹ thuật viên Mặc dù Southern Blot cho kết quả chính xác và đặc hiệu cao, nhưng những nhược điểm về thời gian và độc hại đã thúc đẩy nhu cầu tìm kiếm các phương pháp thay thế hiệu quả hơn Năm 1998, Liu Q và cộng sự đã giới thiệu kỹ thuật LD-PCR, cho phép phát hiện đảo đoạn intron 22 nhanh chóng và tiện lợi hơn, với quy trình thực hiện đơn giản trong một ống tube, giúp hạn chế lây nhiễm và đảm bảo độ chính xác Kỹ thuật Long distance-PCR đã được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán đột biến đảo đoạn intron 22, bao gồm cả việc sử dụng trong hướng dẫn phân tích cấu trúc phân tử của bệnh Hemophilia A tại Anh bởi Keeney và cộng sự, cũng như trong nghiên cứu của Habart vào năm 2005.
Kỹ thuật Long distance-PCR (LD-PCR) mặc dù có nhiều ưu điểm, nhưng gặp khó khăn trong việc khuếch đại đoạn DNA dài hơn 10 kb, phụ thuộc vào quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi và chất lượng DNA sau khi tách chiết Để khắc phục nhược điểm này, Rossetti và cộng sự đã phát triển kỹ thuật Inverse-PCR vào năm 2005, cho thấy hiệu quả cao trong việc phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 Kỹ thuật I-PCR đơn giản, nhanh chóng và không sử dụng chất phóng xạ độc hại như Southern Blot, đồng thời không yêu cầu khuếch đại DNA dài như LD-PCR Vì vậy, nghiên cứu này áp dụng quy trình Inverse-PCR của Rossetti để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 và khảo sát quy trình này trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhằm chẩn đoán bệnh nhân Hemophilia A thể nặng.
trong điều kiện phòng thí nghiệm
Quy trình kỹ thuật tách chiết DNA tổng số
Tách chiết DNA là bước đầu tiên quan trọng trong chẩn đoán bệnh lý di truyền bằng kỹ thuật sinh học phân tử Việc tách chiết DNA đạt độ tinh sạch cao và không bị đứt gãy hay tạp nhiễm sẽ đảm bảo độ chính xác cho các phản ứng tiếp theo.
Sau khi tách chiết, các mẫu DNA được kiểm tra độ tinh sạch bằng máy NanoDrop 2000 thông qua phương pháp đo OD Kết quả cho thấy độ tinh sạch nằm trong khoảng từ 1.8 đến 2.0, điều này là điều kiện tiên quyết để tiến hành các bước tiếp theo.
Trong nghiên cứu này, kỹ thuật tách chiết DNA được sử dụng 3 phương pháp :
Tách chiết DNA bằng QIAamp® DNA kit
Tách chiết DNA bằng phương pháp Phenol/Chloroform
Tách chiết DNA bằng Promega Kit
Thực hiện so sánh kết quả 3 phương pháp tách chiết DNA sau khi điện di trên gel Agarose 0.8% và nhuộm bằng Ethidium bromide như sau:
Bộ kit QIAamp® DNA là giải pháp tách chiết DNA sử dụng cột với màng lọc silica, mang lại kết quả có độ tinh sạch cao Tuy nhiên, nhược điểm của kit này là kích thước mảnh DNA genome sau khi tách chiết chỉ đạt khoảng trên 10kb và lượng DNA thu được không nhiều, điều này được thể hiện rõ qua kết quả điện di của sản phẩm DNA genome từ QIAamp®.
DNA kit tương đối thấp hơn và không sáng bằng DNA genome tách bằng
Phương pháp tách chiết DNA bằng Phenol/Chloroform là một kỹ thuật tương đối đơn giản, nhưng hiệu quả phụ thuộc vào kỹ năng của kỹ thuật viên và có nguy cơ nhiễm protein/phenol vào sản phẩm DNA Ngoài ra, DNA tách chiết dễ bị đứt gãy nếu thao tác không cẩn thận Kết quả điện di DNA genome từ phương pháp này thể hiện độ sáng cao, cho thấy lượng DNA tách chiết lớn, nhưng hình ảnh sản phẩm lại bị smear, không có băng rõ ràng.
Phương pháp tách chiết DNA genome bằng Promega Kit vượt trội hơn so với hai phương pháp khác nhờ vào độ nguyên vẹn cao của sản phẩm DNA, lượng DNA tách chiết lớn và độ tinh sạch vượt trội Sản phẩm điện di DNA genome từ Promega Kit thể hiện băng nguyên vẹn, sắc nét và độ sáng cao, chứng minh rằng DNA tách chiết đạt chất lượng tốt, đủ điều kiện sử dụng làm mẫu cho các phản ứng tiếp theo.
Kiểm tra các đoạn mồi
Kết quả kiểm tra các cặp mồi trong phản ứng Inverse-PCR nhằm xác định đột biến đảo đoạn intron 22 của gen FVIII cho thấy tất cả các cặp mồi đều đạt tiêu chuẩn theo các thông số đã quy định (Bảng 3.2 và Bảng 3.3).
Kích thước: các mồi có chiều dài 19 – 21 bp.
Nhiệt độ biến tính Tm: không chênh lệch nhiều giữa 3 mồi (cao nhất 53.5; thấp nhất 51.5) thuận lợi cho việc chọn nhiệt độ biến tính chung cho phản ứng PCR.
Mồi ID có tỷ lệ %GC là 38.1, thấp hơn mức tối ưu 40% - 60%, nhưng sự chênh lệch này không đáng kể Với chiều dài 21bp và nhiệt độ biến tính Tm tương đương với các mồi khác, mồi ID vẫn có khả năng hoạt động hiệu quả, bắt cặp đặc hiệu và khuếch đại với hiệu suất cho phép.
Cấu trúc hairpin của các mồi tạo thành cấu trúc thứ cấp bên trong, nhưng giá trị ΔG luôn lớn hơn -6 kcal mol^-1 Những cấu trúc có ΔG lớn hơn -3 kcal mol^-1 dễ bị phá vỡ thành mạch thẳng Do đó, cấu trúc thứ cấp này không phải là vấn đề đối với các mồi đã được thiết kế.
Cấu trúc self-dimer được phân tích bằng OligoAnalyzer cho thấy giá trị ΔG lớn hơn -10 kcal/mol, điều này có nghĩa là chúng sẽ không ảnh hưởng đến quá trình PCR.
- Cấu trúc Hetero- dimer: Qua kiểm tra thì giá trị ΔG của các cặp mồi đều lớn hơn -9 kcal mol -1 nên sẽ không ảnh hưởng đến quá trình PCR
Vậy các thông số lý thuyết của mồi đã được kiểm tra và đảm bảo yêu cầu của phản ứng PCR.
Kết quả khảo sát phản ứng Inverse – PCR
4.3.3.1 Kết quả khảo sát nhiệt độ bắt cặp:
Kết quả khảo sát cho thấy ở cả 4 nhiệt độ bắt cặp đều có băng sản phẩm kích thước 559 bp của chứng dương Tuy nhiên, ở nhiệt độ 55 o C, ngoài băng sản phẩm mục tiêu còn xuất hiện băng sản phẩm kí sinh trên 600 bp Khi nhiệt độ tăng lên 58 o C, băng sản phẩm kí sinh không còn, nhưng khi đạt 61 o C trở lên, độ sáng của băng sản phẩm mục tiêu giảm rõ rệt, cho thấy hiệu suất khuếch đại thấp Do đó, nhiệt độ 58 o C được chọn là tối ưu, đảm bảo độ đặc hiệu của phản ứng PCR và đạt được lượng sản phẩm PCR cao.
4.3.3.2 Kết quả khảo sát lượng DNA khuôn mẫu của phản ứng Inverse –PCR:
Kết quả khảo sát cho thấy tất cả các giếng đều sản xuất DNA với kích thước mục tiêu 559 bp Hiệu suất PCR tăng lên khi lượng DNA sản phẩm nối vào phản ứng Inverse-PCR tăng, với độ sáng băng sản phẩm tăng dần từ 100ng đến 500ng Theo khuyến cáo của Rossetti, lượng DNA sản phẩm nối tối ưu cho phản ứng Inverse-PCR nên nằm trong khoảng 200-400ng.
Kết quả điện di cho thấy rằng việc sử dụng 500 ng DNA sản phẩm nối không ảnh hưởng đến quá trình PCR, mà còn tăng cường hiệu suất của phản ứng Inverse-PCR Do đó, lượng DNA sản phẩm nối được chọn làm khuôn mẫu cho phản ứng Inverse-PCR là 500 ng.
Ứng dụng kỹ thuật Inverse –PCR đã được khảo sát để phân tích đột biến đảo đoạn intron 22 trên gen FVIII ở bệnh nhân mắc Hemophilia A thể nặng
Kết quả đo độ tinh sạch DNA từ 32 mẫu bệnh nhân cho thấy các dung dịch DNA tách chiết từ máu có độ tinh sạch tương đối cao Chỉ có hai mẫu HA-04 và HA-27 có tỷ lệ OD260/OD280 thấp dưới 1,8, nhưng sự chênh lệch này không đáng kể Vì vậy, chúng tôi quyết định tiếp tục sử dụng những mẫu này cho nghiên cứu.
Mặc dù sử dụng thể tích mẫu máu tương đương trong quy trình tách chiết, nồng độ DNA giữa các mẫu vẫn có sự chênh lệch do lượng bạch cầu – nguồn gDNA trong máu của mỗi người khác nhau Tuy nhiên, nồng độ DNA của các mẫu nằm trong khoảng 530 – 1240 ng/µl, đảm bảo đáp ứng yêu cầu nồng độ DNA cao cho việc xác định chẩn đoán đảo đoạn intron 22.
4.4.2 Kết quả phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22 trên 32 bệnh nhân được chẩn đoán Hemophilia A thể nặng:
Sau khi thực hiện kỹ thuật I-PCR trong điều kiện tối ưu (nhiệt độ bắt cặp 58 o C và 500ng DNA mẫu) trên 32 bệnh nhân Hemophilia A thể nặng, kết quả cho thấy 15 bệnh nhân (47%) có đột biến đảo đoạn intron 22, trong khi 17 bệnh nhân (53%) không mang đột biến này Tỷ lệ bệnh nhân chưa phát hiện đột biến có thể do nghiên cứu chỉ áp dụng một phương pháp I-PCR mà chưa kết hợp với nhiều phương pháp khác Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới nhằm phát hiện các đột biến khác gây Hemophilia A thể nặng, đồng thời tạo điều kiện cho việc nghiên cứu người lành mang gen bệnh thông qua phân tích phả hệ và gen.
Có 15 bệnh nhân được xác định có đột biến đảo đoạn intron 22 trên tổng số
Trong nghiên cứu này, 32 bệnh nhân được chẩn đoán mắc Hemophilia A thể nặng, trong đó có 15 bệnh nhân (chiếm 47%) có kết quả lâm sàng và cận lâm sàng phù hợp Tỷ lệ này tương đồng với một nghiên cứu quốc tế từ 22 phòng thí nghiệm chẩn đoán ở 14 quốc gia, cho thấy tỷ lệ đột biến đảo đoạn intron 22 ở bệnh nhân thể nặng dao động từ 40% đến 50%.
Nghiên cứu này so sánh tỷ lệ đột biến trong bệnh Hemophilia A thể nặng với các nghiên cứu trước đây Theo Lakick và cộng sự (1993), tỷ lệ đột biến đạt khoảng 45% trong nhóm bệnh nhân Hemophilia A thể nặng khi sử dụng kỹ thuật Southern Blot Năm 2003, H Poláková và cộng sự ở Slovakia phát hiện 10 trên 16 bệnh nhân có đột biến đảo đoạn intron 22, chiếm 62.5% khi áp dụng kỹ thuật LD-PCR Năm 1995, nghiên cứu của Van de Water NS và cộng sự cho thấy 12 trên 27 bệnh nhân Hemophilia A thể nặng có đột biến đảo đoạn intron 22, tương ứng 44% Tại Đài Loan, nghiên cứu của Ma GC và cộng sự chỉ ra tỷ lệ này là 63.2%, với 12 bệnh nhân có đột biến trong số 19 bệnh nhân thể nặng.
Nghiên cứu của Jenkins và cộng sự năm 1994 trên 85 bệnh nhân nặng cho thấy có 40 bệnh nhân bị đột biến đảo đoạn intron 22, với tỷ lệ đột biến đạt 47%.
Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến đảo đoạn 22 ở bệnh nhân Hemophilia A thể nặng khá cao, với sự khác biệt về điều kiện y tế, ngân sách và mức độ tuyên truyền giữa các quốc gia Điều này dẫn đến sự đa dạng trong cỡ mẫu và nhận thức của bệnh nhân về bệnh Do đó, chẩn đoán xác định Hemophilia A thể nặng thông qua kỹ thuật sinh học phân tử tập trung vào việc tìm kiếm đột biến đảo đoạn intron 22 là cần thiết.