• Xét nghiệm được thực hiện để xác định đột biến cụ thể • Chỉ định làm PGD. Với các rối loạn đơn gen đã biết[r]
(1)CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN KHÁC NHAU TRONG XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN TIỀN CẤY PHÔI
Giám đốc phòng xét nghiệm/ Tổng giám đốc Double Hong, Ph.D
Sofiva Genomics
(2)Nội dung
Xét nghiệm di truyền tiền cấy phôi
(PGT)
Thụ tinh ống nghiệm(IVF) Sàng lọc di truyền tiền cấy phơi (PGS)
Chẩn đốn di truyền tiền cấy phôi (PGD)
Phương pháp (PCR, FISH, CGH, SNP, NGS)
Thảo luận
(3)http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-6-human-physiology/66-hormones-homeostasis-and/in-vitro-fertilisation.html
Quy trình thụ tinh ống nghiệm (IVF)
Quy trình
1、Giai đoạn kích thích 2、Thu hồi trứng
3、Thu thập tinh trùng
4、Thụ tinh ống nghiệm (IVF) 5、Phơi chuyển hóa
6、Cấy phôi
(4)Thụ tinh ống nghiệm (IVF) + Xét nghiệm di truyền
Xét nghiệm di truyền trước cấy: xét nghiệm di truyền tiền cấy phơi (PGT)
1、Giai đoạn kích thích 2、Thu hồi trứng
3、Thu thập tinh trùng
4、Thụ tinh ống nghiệm (IVF) (Xét nghiệm di truyền)
5、Phôi chuyển hóa 6、Cấy phơi
Quy trình
(5)Blastocyst(Trophectoderm biopsy)
Polar body Blastomere
1 cell
ICM TE
8-10 cells
Quy trình sinh thiết
Polar body Blastomere Blastocyst
Ưu điểm • Khơng xâm lấn
• Phát lỗi mẹ bố • Quá trình sinh thiết thực
hiện tốt
• Khơng xâm lấn
• Phát lỗi mẹ bố • Dạng thê khảm
phát
Hạn chế
• Số lượng tế bào lớn để kiểm tra
• Chỉ phát lỗi người mẹ
• Xâm lấn
• Dạng thể khảm làm lỗi kết
• Kỹ sinh thiết
• Q trình cấy blastomere
(6)Hai phương pháp xét nghiệm di truyền tiền cấy phôi Sàng lọc di truyền tiền cấy phôi (PGS)
• Xét nghiệm di truyền tiền cấy phơi cho số lượng nhiễm sắc thể chép bất thường nhiễm sắc thể (Viết tắt
PGT-A)
Chẩn đốn di truyền tiền cấy phơi (PGD)
• Xét nghiệm di truyền tiền cấy phôi cho rối loạn đơn (Viết
tắt PGT-M)
(7)Sàng lọc di truyền tiền cấy phơi PGS Chẩn đốn di truyền tiền cấy phôi PGD
Mục Số lượng bấtht thường nhiễm sắc
ể Rối loạn gen đơn
Công nghệ
FISH
Array-CGH NGS
Specific probe (primer) PCR
Sanger sequencing STR marker
Chỉ định
Phụ nữ lớn tuổi
Tiền sử xảy thai nhiều lần
Thất bại IVF lặp lặp lại
Hiếm muộn
Rối loạn đơn gen biết
Xác định HLA
PGS vs PGD
(8)www.sofiva.com.tw
(còn gọi sàng lọc dị bội)
PGS phát lệch bội phôi IVF
Đột biến lệch bội xuất lứa tuổi tăng theo tuổi người mẹ Nhiễm sắc thể lệch bội cho biết nguyên nhân gây thất bại IVF
Chỉ định làm PGS
Phụ nữ lớn tuối (>34 tuổi) Tiền sử sẩy thai nhiều lần Thất bại IVF lặp lặp lại Vô sinh nam nặng
Lựa chọn giới tính
(9)Nhiễm sắc thể bất thường Sinh thiết phơi
FISH
chỉ có vài nhiễm sắc thể phát đồng thời FISH
Xét nghiệm di truyền cho vùng cụ thể Trước kia……
Polar body
Single blastomere Blastocyst
(10)Sinh thiết phơi
Khuếch đại tồn bộ gen (WGA)
phương pháp lai gen có so sánh (array-CGH)
Array-based PGS NGS-based PGS
www.sofiva.com.tw 10
Phôi thai(s)
day or day
Trình tự di truyền hệ sau (NGS)
Quan sát tất 23 cặp nhiễm sắc thể
(11)Phát triển sàng lọc di truyền tiền cấy phôi, PGS
PGS
FISH Nền tàng di truyền truyền thống
(chr 13,18,21,X,Y)
Array Cơng nghệ phân tích tự động Phát 23 cặp nhiễm sắc thể
NGS
Phát 23 cặp nhiễm sắc thể Công suất cao
Dễ vận hành
(12)www.sofiva.com.tw 12
Ion Proton Sequencer - Thermo Fisher Miseq - Illumina
Ion PGM System - Thermo Fisher
(13)Chromosome 21: Gain
Chromosome 13: Loss
Phân tích liệu
Chromosome 1~22, X, Y Số
Đường xanh : sao
(14)www.sofiva.com.tw 14
Ví dụ dịch chuyển đối ứng cho PGS
Aneuploidy embryo Euploidy
embryo
Tế bào phân chia cân
Aneuploidy embryo Aneuploidy embryo Aneuploidy embryo Euploidy Embryo balanced translocation
(15)www.sofiva.com.tw 15
Kết PGS cho trường 46XY,t(5;21)(q11.2;q11.2)
(16)www.sofiva.com.tw 16
Euploidy Embryo，can transfer
Embryo transfer
(17)www.sofiva.com.tw 17
Array CGH: arr(1-22)x2, (X)x1, (Y)x1 Chromosome: 46,XY
Kết PGS cho trường hợp Tổng: 12 phôi thai
Bất thường: 10 phôi thai Bình thường: phơi thai
Embryo transfer (No 6、16)
16wks
Confirmed by AF
(18)G: Cytocell 5p telomere probe
R: Cytocell 14q telomere probe www.sofiva.com.tw (5p,14q) balanced translocation 18
FISH vs aCGH
(19)1 NGS vs aCGH : 100% độ xác
2. Độ phân giải: giống
3. Thời gian xử lý cho kỹ thuật viên: NGS dễ aCGH
NGS
NGS vs aCGH
(20)www.sofiva.com.tw 20
Chẩn đốn di truyền tiền cấy phơi, PGD PGT-M
• Một hai bố mẹ mang gen đột biến
• Xét nghiệm thực để xác định đột biến cụ thể • Chỉ định làm PGD
Với rối loạn đơn gen biết
tính trạng trội
Tính trạng gen lặn Rối loạn liên kết X
Rào cản đột biến
(21)www.sofiva.com.tw 21
Ứng dụng lâm sàng chẩn đốn di truyền tiền cấy phơi, PGD
• Lần diễn vào tháng 10 năm 1989 • Haemophilia (rối loạn liên kết X)
• Xác định giới tính
Female carrier
Male affected
(22)Trước kia……
Sinh thiết phôi
PCR
PGD cho vùng cụ thể
lựa chọn phơi bình thường để chuyển
rối loạn di truyền cụ thể - dị tật gen đơn defects
Rối loạn gen đơn
Gel
electrophoresis Sequencing
(23)Modified PCR-based research Optimized PGD-PCR protocols
Nested PCR Multiplex PCR Fluorescent PCR
Multiple genes Cải thiện để nhắm mục tiêu nhiều vùng
Vẫn giới hạn vùng cụ thể
(24)Sự khuếch đại toàn bộ gen (WGA)
Khuếch đại toàn bộ gen từ tế bào đơn
Phôi thai đơn
(25)Chẩn đoán trực tiếp gián tiếp
multi-loci 25
(26)Những ưu điểm STR
to monitor contamination
to monitor WGA experiment
to monitor Allele drop-out (ADO)
(27)www.sofiva.com.tw 27
Ví dụ kết PGD
Abnormal genotype
WT genotype
Direct genotyping
Abnormal embryo
Not transfer
(28)Kiểm tra trực tiếp
PCR+Sanger sequencing
ADO
(29)Kiểm tra gián tiếp Phân tích liên kết
(30)30
Kết PGD cho trường hợp Tổng : 11 phôi thai
Major: embryo
Wild Type : embryos Carrier: embryos
No signal : embryo
Embryo transfer Father AF Mother pregnancy 16wks
(31)www.sofiva.com.tw 31
Trường hợp lâm sàng Đài Loan – Mất thính lục
www.sofiva.com.tw
(32)HLA typing
HBB
genotyping Trường hợp lâm sàng
– Xác định HLA beta thalassemia
(33)PGD cho rối loạn gen đơn phịng thí nghiệm Sofiva
(34)Genome-wide karyomapping for PGD
Scientific Reports volume6, Article number: 25488 (2016)
SNP-array based
haplotype analysis
(35)PGD truyền thống SNP-based PGD
Công nghệ
Specific probe (primer) PCR
Sanger sequencing STR marker
SNP array
Vùng đột biến Cần phải biết trước Không cần biết trước
Coverage Specific gene / locus Any sites coverage by SNP probes
Bất lợi Mất thời gian để thiết kế đầu dò
Thiết kế riêng biệt nhiều loci
~ 90 độ xác
Tỷ lệ sai ~ 10% tùy thuộc vào bệnh khác PGD truyền thống vs SNP-based PGD
(36)www.sofiva.com.tw 36