Đột biến điểm trên gen yếu tố viii gây bệnh hemophilia a

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRỊNH TUYẾT HUỆ ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN YẾU TỐ VIII GÂY BỆNH HEMOPHILIA A LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRỊNH TUYẾT HUỆ ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN GEN YẾU TỐ VIII GÂY BỆNH HEMOPHILIA A Chuyên ngành: XÉT NGHIỆM Y HỌC Mã số đào tạo: 60 72 03 33 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS.BS TRẦN THIỆN TRUNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2016 i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A1,A2,A3,B,C1,C2 Các vùng yếu tố VIII bp Base pair CDC The Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm soát phòng chống bệnh dịch) CSGE Conformation Sensitive Gel Electrophoresis DNA Deoxyribonucleic acid DHPLC Denaturing High Performance Liquid Chromatography FVIII Yếu tố VIII HAMSTERS Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site (Trang quản lý thông tin bệnh Hemophilia A nước Anh) NTG Người tham gia Int1 Intron Int22 Intron 22 I-PCR Inversion PCR LD-PCR Long distance PCR MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylene glycol RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction vWF Yếu tố Von Willebrand ii MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đông máu rối loạn đông máu 1.1.1 Khái niệm đông máu 1.1.2 Các yếu tố tham gia vào hoạt hóa đơng máu 1.2 Hemophilia 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh 1.2.2 Khái niệm 1.2.3 Lâm sàng 1.2.4 Kiểm soát chảy máu 1.2.5 Các thuốc hỗ trợ điều trị 1.2.6 Chăm sóc bệnh nhân 1.2.7 Chăm sóc miệng: 10 1.3 Di truyền học tỷ lệ mắc bệnh Hemophilia A 10 1.4 Gen FVIII đột biến Gen FVIII 12 1.5 Bệnh học phân tử bệnh hemophilia A 14 iii 1.5.1 Bệnh học phân tử hemophilia A thể nặng 14 1.5.2 Bệnh học phân tử hemophilia A thể vừa nhẹ 15 1.6 Các phương pháp sinh học phân tử xác định đột biến gen yếu tố VIII 15 1.6.1 Phương pháp phát đột biến đảo đoạn intron 16 1.6.2 Phương pháp phát dạng đột biến khác 18 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Thiết kế nghiên cứu 23 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 23 2.3 Đối tượng nghiên cứu 23 2.4 Các kỹ thuật xét nghiệm xác định đột biến điểm: 24 2.4.1 Phản ứng PCR khuyết đại Gen FVIII 24 2.5 Điều kiện sở vật chất 27 Chƣơng KẾT QUẢ 30 3.1 Mô tả đặc điểm bệnh nhân Hemophilia A 30 3.2 Kết giải trình tự gen FVIII tìm đột biến gây bệnh Hemophilia A 36 CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN 58 4.1 Mô tả hình thái bệnh nhân 58 iv 4.2 Tỷ lệ đột biến điểm thể bệnh 59 4.3 Các đột biến điểm chưa công bố 60 4.4 Vị trí đột biến điểm Gen FVIII VN 60 4.5 Tỷ lệ đột biến xác exon intron: 61 4.6 Tỷ lệ đột biến vùng mã hóa: 63 KẾT QUẢ 65 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO a v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Mô tả phân bố tỷ lệ đột biến theo thể bệnh (n=26) 31 Bảng 3.2 Mơ tả vị trí đột biến 33 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân loại theo thể bệnh 30 Biểu đồ 3.2 Mô tả tỷ lệ dạng đột biến điểm theo thể bệnh (n=23) 32 Biểu đồ 3.3 Mô tả vùng đột biến theo thể bệnh 34 Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ vị trí đột biến gen phân loại theo thể bệnh 35 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế hình thành đơng máu nội sinh ngoại sinh [1] Hình 1.2 Bản đồ mô tả tỷ lệ Hemophilia/ 1000 trẻ sơ sinh giới 11 Hình 1.3 Vị trí tổng hợp gen FVIII 12 Hình 1.4 Cấu trúc gen protein FVIII 12 Hình 3.1 Kết phân tích gen FVIII bệnh nhân Hem01 36 Hình 3.2 Kết phân tích gen FVIII bệnh nhân Hem03 37 Hình 3.3 Kết phân tích gen FVIII bệnh nhân Hem04 38 Hình 3.4 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem10 39 Hình 3.5 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem15 40 Hình 3.6 Kết phân tích nguy gây bệnh đột biến c.6545G>A phần mềm Polyphene-2 40 Hình 3.7 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem16 41 Hình 3.8 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem21 42 Hình 3.9 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem23 43 Hình 3.10 Kết phân tích gen FVIII bệnh nhân Hem25 44 Hình 3.11 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem27 45 Hình 3.12 Kết phân tích nguy gây bệnh đột biến c.1141delG 45 vii Hình 3.13 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem30 46 Hình 3.14 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem34 47 Hình 3.15 Kết phân tích nguy gây bệnh đột biến c.4512gelG phần mềm Polyphene-2 47 Hình 3.16 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem35 48 Hình 3.17 Kết phân tích nguy gây bệnh đột biến c.266G>A phần mềm Polyphene-2 48 Hình 3.18 Kết giải trình tƣ gen FVIII bệnh nhân Hem39 49 Hình 3.19 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem40 50 Hình 3.20 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem46 51 Hình 3.21 Kết phân tích nguy gây bệnh đột biến c.1891A>G phần mềm Polyphene-2 511 Hình 3.22 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem50 52 Hình 3.23 Kết phân tích gen FVIII bệnh nhân Hem12 53 Hình 3.25 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem42 55 Hình 3.26 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem43 56 Hình 3.27 Kết giải trình tự gen FVIII bệnh nhân Hem 37, Hem49 57 viii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “ Đột biến điểm gen yếu tố VIII gây bệnh Hemophilia A” đề tài nghiên cứu thân thực Các tài liệu trích dẫn, số liệu đề cương hoàn toàn trung thực tuân theo yêu cầu đề cương nghiên cứu Đề cương chưa cơng bố cơng trình khác TP HCM, ngày 15 tháng 11 năm 2016 Tác giả TRỊNH TUYẾT HUỆ 61 tương đồng đáng kể với chuỗi khác, 20% amino acid ởvùng C tương đồng với lectin discoidin Ba vùng nhỏ (a1, a2 a3) nằm vùng tương ứng với A1-A2, A2-B B-A3 Ngồi ra, cịn có ion ràng buộc như: Cu2+, Ca2+, Mn2+ vị trí glycosyl hóa quan sát thấy cấu trúc protein FVIII Ion Cu2+ đóng vai trị quan trọng q trình liên kết, ràng buộc vùng A1 vùng A3, ion có chức quan trọng nhận dạng xác định vị trí xếp vùng sau vùng B bị loại bỏ trình hồn thiện protein FVIII Các ion Ca2+, Mn2+ biết đến yếu tố chuyển tiếp vùng có chức gắn kết với đồng yếu tố khác q trình đơng máu, tăng khả linh động phân tử protein 4.5 Tỷ lệ đột biến exon intron Các nghiên cứu trước cho thấy khơng có điểm nóng phân bố đột biến gen FVIII[8],[31] Do đó, tất 26 exon vị trí nối exon- intron phân tích bao phủ phương pháp giải trình tự Một trình tự mồi sử dụng phổ biến David cộng thiết kế năm 1999[34] Những mồi chứa khoảng 10-15 nucleotide intron phía đầu cuối exon Chúng tơi áp dụng phân tích giải trình tự trực tiếp DNA cho sản phẩm PCR sử dụng tham chiếu trình tự gen FVIII Genebank 92 Exon 14 exon mã hóa cho vùng B có kích thước lớn từ axit amin741 đến 1648 khơng có tương đồng với gen mã hóa trước đây[20] Vùng B không cần cho chức FVIII sau trình dịch mã, vùng B bị cắt khỏi chuỗi nặng FVIII Sự bỏ vùng B tạo gen FVIII với đầy đủ chức 62 Tỷ lệ phát đột biến exon 14 nghiên cứu cao chiếm tỷ lệ 50% Đột biến exon 14 có tần suất xảy cao exon cịn lại kích thước lớn nhiều lần, với kích thước khoảng 3,1 Kb (từ 3106 đến 7227bp) thân exon 14 chiếm khoảng 43% vùng mã hóa protein FVIII Tỷ lệ cao với báo cáo nghiên cứu Đài Loan đột biến exon 14 21,9%, nghiên cứu Italia tỷ lệ 33% [43], nghiên cứu giải trình tự gen Việt Nam cho kết khoảng 25%[2] Tuy nhiên nghiên cứu lấy tỷ lệ đột biến loại đột biến đảo đoạn intron 22 1, tỷ lệ xuất đột biến điểm exon 14 tương đồng với nghiên cứu Điều chứng tỏ đột biến vùng B quan trọng đến chức hoạt động FVIII không tham gia vào cấu trúc protein FVIII hoàn thiện Theo số nghiên cứu, với tỷ lệ đột biến cao hay gặp exon 14 nên khuyến cáo sau xác định khơng có đột biến đảo đoạn intron 22 intron giải trình tự exon 14 để sàng lọc tìm vị trí có khả gây đột biến [9],[46] Còn theo tác giả David tỷ lệ đột biến vị trí c.3637insA nằm exon 14 chiếm tỷ lệ cao nên giải trình tự sớm, trước tìm vị trí đột biến exon khác [50] Các đột biến sai nghĩa exon 14 thông thường gây thể bệnh nhẹ Tuy nhiên nghiên cứu trường hợp sai nghĩa exon 14 có gây thể hình trung bình bệnh nhẹ, đột biến gây thể bệnh nhẹnày mô tả nghiên cứu trước Trung Quốc[30] Chúng tơi cịn thấy đột biến thêm nucleotid xuất nhiều exon 14 (gần 50%) Đây xem exon dài để mã hóa cho cho gen FVIII, dẫn đến tần suất xảy đột biến nhiều 63 vị trí khác Ngồi dạng đột biến thêm nucleotid thường làm lệch khung dịch mã đa phần gây thể bệnh nặng cho bệnh nhân Trong nghiên cứu exon lại có tỷ lệ đột biến tương đương Một số vị trí chưa tìm đột biến hạn chế từ cỡ mẫu làm nghiên cứu Sau thực loại trừ đột biến đảo đoạn intron 22 1, nghiên cứu chọn 26 bệnh nhân tỷ lệ BN thể nặng chiếm tỷ lệ cao 4.6 Tỷ lệ đột biến vùng mã hóa Theo đột biến cơng bố HAMSTERS, tổng số đột biến nằm vùng A nửa số đột biến điểm gen FVIII nằm chủ yếu vùng A1và A2, điều chứng tỏ tầm quan trọng vùng hoạt động protein FVIII khu vực dễ bị đột biến Hơn nữa, đột biến khu vực phần động trình FVIII tương tác với yếu tố khác, dẫn đến ổn định yếu tố kích hoạt FVIII Trong nghiên cứu gần 50% đột biến điểm xuất vùng A (A1, A2 A3) Trong có 48% đột biến vùng A đột biến thay nucleotid gây đột biến sai nghĩa hầu hết gây thể bệnh nặng Khác với nghiên cứu trước đột biến điểm cho thấy đột biến vùng A thường gây thể bệnh nhẹ[2], số đột biến tiêu biểu nghiên cứu gây thể hình nặng bao gồm: thay đổi acid amin codon 381 vùng a1 từ axit aspartic thành methionine, đồng thời làm lệch khung dịch mã Đột biến phân tích nguy phần mềm Polyphene-2 cho số điểm nguy 0,98, số điểm gần 1,0 chứng tỏ đột biến có khả gây bệnh cao Tại vị trí c.266 exon mã hóa cho vùng A1 gen FVIII, nucleotide G bị thay A làm thay đổi ba GGT mã hóa cho acid amin kích thước nhỏ, kỵ nước, khơng tích điện Glycine codon 89 thành GAT mã hóa cho acid amin kích thước 64 trung bình, ưa nước, tích điện âm Aspartic acit Sự thay đổi làm thay đổi tính chất liên kết hình thành acid amin cấu trúc FVIII, gây bệnh thể nặng Trong nghiên cứu trường hợp đột biến làm xuất mã kết thúc vùng A1 A2 vị trí c.2025 c.4027 gây thể hình nặng ảnh hưởng đến cấu trúc chức gen FVIII Đột biến suất vùng Bxảy với tần suất tương đối cao vùng chuyển tiếp mã hóa exon 14 exon có tần suất xảy đột biến nhiều Các đột biến sai nghĩa vùng B xảy vị trí nối vị trí tách thrombin gàng buộc với vùng gần thường gây bệnh Hemophilia A Đột biến tạo mã kết thúc vùng B, dẫn đến việc chấm dứt sớm trình dịch mã protein, ln ln ảnh hưởng đến tồn protein FVIII gây bệnh Hemophilia A [27] Tuy nhiên nghiên cứu đột biến vùng B chủ yếu đột biến thêm Nucleotid Vì khác với nghiên cứu trước Việt Nam, hầu hết trường hợp đột biến điểm vùng B nghiên cứu gây thể bệnh nặng Vùng C thuộc chuỗi nhẹ gen FVIII, vùng xảy nhiều đột biến phổbiến đảo đoạn intron 22, chiếm từ 38-45% đột biến gây Hemophilia A thường thể nặng[8],[9],[22] Các nghiên cứu trước cho thấy đột biến sai nghĩa xuất vùng C thường gây bệnh thể trung bình nhẹ Tuy nhiên số trường hợp đột biến xảy bệnh nhân Hem23 c.6545G>A exon 23, mã hóa cho vùng C1 Đột biến thay đổi ba CGC thành CAC thay acid amin khơng vịng Arginin codon 2182 Histidin có cấu trúc vòng Đột biến xảy làm ảnh hưởng đến việc gắn kết yếu tố đông máu 65 KẾT LUẬN Nghiên cứu thực 26 bệnh nhân bệnh viện Đại học Y Dược TP.HCM, bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Trung tâm Y Sinh học Phân tử- Đại học Y Dược TP.HCM có kết đạt sau: - Tỷ lệ phát đột biến 88,5% (23/26 bệnh nhân), tỷ lệ phát đột biến thể nặng 100%, thể trung bình 66,7% thể nhẹ 66,7% - Các dạng đột biến phát bao gồm: đột biến sai nghĩa 34,6% (9/26), đột biến nucleotid 11,5%(3/26), đột biến vô nghĩa 7,7%(2/26), đột biến thêm nucleotid 23%(6/26), đột biến vị trí nối exon-intron 3,8%(1/26), đột biến đoạn lớn 7,7%(2/26) - Phát đột biến chưa công bố: đột biến thay nucleotide T thành A vị trí c.2025 thay đổi ba TAT mã hóa cho Tyrosine thành ba kết thúc TAAtại exon 13 đột biến điểm sai nghĩa c.4450A>G làm codon AGT bị thay đổi thành GGTtại exon 14 - Tỷ lệ phát đột biến exon 14 nghiên cứu thường gặp chiếm tỷ lệ52,2% - Các exon 3, 7, 8, 12, 13, 22, 23 gặp với tỷ lệ thấp từ 4,3% - 13% - Chưa phát đột biến exon lại - Tần suất xảy đột biến vùng A phổ biến với tỷ lệ xảy đột biến vùng gần 50%, tần suất xảy đột biến vùng B 34,6% vùng C không đáng kể 66 KIẾN NGHỊ - Căn kết đột biến điểm, xây dựng đồ vị trí đột biến cho bệnh nhân Hemophilia A Việt Nam - Sàng lọc trường hợp nữ lành mang bệnh cho gia đình bệnh nhân Hemophilia A tư vấn di truyền - Ưu tiên giải trình tự gen FVIII phát đột biến sai nghĩa vị trí exon 14 vùng B trường hợp loại trừ đột biến đảo đoạn intron 22 intron - Triển khai nghiên cứu phát đôt biến điểm với cỡ mẫu lớn đặc biệt nhóm thể trung bình nhẹ a TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nƣớc Nguyễn Tấn Bỉnh(2015), "Bài Giảng Huyết Học Lâm Sàng", Nhà Xuất Bản Y Học Hồ Chí Minh, pp 258 Lưu Vũ Dũng (2014), "Nghiên cứu xác định đột biên Gen F8 gây bệnh Hemophilia A.", Đại Học Y Hà Nội Nguyễn Thị Mai Lan, Ngô Thụy Minh Nhi, Vũ Đỗ Uyên Vy (2012), "Đặc điểm bệnh nhân Hemophilia bệnh viện nhi đồng từ 1/2009 đến tháng 12/2011", Tạp Chí Y Học TP HCM, 16 (4) Huỳnh Nghĩa, Nguyễn Thị Băng Sương, Nghiên Cứu Phát Hiện Đột Biến Yếu Tố FVIII Gây Bệnh Hemophilia A Phát Hiện Ngƣời Lành Mang Bệnh, 1, Editor 2015, Đại Học Y Dược TPHCM Đỗ Trung Phấn (2006), "Bài Giảng Huyết Học Truyền Máu Sau Đại Học", Nhà Xuất Bản Y Học Ha Noi, pp 401 Đỗ Trung Phấn, cộng sự, Chăm sóc bệnh nhân Hemophilia , in Hội thảo thành lập Hội Hemophilia1996, Viện Huyết học truyền máu Hà Nội.: Ha Noi Nguyễn Thị Hương Quế (2008), "Nghiên cứu tác động không mong muốn bệnh nhân Hemophilia đƣợc truyền chế phẩm máu Viện Huyết Học truyền máu Trung Ƣơng giai đoạn 2004-2008", Đại Học Y Hà Nội Tài liệu nước Acquila M, Santacroce R, Belvini D (2008), "Identification of 217 unreported mutations in the F8 gene in a group of 1,410 unselected Italian patients with hemophilia A", J Hum Genet, 53 (275-284) Antonarakis SE, Youssoufian H, Bell W, et al (1988), "Mutations in hemophilia A: estimate of the relative mutation rate at CG dinucleotides", Am J Hum Genet, 42 (5), 718-725 b 10 Arai M, Inaba H, Higuchi M, et al (1989), "Direct characterization of factor VIII in plasma: detection of a mutation altering a thrombin cleavage site (arginine-372 -histidine)", Proc Natl Acad Sci U S A, 86 (11), 4277-81 11 Bagnall R D, Green P M, Waseem N H, et al (2008), "Haemophilia A mutations in the UK: results of screening one-third of the population", Br J Haematol, 143 (1), 115-28 12 Becker J., Schwaab R., Moller-Taube A., et al (1996), "Characterization of the factor VIII defect in 147 patients with sporadic hemophilia A: family studies indicate a mutation type-dependent sex ratio of mutation frequencies", Am J Hum Genet, 58 (4), 657-70 13 Bogdanova N., Markoff A., Pollmann H., et al (2005), "Spectrum of molecular defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A", Hum Mutat, 26 (3), 249-54 14 Castaman G., Giacomelli S H., Ghiotto R., et al (2007), "Spectrum of mutations in Albanian patients with haemophilia A: identification of ten novel mutations in the factor VIII gene", Haemophilia, 13 (3), 311-6 15 CDC The Centers for Disease Control and Prevention Hemophilia A Mutation Project CHAMP F8 Mutation List 2013 16 Drayna D, Baty BJ, Leonard CO (1986), "Prenatal diagnosis of factor VIII deficiency to help with the management of pregnancy and delivery", Lancet, (207210) 17 Frusconi Sabrina, Passerini Ilaria, Girolami Francesca, et al (2002), "Identification of seven novel mutations of F8C by DHPLC", Human Mutation, 20 (3), 231-232 18 Giannelli F, Bagnall RD, Green PM (2005), "Polymorphism and hemophilia A causing inversions in distal Xq28: A complex picture", Thromb Haemost, 3, 25982599 c 19 HAMSTERS The Haemophilia A Mutation, Structure, Test and Resource Site 2008 20 Hans Hermann, Brackmann H H., Jochen Graw, et al (2005), "Heamophilia A: from mutation analysis to new therapies", Nature reviews Genetics, 6, 488-501 21 Higuchi M., Antonarakis S E., Kasch L., et al (1991), "Molecular characterization of mild-to-moderate hemophilia A: detection of the mutation in 25 of 29 patients by denaturing gradient gel electrophoresis", Proc Natl Acad Sci U S A, 88 (19), 8307-11 22 Hwang S H., Lim J A., Kim H C., et al (2011), "Identification of a shared F8 mutation in the Korean patients with acquired hemophilia A", Korean J Hematol, 46 (1), 49-51 23 Ivaskevicius V, Oldenburg J, Rost S (2001), "Evaluation of DHPLC in the analysis of hemophilia A", J Biochem Biophys Methods, 47, 39-51 24 Jayandharan G, Peyvandi F, Chandy M (2006), "Genetic diagnosis of haemophilia and other inherited bleeding disorders", Haemophilia, 12 (82-89) 25 Jr Lakich D, Kazazian HH, Antonarakis SE, et al (1993), "Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A", Nat Genet, 5, 236-241 26 Khodjet H, Elmahmoudi H, Wigren E, et al (2012), "First report of molecular diagnosis of Tunisian hemophiliacs A: identification of novel causative mutations", Diagn Pathol, 93, 1746-1753 27 Knopf JL, Toole JJ, Wozney JM, et al (1984), "Molecular cloning of a cDNA encoding human antihemophilic factor", Nature, 3, 332-342 28 Lin S W., Lin S R., Shen M C (1993), "Characterization of genetic defects of hemophilia A in patients of Chinese origin", Genomics, 18 (3), 496-504 d 29 Lindley P, Pemberton S, Zaitsev V, et al (1997), "A molecular model for the triplicated A domains of human factor VIII based on the crystal structure of human ceruloplasmin", Biochemistry, 89 (2413-2421) 30 Liu M., Murphy M E., Thompson A R (1998), "A domain mutations in 65 haemophilia A families and molecular modelling of dysfunctional factor VIII proteins", Br J Haematol, 103 (4), 1051-60 31 Markoff A, Bogdanova N, Pollmann H (2005), "Spectrum of molecular defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A", Hum Mutat, 26, 249-254 32 McKusick VA (1965), "The Royal Hemophilia", Scient Am, 213 (88-95) 33 Mittal B, Pandey GS (2001), "Molecular diagnosis of Haemophilia A.", Journal of Postgraduate Medicine, 47 (274-280) 34 Moreira I, David D, Lalloz MR, et al (1994), " Analysis of the essential sequences of the factor VIII gene in twelve haemophilia A patients by single-stranded conformation polymorphism", Blood Coagul Fibrinolysis, 14 (257-264) 35 MRC-Holland MRC-Holland MLPA homepage 2008; Available from: http://www.mlpa.com/pages/indexpag.html 36 Nozari G, Liu Q, Sommer S.S (1998), "Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of the inversion hotspot of mutation in haemophilia A", Blood, 92 (1458-1459) 37 Oelmueller U, Rainen L, Jurgensen S (2002), "Stabilization of mRNA expression in whole blood samples", Clin Chem, 48 (1883-1890) 38 Pieneman W C., Deutz-Terlouw P P., Reitsma P H., et al (1995), "Screening for mutations in haemophilia A patients by multiplex PCR-SSCP, Southern blotting and RNA analysis: the detection of a genetic abnormality in the factor VIII gene in 30 out of 35 patients", Br J Haematol, 90 (2), 442-9 e 39 Radic CP, Rossetti LC, Larripa IB, et al (2005), "Genotyping the hemophilia inversion hotspot by use of inverse PCR", Clin Chem, 51, 154-158 40 Rallapalli PM, Kemball-Cook G, EG Tuddenham., et al., Factor VIII Variant Database, 2014: Manuscript under Preparation 41 Repesse Y., Slaoui M., Ferrandiz D., et al (2007), "Factor VIII (FVIII) gene mutations in 120 patients with hemophilia A: detection of 26 novel mutations and correlation with FVIII inhibitor development", J Thromb Haemost, (7), 1469-76 42 Rodriguez H, Eaton D, Vehar GA (1996), "Proteolytic processing of human factor VIII Correlation of specific cleavages by thrombin, factor Xa, and activated protein C with activation and inactivation of factor VIII coagulant activity", Biochemistry, 25 (505-512) 43 Santacroce R., Acquila M., Belvini D., et al (2008), "Identification of 217 unreported mutations in the F8 gene in a group of 1,410 unselected Italian patients with hemophilia A", J Hum Genet, 53 (3), 275-84 44 Schroder J, Oldenburg J, Brackmann HH, et al (2004), "Environmental and genetic factors influencing inhibitor development", Semin Hematol, 41 (82-88) 45 Shaji RV, Jayandharan G, George B, et al (2004), "Informativeness of linkage analysis for genetic diagnosis of haemophilia A in India", Hemophilia, 10, 553-559 46 Shaji RV, Jayandharan G, George B, et al (2004), "Informativeness of linkage analysis for genetic diagnosis of haemophilia A in India", Haemophilia, 553-339 47 Sirocova N., Tsourea V., Vicol M., et al (2009), "Factor VIII mutations in 42 Moldovan haemophilia A families, including 12 that are novel", Haemophilia, 15 (4), 942-51 48 Skinner Mark W (2012), "WFH: Closing the global gap – achieving optimal care", Haemophilia, 18, 1-12 49 Smith MP, Laurie AD, George PM (2007), "Detection of factor VIII gene mutations by high-resolution melting analysis", Clin Chem, 53, 2211-2214 f 50 Ventura C, David D, I Moreira, et al (2006), "The spectrum of mutations and molecular pathogenesis of hemophilia A in 181 Portuguese patients", Haematologica, 91, 840-843 51 Waseem N, Bagnall RD, Green PM, et al (2002), "Recurrent invertion breaking intron of factor VIII gene is frequent cause of severe hemophilia A", Blood, 99 (168-174) 52 Williams I, Goodeve AC, Bray GL, et al (2000), "Relationship between factor VIII mutation type and inhibitor development in a cohort of previously untreated patients treated with recombinant factor VIII (Recombinate)", Recombinate PUP Study Group Thromb Haemost, 83 (844-848) 53 Wood WI, Gitschier J, Goralka TM, et al (1984), "Characterization of the human factor VIII gene", Nature, 312 (326-330) 54 World federation of Hemophilia, Annual Global Survey 2015, 1, Editor 2015 55 Yan ZY, Hua BL, Liang Y, et al (2010), "Identification of seven novel mutations in the factor VIII gene in 18 unrelated Chinese patients with hemophilia A.", Chin Med J, 123 (3), 305-310 g PHỤ LỤC Các đoạn mồi sử dụng phản ứng PCR giải trình tự gen FVIII Mồi xi F8P-1: CAT GGC TAC ATT CPC ATG TAA F8E2-1B: GCC TCC TTG CTA ATA GTA GA (n) F8E4-1: GTA CAG TGG ATA TAG AAA GGA C F4E5-1B: TAA CTG ATG AAG AAC TGT CTC (n) F8E6-1: TCC CAC TTA TTG TCA TGG AC F8E7-1: GGC AAG AGC TGT TGG TTT G F8E1-1: CCA TAT AGC CTG CAG AAC AT F8E10-1: CTA GCC TCA AAT TAC TAT AAT G F8E11-1: TGC GAC TTT AGC TTC CAC TT F812-1: TGC CAT CGC TTT CAT CAT AG F813-1C: TTC CTG GGA ATA AGA TAA TGG (n) F8E14-1: CAA GGC ATA GTA CAA CAG CA F814-3: TCC ATC AGA CAA TTT GGC AG F8E14-5: AGT AGG AAA GGG TGA ATT TAC F8E14-7: EGC AGT CAT TTC TTA CAA GGA F8E15-1: AGA TAG AGT GGT TAA CTA TGC F8E16-1: AGC ATC CAT CTT CTG TAC CA F8E19-1: GCA AGC ACT TTG CAT TTG AG F8E21-1B: CAG CTT AGA TTA ACC TTT CTC (n) F8E22-1B: TCA GGA GGT AGC ACA TAC AT (n) F8E23-1: GTC TTA TGT AGA TGT TGG ATG F8E24-1: GCT CAG TAT AAC TGA GGC TAG F8E26-1: GGT TTA ATC CTG GAC TAG TG Mồi ngƣợc F8E1-2: AGC ATC ACA ACC ATC CTA AC F8E3-2B: GAT ACG CCA CCA TTA CAA AG F8E4-2B: GAT TCA GTT GTT TGT ACT TCT C (n) F8E5-2B: CAT CTC CTT CAT TCC TGA AC (n) F8E6-2: TAC AGA ACT CTG GTG CTG AA F8E7-2: TGT CCA GTA AAT TTT ATT AAA AGT F8E9-2: AGA TAT GTC CAT TGG AGA CAA F8E10-2: ACT TTA GAC TGG AGC TTG AG F8E11-2: ACT GAC CTA TAT TGC AAA CCA F8E12-2: CAT CAT TAT CTG GAC ATC AC F8E13-2C: AGC ATA CGA ATG GCT AGT GA (n) F8E14-2: CTT GGC TAT TCA TTA AAC CTG F8E14-4: CTA CAT TTT GCC TAG TGC TC F8E14-6: AGG TCC TTC TGA TAA ATG TGA F8E14-8: GTT GAT AGG TGA GGT TGA CT F8E15-2: GTG GGA ATA CAT TAT AGT CAG F8E18-2: CTT AAG AGC ATG GAG CTT GT F8E20-2: ACT AAT AGA AGC ATG GAG ATG F8E21-2: GAG TAG ATG TAG TAC ATT TCC F8E22-2B: GTC CAA TAT CTG AAA TCT GC (n) F8E23-2: AGT CTC AGG ATA ACT AGA ACA F8E25-2: TTG CTC TGA AAA TTT GGT CAT A F8E26-2: GTG TCT GCT AGG ATT TAG CA Vùng khuếch đại Promoter and Exon 1412 bp Kích thƣớc PCR Mồi giải trình tự F8E1-2 and *F8P-2 Exon and -2850 bp F8E2-B1 and F8E3-2B Exon 319 bp F8E4-2B Exon 274 bp F8E5-1B Exon 424 bp F8E6-2 Exon 450 bp F8E7-2 Exon and 945 bp F8E8-1 and F8E9-2 Exon 10 347 bp F8E10-1 Exon 11 445 bp F8E11-2 Exon 12 320 bp F8E12-1 Exon 13 392 bp F8E13-1C 1008 bp Exon 15 349 bp F8E14-1,* F8E14-1S(n) and F8E14-2 F8E14-3,* F8E14-3S(n) and F8E14-4 F8E14-5,* F8E14-5S(n) and F8E14-6 F8E14-7,* F8E14-7S(n) and F8E14-8 F8E15-2 Exon 16 to 18 1390 bp F8E16-1,* F8E17-2 and F8E18-2 Exon 19 to 20 1056 bp F8E19-1 and F8E20-2 Exon 21 217 bp F8E21-1B Exon 22 280 bp F8E22-1B Exon 23 350 bp F8E23-2 Exon 24 and 25 1602 bp F8E24-1 and F8E25-2 Exon 26 374 bp F8E26-1 Exon 14 1043 bp 1062 bp 1089 bp h BỘ Y TẾ CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐẠI HỌC Y DƯỢC Độc lập- Tự do- Hạnh phúc THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH GIẤY XÁC NHẬN ĐÃ BỔ SUNG, SỬA CHỮA LUẬN VĂN THEO Ý KIẾN CỦA HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN THẠC SĨ - Học viên: TRỊNH TUYẾT HUỆ - Đề tài: Đột biến điểm Gen Yếu tố VIII gây bệnh Hemophilia A - Chuyên ngành: xét nghiệm y học Mã số: 60 72 03 33 - Người hướng dẫn: GS TS Trần Thiện Trung Luận văn bổ sung sửa chữa cụ thể điểm sau: Chỉnh sửa bổ sung mục lục Thêm trích dẫn tài liệu tham khảo vào hình cịn thiếu Thêm nội dung đề tài gốc giải thích cỡ mẫu ước tính Chỉnh sửa số lỗi tả lỗi đánh máu: Gen FIII> Gen FVIII, dấu “.” thành “,” Chỉnh sửa lại phần kết quả- kiến nghị, đề xuất thực với cỡ mẫu lớn Không chỉnh sửa thêm nội dung bàn luận khả không phát đột biến thể trung bình nhẹ, thêm đề xuất cho cỡ mẫu lớn bệnh nhân thể trung bình nhẹ Chỉnh sửa phần kết không hợp lý: Exon 14 bị trùng lặp tỷ lệ % Bổ sung danh mục từ viết tắt Bổ sung mã số đào tạo i Chỉnh sửa dàn ý nghiên cứu: tập trung mô tả xác định đột biến điểm, bỏ qua nghiên cứu khác tiến hành song song 10.Chỉnh sửa lời cam đoan TPHCM, ngày 15 tháng 11 năm 2016 NGƢỜI HƢỚNG DẪN HỌC VIÊN (Ký tên ghi rõ họ tên) (Ký tên ghi rõ họ tên) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG CHẤM LUẬN VĂN (Ký tên ghi rõ họ tên) ... sợi huyết Các yếu tố đông máu huyết tƣơng: mười hai yếu tố xác định kí hiệu chữ số La Mã hai yếu tố phát sau không mang chữ số La Mã bao gồm yếu tố Fletcher yếu tố Fitzgerald Yếu tố tổ chức: Sự... tử hemophilia A thể v? ?a nhẹ Đột biến điểm gây lệch khung dịch mã đột biến thay nucleotid (missense) chế gây bệnh Hemophilia A thể v? ?a nhẹ, chiếm 9095% bệnh nhân[9],[11],[12] Đột biến vị trí nối... d? ?a thiếu hụt yếu tố đông máu bao gồm Hemophilia A, B C Trong chủ yếu bệnh nhân phát Hemophilia A với chiếm 80% bệnh nhân chẩn đoán, tỷ lệ bệnh Hemophilia A năm 2012 105/1 triệu dân tỷ lệ Hemophilia