ứng dụng kỹ thuật pcr và fish nghiên cứu biến đổi adn ở một số thể bệnh lơxêmi và hemophilia a

Bộ y tế Báo cáo kết nghiên cứu đề tµi cÊp bé øng dơng kü tht PCR vµ fish nghiên cứu biến đổi adn số thể bệnh lơ xê mi hemophilia A Chủ nhiệm đề tài : PGS TS Phạm Quang vinh Cơ quan chủ trì đề tài : viện huyết học - truyền máu TW 6872 22/5/2008 hà nội - 2007 Bộ y tế Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp ứng dụng kỹ thuật PCR fish nghiên cứu biến đổi adn số thể bệnh lơ xê mi hemophilia A Chủ nhiệm đề tài : PGS TS Phạm Quang vinh Cơ quan chủ trì đề tài : viện huyết học - truyền máu TW Cơ quan quản lý : Bé Y tÕ Thêi gian thùc hiÖn : Tõ tháng 10 năm 2003 đến tháng năm 2007 Tổng kinh phí thực đề tài : 260 triệu đồng Trong ®ã : Kinh phÝ SNKH : 260 triƯu ®ång hà nội - 2007 Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Tên đề tài: ứng dụng kỹ thuật PCR FISH nghiên cứu biến đổi ADN số thể bệnh Lơ xê mi Hemophilia A” : PGS TS Ph¹m Quang vinh Chđ nhiƯm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài : viện huyết học - truyền máu TW Cơ quan quản lý đề tài : Bộ Y tế Th ký đề tài : ThS Võ Thanh Bình Phó chủ nhiệm đề tài Những ngời thực : Đơn vị : - Khoa Miễn dịch Di truyền - ViƯn Hut häc - Trun m¸u TW - Khoa TÕ bào - Viện Huyết học - Truyền máu TW - Khoa lâm sàng bệnh máu viện huyết học - truyền máu TW - Khoa điều trị hemophilia viện huyết học - truyền máu TW - Phòng Sinh hoá, Khoa Di trun - Sinh häc ph©n tư ViƯn VƯ sinh Dịch tễ TW Cá nhân : 10 11 12 PGS TS PGS TS CN CN ThS ThS ThS ThS CN BSNT TS TS Phạm Quang Vinh Bạch Khánh Hoà Nguyễn Quốc Cờng Trần Công Hoàng Nguyễn Thị Mai Võ Thanh Bình Ngun Quang Tïng Vị Minh Ph−¬ng Ngun Minh Ph−¬ng Ngun Thiên Lữ Nguyễn Hạnh Phúc Nguyễn Hoài Giang - Viện HH-TM TW - ViÖn HH-TM TW - ViÖn HH-TM TW - ViÖn HH-TM TW - ViÖn HH-TM TW - ViÖn HH-TM TW - ViÖn HH-TM TW - ViÖn HH-TM TW - ViÖn HH-TM TW - ViÖn HH-TM TW - ViÖn VSDT TW - Viện VSDT TW Các đề tài nhánh Thời gian thực đề tài : Từ tháng 10/2003 đến tháng 6/2007 chữ viết tắt AML ( Acute Myeloid leukemia) : Lơ xê mi cấp dòng tuỷ ALL ( Acute Lymphocytic leukemia) : Lơ xê mi cấp dòng lympho APL ( Acute promyelocytic leukemia) : Lơ xê mi cấp thể tiền tuỷ bào FISH ( Fluorescense In situ Hybridization) : Kü thuËt lai huúnh quang MDS ( Myelodysplastic syndrome) : Héi chøng rèi lo¹n sinh tủ MLL ( Mixed Lineage leukemia) : Lơ xê mi cấp lai tủ - lympho PCR (polymerase chain reaction) : Ph¶n ứng khuếch đại gen RT - PCR (Reverse Trans-criptase : Phản ứng khuếch đại gen đảo ngợc Polymerase chain reaction) RFLPs ( Restriction Fragment Length Polymorphism) : Kü thuËt c¾t ADN enzym hạn chế Mục lục Phần A Tóm tắt kết bật đề tài Trang Mở đầu Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Bất thờng vật chất di truyền bệnh máu 1.1.1 BÊt th−êng di truyÒn bÈm sinh 1.1.2 Bất thờng di truyền mắc phải Bất thờng di trun vµ Hemophilia 1.2.1 Giíi thiƯu bƯnh Hemophilia 1.2.2 Di trun ph©n tư u tè VIII 1.2.3 Di trun bƯnh Hemophilia 1.2 1.3 1.2.4 C¸c tỉn thơng di truyền bệnh nhân Hemophilia A 10 1.2.5 Các phơng pháp phát ngời mang gen bệnh Hemophilia 11 Bất thờng di truyền lơ xê mi 17 1.3.1 Cơ chế sinh lơ xê mi 17 1.3.2 Hệ thống gen tế bào liên quan đến ung th 17 1.3.3 Hoạt hoá oncogene bệnh máu ác tÝnh 25 1.3.4 BÊt ho¹t gen øc chÕ u 32 1.3.5 Vai trò phát bất thờng di truyền nghiên cứu bệnh lơ xê mi 33 Chơng Đối tợng phơng pháp nghiên cứu 36 2.1 Xác định ngời mang gen Hemophilia 36 2.1.1 Đối tợng 36 2.1.2 Phơng pháp nghiên cứu 36 Nghiên cứu bất thờng gen bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh 40 2.2.1 Đối tợng 40 2.2.2 Phơng pháp nghiên cứu 40 2.2 2.3 Xác định gen hỗn hợp AML/ETO lơ xê mi cấp M2 gen PML/RAR M3 48 2.3.1 Đối tợng 48 2.3.2 Phơng pháp 49 Chơng Kết 54 3.1 Hemophilia 3.1.1 Tỉ lệ dị hợp tử với dạng đa hình ADN có điểm cắt với enzym BclI intron 18 HindIII intron 19 gen yếu tố VIII 54 54 3.1.2 Xác định ngời phụ nữ mang gen bệnh dựa vào phân tích kết PCR-RFLPs với BclI 58 Phát gen hỗn hợp BCR/ABL lơ xê mi hạt kinh 60 3.2.1 Ph¸t hiƯn b»ng kü tht PCR 60 3.2.2 Ph¸t hiƯn gen hỗn hợp BCR/ABL kỹ thuật FISH 64 Phát gen hỗn hợp ETO/AML M2 PML/RAR bệnh nhân M3 66 3.2 3.3 Chơng Bàn luận 68 4.1 Tính đa hình gen Hemophilia xác định ngời mang gen bệnh 68 4.1.1 Tỉ lệ dị hợp tử PCR-RFPs với vị trí cắt đặc hiệu BclI HindIII 68 4.1.2 áp dụng PCR-RFLPs với BclI vào chẩn đoán ngời mang gen Hemophilia A 70 4.2 Gen hỗn hợp BCR/ABL lơ xê mi hạt kinh 72 4.3 Kết phân tích gen ETO/AML RAR/PML 75 Kết luận 77 Tài liệu tham khảo 79 Phần A Tóm tắt kết bật đề tài Hoàn cảnh đời mục tiêu đề tài : Các bất thờng ADN nguyên nhân nhiều bƯnh bÈm sinh, cã tÝnh di trun mµ hai bƯnh thờng gặp chuyên khoa Huyết học - Truyền máu Thalassemia Hemophilia Đà có nhiều công trình nghiên cứu nớc giới gen bệnh gây Thalassemia Một số kết đà đợc ứng dụng chẩn đoán sớm chẩn đoán trớc sinh Trong bất thờng ADN Hemophilia phức tạp đa dạng, hậu bệnh nặng nề Trên giới đà có nhiều nghiên cứu gen bệnh, phát ngời lành mang gen bệnh để có biện pháp đề phòng Việt Nam công tác quản lý, chăm sóc ngời bệnh Hemophilia cha thật tốt Tính chất di truyền, đặc điểm gen di truyền cha đợc nghiên cứu; cha có biện pháp hiệu xác định ngời lành mang gen bệnh Bên cạnh số biến đổi ADN tế bào gốc tạo máu đa đến hậu rối loạn phát triển gây bệnh máu ác tính Mỗi loại bất thờng gen có bệnh cảnh khác Vì năm 2001 Tổ chức Y tế Thế giới đà đa cách xếp loại bệnh máu quan lympho Theo cách xếp loại với lơ xê mi cấp cần xem xét trớc hết có mặt hay không biến đổi gen đặc trng Để xác dịnh gen cần thực kỹ thuật xét nghiƯm sinh häc ph©n tư ViƯn Hut häc - Trun máu nhiều năm đà xây dựng Trung tâm Hemophilia tổ chức hoạt động tuyên truyền phát hiện, chăm sóc, điều trị bệnh Hàng năm số bệnh nhân Viện quản lý tăng lên Trong năm qua Viện đà triển khai kỹ thuật chẩn đoán đại nh xác định CD màng tế bào, phân tích bất thờng nhiễm sắc thể lơ xê mi Viện sở đầu ngành chuyên khoa Huyết học - Truyền máu cần triển khai kỹ thuật sinh học phân tử áp dụng chẩn đoán ngời mang gen hemophilia, chẩn đoán trớc sinh với bệnh Đồng thời Viện phải tổ chức sớm việc ứng dụng kỹ thuật chẩn đoán phân loại theo quốc tế Vì đơn vị nghiên cứu ®· ®Ị xt ®Ị tµi nh»m mơc ®Ých : Sử dụng kỹ thuật PCR xác định bất thờng ADN bệnh nhân hemophilia tiến tới tìm ngời lành mang gen bƯnh TriĨn khai kü tht PCR vµ FISH việc phát số gen đặc trng bệnh lơ xê mi cấp, lơ xê mi hạt kinh Kết bật đề tài: Triển khai đợc kỹ thuật PCR FISH Viện Huyết học Truyền máu Trung ơng - Đa kỹ thuật đại vào áp dụng đào tạo đợc đội ngũ cán kỹ thuật thực đợc qui trình kỹ thuật xét nghiệm PCR, FISH làm sở cho việc ứng dụng phơng pháp sinh học phân tử chẩn đoán bƯnh - øng dơng dơng kü tht PCR - RFLPs xác định ADN đa hình gen yếu tố VIII Bớc đầu xác định tỷ lệ dị hợp tử dạng đa hình ADN cắt enzym BclI 48% phụ nữ bình thờng Đây tỷ lệ có ý nghĩa để giúp phát ngời mang gen Hemophilia A - ứng dụng đợc kỹ thuật PCR kỹ thuật FISH để xác định gen hỗn hợp ABL/BCR lơ xê mi kinh dòng tủy ứng dụng kỹ thuật RT PCR phát gen AML/ETO RAR/PML lơ xê mi cấp dòng tủy, tiến tới góp phần phân loại lơ xê mi Xây dựng đợc qui trình sử dụng kỹ thuật PCR xác định ngời lành mang gen gia đình bệnh nhân Hemophilia A đà áp dụng để phát đợc ngời lành mang gen bệnh, xác định ngời không mang gen bệnh Đào tạo: - Một luận văn nội trú (đà bảo vệ) - Làm sở luận án Nghiên cứu sinh Mở đầu Bệnh máu bệnh liên quan đến tế bào máu, quan tạo máu hệ thống cầm, đông máu Tế bào máu quan tạo máu hoạt động, sinh sản, bệnh hoá thực chất trình hoạt động hệ thống gen - protein Các yếu tố tham gia vào cầm, đông máu protein - sản phẩm tế bào thông qua hoạt động gen - protein Nh vậy, dù thuộc loại bệnh có liên quan đến hoạt động gen - protein Các kỹ thuật sinh học đặc biệt kỹ thuật sinh học phân tử phát triển đà có đóng góp việc chẩn đoán nhiều bệnh phát nhiều tác nhân gây bệnh Những bệnh máu liên quan đến vật chất di trun cã thĨ lµ bÈm sinh: hƯ thèng gen đà bị tổn thơng thể đợc hình thành, tế bào thể mang gen bÊt th−êng Thc nhãm nµy cã rÊt nhiỊu bƯnh nhng loại bệnh hay gặp thalassemia hemophilia Cịng cã thĨ bÊt th−êng vËt chÊt di trun x¶y tế bào gốc tạo máu tạo tế bào cháu mang bất thờng Có nhiều bất thờng gây rối loạn phát triển tế bào mà điển hình bệnh ác tính quan tạo máu Trên giới nghiên cứu phát bÊt th−êng vËt chÊt di trun (ADN) c¸c bƯnh thalassemia, hemophilia bệnh ác tính hệ tạo máu đà đợc thực trung tâm nớc phát triển, phát triển Kết nghiên cứu đợc ứng dụng chẩn đoán phòng ngừa bệnh Hemophilia, Thalassemia Riêng bệnh máu, Tổ chức Y tế Thế giới đà đề nghị xếp loại trớc hết cø vµo bÊt th−êng di trun [21] ë ViƯt Nam đà có số nghiên cứu vật chất di trun bƯnh Thalassemia Tuy nhiªn ch−a cã nghiªn cøu øng dơng kü tht sinh häc ph©n tư viƯc xác định đột biến (bất thờng ADN) bệnh nhân Hemophilia lơ xê mi Nhằm triển khai áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu bệnh máu, thực đề tài với mục tiêu: ứng dụng kỹ thuật PCR xác định bất thờng ADN bệnh nhân hemophilia A góp phần phát ngời mang gen bệnh ứng dụng kỹ thuật PCR và FISH phát bất thờng ADN số thể bệnh lơ xê mi cấp lơ xê mi hạt kinh tỉ lệ dị hợp tử tăng lên tới 0.71 liên kết tơng quan marker [58]; đó, theo khuyến cáo mạng lới labo di truyền hemophilia Anh quốc BclI Hind III có liên kết tơng quan với [42] Sự khác có nguyên nhân khác biệt chủng tộc ngời hai nghiên cứu Điều gợi ý cần tiếp tục tìm hiểu marker Hind III sâu để xem xét áp dụng vào việc chẩn đoán ngời mang gen hemophilia A Việt Nam 4.1.2 áp dụng PCR-RFLPs với BclI vào chẩn đoán ngời mang gen Hemophilia A: Trong số 22 ng−êi mĐ ch¾c ch¾n mang gen cã 12 ng−êi có thông tin với BclI (chiếm tỉ lệ 55%) phân tích 27 thành viên gia đình đợc xét nghiệm để chẩn đoán ngời mang gen Phân tích kết bảng 3.5 Gia đình số 1: - Ngời mẹ mang gen dị hợp tử (+/-) - Ngời bố dơng tính (+) - Con trai bị bệnh dơng tính (+) - Con gái dị hợp tử (+/-) Vì trai bị bệnh nên alen (+) alen mang gen bƯnh Do trai chØ nhËn nhiƠm s¾c thĨ X từ mẹ nên alen (+) mẹ alen mang gen bệnh, alen (-) alen bình thờng Con gái nhËn alen tõ bè vµ alen tõ mĐ ng−êi bè cã alen (+) v× vËy alen (+) cã nguån gèc tõ bè, alen (-) cã nguån gèc tõ mẹ, alen theo phân tích alen bình thờng Vậy gái gia đình ngời không mang gen bệnh Hemophilia A Phân tích gia đình thø hai: Ng−êi trai mang gen (-) nªn alen (-) ngời mẹ alen bệnh Phân tích ngời bố gái thấy bố mang gen (-) gái đồng hợp tử alen âm (-/-) alen (-) nhận từ mẹ Mà nh phân 71 tích alen (-) ngời mẹ gen bệnh nh ngời gái ngừoi mang gen Phân tích tơng tự khẳng định gia đình tơng tự gia đình có ngời gái mang gen bệnh, gia đình khác gái không mantg bệnh Hemophilia A Kết biểu đồ 3.1 cho thấy ngời gái III2 dù cđa ng−êi mĐ mang gen bƯnh nh−ng ph©n tÝch bảng cho biết không mang bệnh Nh vậy, số ngời gái gia đình hemophilia A có ngời đợc xác định mang gen (ngời gái gia đình số gia đình số 6) ngời đợc xác định không mang gen (ở gia đình lại) Trong số ngời có ngời có thai ngời xa cha lấy đợc mẫu ngời lại đợc xét nghiệm định lợng yếu tố VIII:C Kết quả: ngời mang gen có nồng độ yếu tố VIII thấp 40 % (con gia đình số 2) 47% (gia đình số 6), ngời lại có nồng độ yếu tố VIII:C > 50 %, (kết đợc trình bày bảng 3.5) Nồng độ yếu tố VIII ngời mang gen bệnh thấp ngời bình thờng nhận xét nhiều tác giả [59] Theo kết phân tích bảng 3.5, có ngời đợc xác định mang gen bệnh, ngời không mang gen số ngời có khả mang gen đợc chẩn đoán Nh thu thập đủ mẫu để phân tích khả chẩn đoán PCR-RFLP với BclI 100% ngời có thông tin Bên cạnh tiến hành định lợng yếu tố VIII: C cho ngời để có thông số tham khảo Kết có 5/5 mẫu ngời không mang gen có nồng độ yếu tố VIII:C > 50%, đa số nồng độ yếu tố VIII:C cao; Trong mẫu ngời đợc chẩn đoán mang gen có nồng độ yếu tố VIII:C thấp: 47% 40% Kết phù hợp với lí thuyết nồng độ yếu tố VIII:C phụ nữ mang gen thờng thấp (chiếm khoảng 50%) Điều chứng tỏ kết chẩn đoán đáng tin cậy 72 Trong số 12 gia đình có thông tin với BclI có gia đình cha thu thập đủ mẫu thành viên điều kiện xa Nh vậy, số hạn chế nh: áp dụng đợc gia đình có mẹ ngời chắn mang gen bệnh, cần phân tích mẫu máu nhiều thành viên gia đình PCR-RFLPs với BclI phơng pháp chẩn đoán tình trạng mang gen hemophilia A có hiệu quả, rẻ tiền không phức tạp Về nhợc điểm thứ hai đợc nêu trên, việc cần phân tích mẫu máu nhiều thành viên số điều kiện, đặc biệt thành viên gia đình sống xa địa lí khó khăn cần khắc phục Một nghiên cứu Thái Lan đà rằng, mẫu máu để phân tích PCR-RFLPs bảo quản nhiệt độ thờng vòng 10 ngày mà không ảnh hởng tới kết xét nghiệm [49] Nh điều kiện xa, ngời cần xÐt nghiƯm cã thĨ nhê y tÕ c¬ së lÊy mẫu máu theo hớng dẫn vận chuyển đến trung tâm xét nghiệm mà không cần phải có mặt trực tiếp Bên cạnh đó, phơng pháp cho phép khẳng định đợc tình trạng mang gen ngời phụ nữ, u điểm trội so với phơng pháp chẩn đoán ngời mang gen phân tích nồng độ yếu tố đông máu Hơn nữa, phơng pháp này, thầy thuốc sử dụng để chẩn đoán tr−íc sinh cho thai nhi, mét c«ng viƯc cã ý nghĩa nhân văn cao phần quan trọng công tác điều trị dự phòng Tóm lại thấy sử dụng quy trình: (1) xác định ngời mẹ mang gen phân tích phả hệ, (2) tìm mẹ dị hợp tử với gen đa hình Sau (3) xét nghiệm PCR, phân tích ADN đa hình với BclI bệnh nhân, bố mẹ bệnh nhân ngời cần xét nghiệm để xem ngời có mang gen bệnh hay không Và với cách phân tích dùng điểm đa hình khác để phối hợp tìm ngời mang gen bệnh theo phơng pháp 4.2 Gen hỗn hợp BCR/ABL lơ xê mi hạt kinh Từ 1982 Heikamp phát hậu chuyển đoạn t(9;22) bệnh 73 nhân lơ xê mi hạt kinh tạo nên gen hỗn hợp BCR/ABL, nhiều nghiên cứu chế sinh bệnh tỷ lệ mang gen đà đợc công bố Gen ABL oneogene, có chuyển đoạn cấu trúc lại NST, gen hoạt động tạo men protein kinase có hoạt tính cao nhiều lần so với bình thờng Hoạt tính cao men đà làm tăng hoạt động truyền tin kích thích phân bào tủy tăng sinh mạnh gây bệnh Các nghiên cứu phân tích gen bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh đà cho thấy hầu hết bệnh nhân có gen hỗn hợp BCR/ABL [23] Heim cho hàng ngàn bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh đợc phân tích NST có khoảng 5% trờng hợp NST Ph1 Trong 5% trờng hợp có tới 1/2 có gen BCR/ABL Kết nghiên cứu bảng 3.6 cho thấy có 80% bệnh nhân có gen BCR/ABL, tỷ lệ cha cao so với nghiên cứu nớc ngoài, đặc biệt kết bảng 3.7 cho thấy có trờng hợp bệnh nhân NST Ph1 nhng đà phát đợc gen bất thờng Điều nói lên có trờng hợp có tổn thơng thực mà không phát đợc phơng pháp tế bào di trun Tr−êng hỵp tû lƯ cã gen ABL/BCR ch−a cao số bệnh nhân cha điển hình Thậm chí có trờng hợp kết PCR âm tiính nhng có NST Ph1 Điều thực chất cha mâu thuẫn nhiều xét nghiệm PCR sử dụng cặp mồi không phát đợc điểm cắt gen BCR khác Trong nghiên cứu đà sử dụng hai cặp mồi tơng ứng với hai điểm cắt b2 b3 gen BCR Tuy nhiên có điểm cắt khác? Kết bảng 3.9 cho thấy bệnh nhân có kết Ph1 âm bệnh nhân có số lợng bạch cầu thấp Heim cho Ph1 thờng không phát đợc bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh không điển hình [23] Khouri I Sử dụng kỹ thuật PCR phát gen hỗn hợp BCR/ABL 29 bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh đợc điều trị interferon, lui bệnh hoàn toàn 74 mặt tế bào di truyền (không tìm thấy NST Ph1) Kết xét nghiệm PCR bệnh nhân cho thấy tất tế bào mang gen bất thờng [29] theo Seckinger víi kü tht PCR cã thĨ ph¸t hiƯn dï tØ lƯ tÕ bµo mang gen lµ 1/100.000 [51], kỹ thuật tế bào di truyền đòi hỏi phân tÝch víi tû lƯ tÕ bµo mang gen > 1% Trờng hợp bệnh nhân có số lợng bạch cầu máu không cao, phơng pháp tế bào di truyền phân tích nhiều tế bào, không phát đợc Ph1 (bệnh nhân số 22 bảng 3.9) Kết cho thấy u điểm kỹ thuật theo Blancato, Seckinger ứng dụng PCR để tìm gen bệnh có ý nghĩa to lớn xác định bệnh tồn d tối thiểu (minimal residual desease =MRD) [10], [51] Vµ nh− vËy tõ sử dụng kỹ thuật PCR để xác định xác mức độ lui bệnh điều trị bệnh lơ xê mi hạt kinh So sánh tỷ lệ điểm cắt gen BCR bảng cho thấy hầu hết bệnh nhân có gen BCR bị cắt sau exon b3 Cã mét sè bƯnh nh©n (6,67%) cã hai quần thể tế bào có điểm cắt khác Tỷ lệ bệnh nhân có điểm cắt gen BCR exon b2 10% Theo Mantzourani bệnh nhân có BCR bị cắt exon b3 tiên lợng nặng [39] Trong đề tài cha so sánh thời gian sống thêm bệnh nhân điểm cắt khác nhau, nhng tỷ lệ có điểm cắt b3 không cao Sử dụng kỹ thuật FISH ®Ĩ ph¸t hiƯn bÊt th−êng gen BCR/ABL cho thÊy : Phát đợc trờng hợp bệnh nhân có chuyển gen (gen bất thờng) Hình ảnh có mặt gen bất thờng, phát nhân tế bào gian kỳ chứng tỏ xác định đợc tế bào không phân chia Theo Blancato, kỹ thuật FISH có độ nhạy cao đơn giản kỹ thuật PCR tách ADN điện di Kỹ thuật FISH đợc áp dụng với tiêu NST metaphase, lúc hình ảnh đầu dò gắn với NST đợc phát nhờ việc gắn chất phát [10] Kết phân tích FISH tiêu metaphase rõ ràng dễ đọc so với kết phân tích NST (bảng 10) cho thấy thực đợc nuôi cấy 75 tế bào có hình ảnh NST Ph1 không điển hình dùng kỹ thuật FISH metaphase để xác định Mặc dù số bệnh nhân đợc phân tích biến đổi ADN kỹ thuật FISH cha nhiều nhng kết đa cịng cho thÊy cã thĨ øng dơng c¸c kü tht việc chẩn đoán theo dõi điều trị bệnh Nh nói, với lơ xê mi hạt kinh sử dụng kỹ thuật khác để phát bất thờng vật chất di trun lµ : - Kü tht tÕ bµo di trun ph¸t hiƯn NST Ph1 - Kü tht FISH (interphase metaphase) phát bất thờng gen BCR/ABL - Kỹ thuật RT PCR để phát gen BCR/ABL điểm cắt gen BCR Các kết hay nhiều kỹ thuật xét nghiệm chắn có giá trị chẩn đoán, theo dõi điều trị tiên lợng cho bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh 4.3 Kết phân tích gen ETO/AML RAR/PML - Đối với lơ xê mi cấp thể M2 : Các nghiên cứu công bố tỷ lệ bệnh nhân có bất thờng NST dạng t(8;21) Theo Heim từ 1968, Kamada đà phát bất thờng NST nhóm C nhóm G bệnh nhân lơ xê mi cấp Năm 1973 Rowley phát t(8;21) [33] Nhiều kết nghiên cứu giới cho thấy bất thờng thể M2 Bất thờng gây chuyển đoạn AML/ETO Theo Kozu gen hỗn hợp ETO/AML định bệnh nhân có t(8;21) [31] Việt Nam, năm 2003 Phạm Quang Vinh thấy tỉ lệ t(8;21) M2 30,16% [5] Kết nghiên cứu bảng 3.11 cho thÊy cã 36% bƯnh nh©n thĨ M2 cã gen hỗn hợp ETO/AML Tỷ lệ không khác so với tỷ lệ t(8;21) theo nghiên cứu Phạm Quang Vinh Một số tác giả nghiên cứu theo kỹ thuật PCR cịng cho thÊy tû lƯ AML1/ETO cao nhÊt ë thĨ M2, th−êng chiÕm tõ 20-40% bƯnh nh©n [33],[15] Block A tổng kết nghiên cứu bất thờng gen lơ xê mi cấp cho thấy t(8;21) gây gen 76 hỗn hợp AML1/ETO bất thờng gặp M2 [11] Trong nghiên cứu cha so sánh đợc với kết phân tích nhiễm sắc thể diễn biến lâm sàng Tuy nhiên, việc sử dụng kỹ thuật PCR phát đợc gen hỗn hợp AML/ETO 29% bệnh nhân M2 cho phép nghĩ tới việc đầu t triển khai xét nghiệm cho bệnh nhân lơ xê mi cấp - Với lơ xê mi cấp thể M3 gen hỗn hợp RAR/PML: Lơ xê mi tiền tủy bào cấp (M3) thể bệnh có diễn biến lâm sàng nặng nề, nhng tiên lợng bệnh lại tốt đợc điều trị phác đồ đủ thuốc Bất thờng NST đặc trng thể bệnh chuyển đoạn t(15;17) Các nghiên cøu kh¸c cho c¸c tû lƯ cã NST t(15;17) khác Tại Hội nghị Quốc tế lần thứ NST lơ xê mi (1979) ngời ta thấy tỷ lệ M3 có t(15; 17) 41% Nhng nghiên cứu Lo Coco (1999), công bố Shumacher (1997) tỷ lệ 87-90% [37],[53] Việt Nam năm 2003 Phạm Quang Vinh thấy có 66,7% bệnh nhân M3 có t(15; 17) [5] Khác với chuyển ®o¹n t(8;21) thĨ M3 dï cã tû lƯ cao t(15;17) nhng phân tích gen hỗn hợp RAR/PML cho thấy có tính chất đa dạng gen Grignani F., Fagioli M nghiên cứu chi tiết thấy để tạo nên gen hỗn hợp RAR/PML có nhiều điểm cắt gen PML gọi điểm bcr 1, bcr 2, bcr Các protein sản phẩm điểm cắt khác độ dài phần gen bị cắt khác [19] Có thể việc xác định gen RAR/PML lúc cho kết dơng tính thể M3 77 KÕT LN Qua nghiªn cøu øng dơng kü thuật PCR FISH để phát bất thờng gen Hemophilia A số thể lơ xê mi cho thÊy : §èi víi Hemophilia A : 1.1 Tỉ lệ dị hợp tử thực tế RFLPs với Bcl I ë ng−êi ViƯt Nam lµ 0.48 vµ tØ lệ dị hợp tử lí thuyết 0.45 1.2 quần thể ngời Việt Nam, tần suất alen dơng với BclI 0.66, tần suất alen âm với BclI 0.34 1.3 Phát ngời lành mang gen bệnh gia đình bệnh nhân Hemophilia A ngời gái huyết thống bệnh nhân mà không mang gen bệnh hemophilia A 1.4 Tần số alen dơng với RFLPs với Hind III 0.26, tần số alen âm 0.74 1.5 Có thể ứng dụng quy trình phát ngời mang gen bệnh hemophilia dựa phân tích đa hình ADN: (1)Xác định ngời mẹ mang gen, (xác định mẹ dị hợp tử đoạn ADN phân tích, (3) Phân tích ADN bệnh nhân, bố bệnh nhân ngời nghi mang gen để tìm ngời phụ nữ mang gen bệnh Trong bệnh lơ xê mi hạt kinh : 2.1 Cã thĨ sư dơng qui tr×nh xÐt nghiệm RT PCR, Nested PCR để phát gen BCR/ABL 2.2 Phát 80% bệnh nhân lơ xê mi hạt kinh có mang gen BCR/AML, 93,33% bệnh nhân có điểm cắt gen BCR ABL b3/a2 2.3 Cã thĨ sư dơng kü tht FISH ph¸t hiƯn gen BCR/ABL tiêu nhân tế bào gian kỳ, nhiễm sắc thể kỳ Bớc đầu phát 8/10 bệnh nhân có gen BCR/ABL Đối với lơ xê mi cấp thể M2 M3 : Bớc đầu sử dụng kỹ thuật RT PCR đà phát 9/31 (29%) bệnh nhân M2 có gen ETO/AML phát bƯnh nh©n cã gen RAR/PML bƯnh nh©n đợc xét nghiệm 78 TàI LIệU THAM KHảO Nguyễn Công Khanh (2004), Suy tủy xơng, Huyết học lâm sàng nhi khoa, Nhà xuất Y học, tr 165-194 Lê Đình Lơng, Phạn Cự Nhân, (2001) Cơ sở Di truyền học, Nhà xuất Giáo dục, tr 141 Nguyễn Hạnh Phúc Xác định đột biến gen vùng intron 18 bÖnh hemophilia A b»ng kÜ thuËt BclI – RFLP”, Y häc thùc hµnh (502) sè 1/2005, tr 5-7 Cung Thị Tý cộng (1997), Tình hình bệnh hemophilia số địa phơng miền bắc Việt Nam, Đề tài cấp đà nghiệm thu Phạm Quang Vinh (2003), Nghiên cứu bất thờng NST thể bệnh lơ xê mi cấp ngời lớn Viện Hut häc Trun m¸u”, Ln ¸n TiÕn sÜ Y häc Anderson J E., Gilliand D G., List A F., et all (1998), “Myelodysplastic Syndrome”, Hematology, Ammgen, pp 296312 Appelbaum F R., Gilliand D G., Tallman M S (1998), “The Biology and treatenzymt of Acute Myeloid Leukemia”, Hematology, Amgen, pp 15-40 Barch Mj (1997), “ The ACT Cytogenetic Laboratory Manual”, 3th ed., New York, Raven press 91-105 Bernheim A (1989), “CytogÐnÐtique des leucÐmie aigues”, In LeucÐmies aiguÐs, Edit by Zittoon R et Varet B, Doin Ðditeur, Paris, 77-98 10 Blancato J K., (1999), “Fluorescence in situ hybridization in the principles of clinical cytogenetics edited by Gersen S., Keagle M B.”, Humana Press, New Jersey, pp 443-472 79 11 Block A M W (1999), “Cancer cytogenetics”, In the principles of clinical Cytogenetics, Edited by Gersen S L., Keagle M B., New Jersey, pp 345-420 12 Coleman M., Bell J., Skeet R (1983), “Leukemia Incidence in Electrical Workers”, The Lancet, April, 30, pp 982-983 13 Colins F S., Trent J M., (1995), “Cancer genetics”, Harrison InteARRN1 Medecine, pp 512-520 14 Dipika Mohanty, “Carrier detection and prenatal diagnosis in Haemophilia families in developing countries”, Comprehenshive haemophilia care in developing countries, World Federation os Hemophilia, 2001, 138 – 147 15 Downing J R., Head R D., Curcio-Brint A M., (1993), “An AML 1/ETO fusion transcript is consistently detected by RNA based polymerase chain fraction in acute myelogenous leukemia containing the (8;21) (q22;q22) transcription”, Blood, 11, pp 2860-2865 16 Dudin G., Nasr A., Traboulsi E., et all (1984), “Leucemie Lymphoide Chronique”, Edid by B Dreyfus in Hematologie, Flamarion, pp 541-554 17 Fruchtman S M., Prchal J T., Schafer A L., (1998), “Myeloproliferative Disorders”, Hematology, Amgen, pp 215232 18 Glader B E., Gvinan E., Lipton J M., Boxer L (1998), “Congenital Bone Marrow Failure Syndrome Diagnostic and Therapertic Strategies”, Hematology, Amgen, 384 19 Grignani F., Fagioli M., Alcalay M ((1994), “Molecular Pathogenesis of acute Promyelocytic Leukemia”, Hemopoietic Growth factor oncogenes and cytikines in Clinical Hematology, Edit by Catania, Deisseroth, Kager, pp 148-159 20 Hampson L., Dexter T M., Hampson I N (1996), “The Biology of haematopoiesis”, Hematology, Singapore, pp 399-404 80 21 Harris N L., Jaffe E S., Vardiman J W (2001), WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues in pathology and Genetics of tumours of Haematopoietic and lymphoid tissues, Edited by Elaine S Jaffe, Nancy Lee Harris, Lyon, pp 12-16 22 Harold R Roberts, Maureane Hoffman, “Hemophilia A and related conditions – inherited deficiencies of prothrombin (factor II), factor V and factor VII to XII”, Williams Hematiology, 5th, 1995, 1413 - 1439 23 Heim S., Mitelman F (1987), “Chronic Myeloid Leukemia”, In Cancer Cytogenetics, Edit by Heim S., New York, pp 41-64 24 Hira H (1999), “Signal Transduction and Leukemias”, Hematology, Bangkok, Thailan, October, pp 77-84 25 Hoffbrand A V., Pettit J E (1993), “Haematological Malignancies : General Aspect”, In Essential Haematology Edited by Hoffbrand A V., Pettit J E., Oxford, pp 186-207 26 Jayandharan G, Shaji RV, George B, Chandy M, Srivastava A “Informativeness of linkage analysis for genetic diagnosis of haemophilia A in India”.Haemophilia 2004 Sep;10(5):553-9 27 Kaplan J C., Delpech M (1989), “ADN et Cancer”, In Biologie moleculaire medeeine Flamarion, pp 443-499 28 Kersey J H., Wang D., and Oberto M (1998), “Resiatance of t(4;11)(MLL-AF4 fusion gene) Leukemias to stress - induced cell death : Possible mechanism for extensive extramedullary accumulation of cells and poor pronosis”, Leukemia, 12, pp 1561-1564 29 Khouri I., Deisseroth A B., (1994), “Advance in the Biology and Treatment of Chronic Myelogenous Leukemia”, Hemopoietic Growth factors oncogenes and cytokines in clinical Hematology, Edit by Catania, Deisseroth Kager, pp 160-177 81 30 Kingston H M (1994), “Geneties of cancer”, In ABC of clinical geneties, edited by Kingston H M BMJ Publishing 1994 , London, pp 36-41 31 Kozu T., Miyoshi H., Shimizu, (1993), “Junctions of the AML 1/MTG (ETO) fusion are constant in t(8;21) acute myeloid leukemia detected by RT PCR”, Blood, 4, pp.1270-1276 32 Larson R A., Stock W., Hoelzer D F., et all (1998), “Acute Lymphoblastic Leukemia in adults”, Hematology 1998, Amgen, pp 44-59 33 Le Beau M M., Rowley J D., (1995), “Cytogenetics” in William’s Hematology, Edit by Bentler E., Lichman M., Coller B.S., Mc Graw - Hill, Inc., pp 98-107 34 Levine A J (1995), “Principles of cell regulation”, Williams Hematology, Mc Graw - Hill, pp 107-113 35 Lichtman M A (1995), “Acute Myelogenous Leukemia”, Williams Hematology, Mc Graw, Hill, pp 273-288 36 Lichtman M A (1995), “Classification and clinical manifestations of the hemopoietic stem cell disorders”, Williams Hematology, Mc Graw-Hill, pp 229-236 37 Lo CoCo F., Diverio D., (1999), “Genetics diagnosis and molecular monitoring in the management of acute promyelocytic leukemia”, Blood, 1, pp 12-22 38 Mahasandana C, Pung-Amritt P, Treesucon A, Petrarat S, Veerakul G, Visudhiphan S, Yenchitsomanus PT “Carrier detection by DNA linkage analysis in eighty Thai hemophilia A families” J Med Assoc Thai 2002 Aug;85 Suppl 2:S513-21 39 Mantzourani M., Viniou N., (1996), “Pronostic Significance of the type of BCR-ABL transcript in chronic myelogenous leukemia”, British Journal of Haematology, 93, 70 82 40 Marschalek R., Greil J., et all (1995), “Molecular analysis of the chromosomal breakpointand fusion trascripts in the acute lymphoblastic SEM cell line with chromosomal translocation t(4;11)”, Br J Haematol 90, pp 308-320 41 Marukawa O., Akao Y., Inazawa J., et all (1996), “Molecular cloning of the breakpoint of t(11;22)(q23;q11) chromosome translocation in an adult acute mylomonocytic leukemia”, Br J Haematol 92, pp 687-691 42 M Mitchell, S Keeney, A Goodeve, “The molecular analysis of haemophilia A: a guideline from the UK haemophilia centre doctors’ organization haemophilia genetics laboratory network”, Haemophilia (2005), 11, 387 – 397 43 Naeim F (1997), “Pathology of Bone marrow”, Williams & Wilkins, pp 116-124; 140-156 44 J Padre, M Abiera, F Hernamdez, “Phenotypic analysis using ratio of FVIII:C and vWF:Ag among hemophilia A obligate carrier”, Haemophilia (2004), 10 , (Suppl 3), 45 Palumbo G A., Caccioda E., Guglielmo P et all (1994), “Relationship between Grouth Factors, oncogenes and cytokines in the mechanism of aberrant Hematopoiesis”, In Hemopoicetic Grouth Factors, Oneogenes and cytokine in Clinical Hematology, Edited by Caccioda E., Deisseroth C A.B., Ginstolisi R., Karger, pp 1-21 46 Plas D C., Hermans A B C., Soekarman D (1989), “Cytogenetic and Molecular Analysis in Philadelphia negative CML”, Blood 73, pp 1038-1044 47 Rai K R., Kipps T J., Dalla - Favera R., Montserrat E (1998), “Chromic Lymphocytic Leukemia”, Hematology 1998, Amgen, pp 313-315 48 Rolf Ljung, “Hemophilia carrier detection and fetal diagnosis”, Hemophilia, Inga Marie Nilsson, 1994, 20-25 83 49 Sasanakul W, Chuansumrit A, Rurgkhum S, Udomsubpakul U, Hathirat P, “DNA extraction and amplification of 10 – day, room temperature blood samples”, J Med Assoc thai 1999; 82 (suppl 1): S 186-9 50 Sawada A, Sumita C, Higasa S, Ueda M, Suehiro A, Kakishita E “Suitability of four polymorphic DNA markers for indirect genetic diagnosis of haemophilia A in Japanese subject” Thromb Res 2002 Feb 1;105(3):271-6 51 Sec Kinger P., Dayer J M., (1987), Interleukin - inhibitors , Ann Inst Pasteur Immunol, 138, pp 486-488 52 Shapiro D N (1996), “Molecular pathogenesis”, In texbook of pediatrics, edited by Nelson W E., Behrman R E., Kliegman R M., Arvin A M.: R J 45-N4, W B Sauders, pp 1444-1447 53 Shumacher H R., (1997), “Cytogenetics”, In acute leukemia, Edit by Shumacher H R., William & Wilkins, pp 83-106 54 Slingerland J M., Minden M D., Benchimol S (1991), “Mutation of the p53 gene in Human Acute Myelogenous Leukemia”, Blood, Vol 77, pp 1500-1507 55 Soignet S L., Frankel S R., Doner D., (2001), “United States Multicenter Study of Arsenic Trioxide in Relapsed Acute Promyelocytic Leukemia”, Journal of Clinical Oncology, Vol 19, No 18, pp 3852-3860 56 Sokol L., Luhoyy M., Guan Y., et all (1995), “Primary Familial Polycythemia : A Frameshift Mutation in the Erythropoietin Reception Gene and Increased Sensitivity of Erythroid Progenitors to Erythropoietin”, Blood, Vol 86, No1 (July I), pp 15-22 57 Sugimoto K., Toyoshima H., Sakai R., et all (1992), “Frequent Mutations in the p53 Gene in Human Myeloid Leukemia cell Lines”, Blood, Vol 79, No9 (May 1), pp 2378-2383 84 58 S T Raza, N Husain, A Kumar, S P D Wivedi, A Avnish, A D Wivedi, N Shukla, “Intron 18 and 19 polymorphisms in the north Indian hemophilia A families”, Haemophilia (2004), vol 10, suppl 3, 59 T Ruchutrakool, K prayongratana, Y Nakkinkun, S Issaragrilsil, “Use of FVIII:C and vWF:Ag ratio in the detection of Hemophilia A carriers”, Hemophilia (2006), 12, (Suppl.2), 11 60 Varet B (1989), “Leucemies aigues Modells experienzymtaux”, Edi by Zittoun R et Varet B in Leucemies aigues Doin editeur Paris, pp 3-19 61 Verma R S., Babn A., (1994), “Tissues culture techniques and chrosome preparation”, in Human chronosomes - principles and techniques, edited by Verma R S and Babn A., Mc Graw - Hill, pp 6-63 62 Wang A Y., Sun Gl L., Shen Z X., et all (1996), “Differentiation Therapy in acute promyelocytic leukemia”, Hematology, Singapore, pp 285-289 63 World Federation of Hemophilia, “Hemophilia: Facts for health care professionals”,1996, 4-5 64 Yadegary H., M Ohadi, Y Shafeghati, H Najmabadi, “Combinend analysis of factor VIII gene intragenic marker for carrier detection and prenatal diagnosis of haemophilia A in Iran”, Haemophilia (2004), 10, (Suppl.3), 65 Yamamoto S., Zaitsu M., Jshii E., et all (1988), “High frequency of fusion transcripts of exon 11 and exon 4/5 in AF-4 gene is observed in cord blood, as well as leukemia cells from infant leukemia patients with t(4;11)(q21;q23)” 66 Young B D (1999), “TheMolecular Analysis of 11q23 Abnormalities in Leukemia”, Hematology Bangkok, Thailand, pp 369-380 85